Изобретение относится к медицине, биологии и может найти применение в антропологии при определении антигенов в тканях эпидермального и костного происхождений.
Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа,
Способ осуществляют следующим образом.
Для проведения аффинной хроматографии используется устройство. Устройство состоит из хроматографической пластины, выполненной из оргстекла, на одной стороне которой выполнены четыре паза и четыре гнезда. На верхней боковой стороне хроматографической пластины выполнены отверстия капиллярных каналов, которые проходят через толщу стекла и соединяются с гнездами. Капиллярный канал соединяет пазы с гнездами.
Волосы измельчают в фарфоровой ступке вместе с индифферентным сорбентом
(силикагель, окись алюминия и т.п.) до порошкообразного состояния, что дает возможность увеличитьплощадь соприкосновения антигенов волос с антителами сыворотки. Затем эту смесь помещают в два гнезда устройства для исследования одного объекта. В пазы засыпают сорбент так, чтобы сорбент заполнил капиллярный канал с целью обеспечения непрерывного течения сыворотки. В отверстия капиллярного канала устанавливают пастеровские пипетки, диаметр которых у выхода капилляра составляет 0,2 мм, что обеспечивает непрерывное и замедленное течение сыворотки. В увеличении диаметра нет необходимости, так как это способствует неоправданному перерасходу сыворотки. Пастеровские пипетки заполняют цельными изосыворотками альфа и бета в подобранном рабочем разведении Рабочее разведение для каждой серии сывороток подбирают отдельно. Как правило, эти рабосл ю
00
сл
vj
чие разведения соответствуют 1:64 при наличии титра сыворотки 1:128 и 1:128 при наличии сыворотки с титром 1:256 и т.д. Одну пастеровскую пипетку заполняют альфа сывороткой, другую - бета сывороткой. Сыворотки стекают через капилляры, омывая непрерывно исследуемые объекты. Хроматография длится 6-8 ч. По истечении времени исследуемые объекты переносят в пробирки, куда добавляют по 2 капли физраствора. Затем пробирки с исследуемым материалом помещают в термостат при температуре +56°С на 30 мин. Поток в пробирки закапывают по 2 капли соответствующую 0,3%-ную взвесь эритроцитов группы А или В, В пробирку с исследуемым материалом, где пропускали сыворотку альфа, закапывают эритроциты группы А, а в другую - эритроциты группы В. Затем центрифугируют при 1000 об. в 1 мин в течение 4 мин. Результаты учитывают микроскопически.
П р и м е р 1. Были взяты волосы у лица с А (II) группой крови. Волосы растирали в фарфоровой ступке вместе с силикагелем в соотношении соответственно 1:3. Смесь доводили до порошкообразного состояния. Эту смесь помещали в два гнезда устройства. В два соответствующих паза засыпали сорбент (силикагель) так, чтобы сорбент заполнил капиллярный канал.В отверстия ка пиллярного канала установили две пастеровские пипетки, которые заполнили одну сывороткой альфа в рабочем разведении 1:256, другую - бета в рабочем разведе- нии с физ. раствором также 1:256. Сыворотки брали по 3 мл. Хроматография длилась 6 ч. По истечении времени исследуемый материал переносили в пробирки: объект, который омывался сывороткой альфа - в одну пробирку, а объект, который омывался сывороткой бета - в другую пробирку. В пробирки закапывали по 1 капле физраствора и элюировали в термостате при температуре +56°С 30 мин. Затем элюат перенесли в другие пробирки, чтобы исследуемый объект не мешал при микроскопии, а также при необходимости повторного исследования. В пробирки с элюатом добавляли по 1 капле 0,3%-ную взвесь стандартных эритроцитов: в ту пробирку, где находился исследуемый материал, через который пропускали сыворотку альфа, добавили эритроциты группы А, а в другую-эритроциты группы В. Центрифугировали 4 мин при 1000 об. в 1 мин. Затем пробирки встряхивали и содержимое переносили на предметные стекла и микро- скопировали. В препарате, куда добавляли эритроциты группы А была явная агглютина- ция эритроцитов, которая указывает на присутствие аггяютиногена А, В препарате,
куда добавляли эритроциты группы В агглю- танация эритроцитов отсутствовала.
При исследовании волос данной группы в соотношении с силикагелем 1:12 и хроматографированием в течение 6 ч агглютино- гены не были обнаружены.
П р и м е р 2. Были взяты волосы у лица с В (III) группой крови. Волосы растирали в фарфоровой ступке вместе с силикагелем в
0 соотношении соответственно 1:7. Смесь доводили до порошкообразного состояния. Эту смесь помещали в два гнезда устройства. Два соответствующих паза заполняли силикагелем. В отверстия капиллярного ка5 нала установили две пастеровские пипетки, которые заполнили, одну цельной сывороткой альфа с титром 1:128, предварительно разведя ее до рабочего разведения 1:64, другую пастеровскую пипетку - сывороткой
0 бета с рабочим разведением также 1:64. Хроматография длилась 8 ч. Затем исследуемые материалы переносили в пробирки, добавляли по 1 капле физраствора и элюировали при температуре +56°С в течение 30
5 мин. Потом элюат переносили в другие пробирки, куда добавляли по 1 капле 0,3%-ной взвеси соответствующих стандартных эритроцитов. Центрифугировали 4 мин при 1000 об. в 1 мин. Затем пробирки встряхивали и
0 готовили препарат для микроскопирования. В препарате, где были добавлены эритроциты группы А, агглютинация эритроцитов отсутствовала. В препарате, куда добавляли эритроциты группы В, отмечалась агглюти5 нация эритроцитов, которая указывает на присутствие агглютиногена В.
При исследовании волос от этого же лица в соотношении с силикагелем 1:7 и хро- матографировании в течение 12ч сыворотка
0 иссякла, соответствующий агглютиноген В не был выявлен, хотя имели место единичное склеивание единичных эритроцитов, что можно связать с ресорбцией антител.
П р и м е р 3. Волосы гр-ки У., 20 лет, с
5 неизвестной группой крови. Волосы растирали в фарфоровой ступке вместе с силикагелем в соотношении соответственно 1:3. Смесь доводили до порошкообразного состояния. Эту смесь помещали в два гнезда
0 устройства. Два соответствующих паза за- . сыпали сорбентом (силикагелем) так, чтобы сорбент заполнил капиллярный канал. В отверстия капиллярного канала установили две пастеровские пипетки, которые запол5 нили одну сывