СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУППЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ, ПОРАЖЕННЫХ ПАТОЛОГИЧЕСКИМИ ПРОЦЕССАМИ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/80 

Изобретение относится к области медицины, а именно к судебной медицине, и может быть использовано в дерматологии и генетике.

Необходимость в определении групповой принадлежности биологических объектов возникает при расследовании уголовных дел, связанных с убийствами, нанесением тяжких телесных повреждений, изнасилованием и т.д., а также в гражданских делах, связанных со спорным отцовством, материнством и заменой детей.

В настоящее время предложено много способов, позволяющих определить групповую принадлежность в любых объектах биологического происхождения (кровь, выделения, волосы, кости и др.): реакция абсорбции агглютининов в количественной модификации (КРА); реакция абсорбции-элюции (РАЭ), реакция смешанной агглютинации (РСА); реакция иммунофлюорисценции (РИФ) (Барсегянц Л.О. Судебно-медицинская экспертиза исследования вещественных доказательств. - М.: Медицина, 1999 г.). Недостатком указанных методик является либо их малая чувствительность (реакция КРА), либо их неспецифичность (реакция РСА и РАЭ), либо влияние предмета-носителя, который оказывает воздействие на сыворотки, в результате чего антигенная принадлежность не может быть установлена. Кроме того, не выявление может быть связано со слабыми свойствами самого антигена (Барсегянц Л.О. Судебно-медицинская экспертиза исследования вещественных доказательств. - М.: Медицина, 1999 г.). Например, в волосах антигены системы АВО выражены слабо и обнаружение их даже очень чувствительными реакциями, такими как РСА и РАЭ, затруднено.

Кроме того, за последние 5-10 лет начали встречаться случаи не обнаружения антигенов системы АВО даже в свежих образцах крови, выделений, волос и др. . В литературе имеются указания (Бочков Н.П. Перспективы медицинской генетики, 1982 г., стр.395-398) на то, что при патологических состояниях организма групповая принадлежность не определяется даже в образцах жидкой крови, выделений и прочих объектах. При различных заболеваниях, таких как лейкоз, туберкулез, грипп, грибковые поражения, отмечается изменение групп крови системы АВО (отсутствие агглютинации, невозможность идентификации антигенов и т.д.). Изменяется специфичность групп крови.

В качестве ближайшего аналога принят способ определения группы крови человека в биологических объектах путем проведения реакции абсорбции-элюции (Барсегянц Л.О. Судебно-медицинская экспертиза исследования вещественных доказательств. - М.: Медицина, 1999 г., стр.42). Способ заключается в том, что волосы размером 0,5 см помещают на предметные стекла и заливают двумя каплями изо- или иммунных сывороток анти-А, анти-В, анти-Н. Препараты помещают во влажные камеры и экспонируют в течение 20 часов при 4 градусах С, затем 6 раз промывают охлажденным изотоническим раствором хлорида натрия. Элюцию проводят в 0,2% взвеси трижды отмытых эритроцитов на 1% растворе альбумина. Объекты по влажных камерах устанавливают в термостат при температуре 50 градусов С на 30 минут, затем выдерживают 1,5 часа при комнатной температуре.

Однако даже такой чувствительный способ не позволяет выявить группу крови в пораженных объектах, т.к. не обладает достаточной чувствительностью и специфичностью. Кроме того, вышеописанный способ проведения реакции не позволяет инактивировать мутантную детерминанту антигена Т, что полностью препятствует выявлению антигенов системы АВО.

Задачей изобретения является создание чувствительного и специфичного способа определения группы крови человека в биологических объектах, пораженных патологическими процессами.

Сущность изобретения состоит в том, что в способе определения группы крови человека в биологических объектах, пораженных патологическими процессами, исследуемый объект предварительно помещают в 0,01% раствор трипсина на изотоническом растворе на 30 минут, затем тщательно промывают изотоническим раствором, полученные препараты помещают на два обезжиренных предметных стекла, к одному объекту добавляют две капли изосыворотки анти-А, к другому - анти-В, выдерживают 22-24 часа во влажных камерах при температуре +50^oС, после чего объекты тщательно промывают охлажденным до температуры +2 С изотоническим раствором хлорида натрия и проводят элюцию в 0,2% взвеси трипсинизированных эритроцитов на 1% альбумине, к полученным препаратам добавляют по одной капле изотонического раствора и накрывают покровными стеклами, при этом группу крови определяют микроскопически по наличию соответствующих агглютинатов.

Отличительной особенностью является то, что биологический объект помещают в раствор трипсина на 30-40 минут, а реакцию элюции проводят в 0,2% взвеси трипсинизированных эритроцитов на 1% растворе альбумина.

Способ позволяет получить следующий технический результат.

Способ является высокочувствительным и специфичным.

Способ позволяет определить групповую принадлежность в биологических объектах, пораженных патологическими процессами.

Особенно важно, что способ позволяет определить групповую принадлежность в волосах, где антигены слабее выражены, чем в других объектах биологического происхождения.

Способ позволяет выявить антигены системы АВО в волосах, пораженных грибком Microsporum canis, вне зависимости от стадии заболевания и степени поражения волос. Грибок, попав на кожу, начинает интенсивно размножаться и быстро внедряться в фолликулы волоса. Споры грибка прорастают и приводят к поражению волоса, формируя чехол и плотно окружая фолликулярный аппарат. Грибок с помощью перфоративного органа проникает в волосяную луковицу, и в результате продукции особого фермента разрушается кератин. Вместе с тем определение в таких волосах антигенов системы АВО часто бывает необходимо для идентификации лиц, проходящих по делу.

Метод прост в исполнении, не требует специальной подготовки и использования дорогостоящей аппаратуры. Он может быть использован в каждой лаборатории.

Технический результат достигается за счет того, что при обработке трипсином уничтожается фермент нейроминидаза, что способствует нейтрализации латентной детерминанты Т. При этом детерминанты системы АВО остаются неповрежденными.

Способ осуществляется следующим образом.

Биологический объект, пораженный патологическим процессом, предварительно помещают в раствор трипсина (0,01 мг трипсина растворяют в 10 мл изотонического раствора хлорида натрия) на 30 минут, затем тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия и помещают на два обезжиренных предметных стекла. К одному биологическому объекту добавляют две капли изосыворотки анти-А, к другому - две капли изосыворотки анти-В. Экспозиция составляет 22-24 часа во влажных камерах при температуре 4^oС. Спустя указанный срок объекты тщательно отмывают охлажденным до температуры +1 - +2^oС. Элюцию проводят в 0,2% взвеси трижды отмытых трипсинизированных эритроцитов на 1% растворе альбумина. К полученным препаратам добавляют по одной капле изотонического раствора хлорида натрия и накрывают покровными стеклами, при этом группу крови определяют микроскопически по наличию соответствующих агглютинатов.

Пример: Больная Н. 10 лет. Диагноз при поступлении: Микроспория волосистой части головы.

В день поступления в результате обследования клинический диагноз был подтвержден. В качестве образца изъяты здоровые волосы.

При макроскопическом исследовании волосы в пучке прямые, светло-коричневого цвета, длиной 12,5 см. При микроскопической исследовании - цвет волос светло-коричневый. Толщина волос в корневой и прикорневой зонах - 0,069-0,074 мкм за счете утолщения в виде муфты. Оптический край волоса неровный. Кутикула практически отсутствует в корневой и прикорневой частях волоса. В корковом веществе различимы дефекты в виде косопоперечных светлых полос. Вырванная луковица веретенообразной формы, черного цвета, влагалищные оболочки отсутствуют, контуры нечеткие. Микроструктура луковицы и стержни волоса трудноразличимы.

Серологическое исследование волос: реакция абсорбции-элюции на покровном стекле с применением изосывороток анти-А и анти-В. В результате проведенных исследований групповую принадлежность (II гр.) установили в здоровом волосе, в то время как в пораженных грибком волосах антигены не выявлялись.

После применения предложенной нами методики групповая принадлежность в волосах, поврежденных грибком Microsporum canis, была определена.

Пораженные грибком волосы предварительно поместили в раствор трипсина (0,01 мг трипсина на 10 мл изотонического раствора хлорида натрия) на 30 минут, затем тщательно промыли изотоническим раствором хлорида натрия и поместили на два обезжиренных предметных стекла. К одному объекту добавили две капли изосыворотки анти-А, ко второму - две капли сыворотки анти-В. Экспозиция составила 22 часа во влажных камерах при температуре 4^oС, затем объекты тщательно отмыли охлажденным изотоническим раствором хлорида натрия. Элюцию провели в 0,2% взвеси трижды отмытых трипсинизированных эритроцитов на 1% растворе альбумина. К полученным препаратам добавили по капле изотонического раствора хлорида натрия и покрыли покровным стеклом. В результате проведенного исследования в пораженных грибком волосах больной Н. 10 лет выявлен антиген А., соответствующий II гр. крови.

Изобретение относится к медицине, в частности к судебной медицине, дерматологии и генетике. Способ обеспечивает повышение чувствительности и специфичности при определении группы крови человека в биологических объектах, пораженных патологическим процессами. Биологический объект предварительно помещают в 0,1% изотонический раствор трипсина на 30 мин, затем тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия, полученные препараты помещают на два обезжиренных предметных стекла, к одному объекту добавляют по две капли изосыворотки анти-А, к другому анти-В, выдерживают 22-24 ч во влажных камерах при 4^oС, после чего объект тщательно промывают изотоническим раствором, охлажденным до 1-2^oС, и проводят элюцию в 0,2% взвеси трижды отмытых трипсинизированных эритроцитов на 1% растворе альбумина, к полученным препаратам добавляют по одной капле изотонического раствора натрия хлорида и накрывают покрывными стеклами, при этом группу крови определяют микроскопически по наличию соответствующих агглютинатов.

Способ определения группы крови человека в биологических объектах, пораженных патологическими процессами, характеризующийся тем, что биологический объект предварительно помещают в 0,1% изотонический раствор трипсина на 30 мин, затем тщательно промывают изотоническим раствором, полученные препараты помещают на два обезжиренных предметных стекла, к одному объекту добавляют две капли изосыворотки анти-А, к другому - анти-В, выдерживают 22-24 ч во влажных камерах, при 4^oС, после чего объект тщательно промывают изотоническим раствором, охлажденным до 1-2^oС, и проводят элюцию в 0,2% взвеси трижды отмытых трипсинизированных эритроцитов на 1% растворе альбумина, к полученным препаратам добавляют по одной капле изотонического раствора и накрывают покровными стеклами, при этом группу крови определяют микроскопически по наличию соответствующих агглютинатов.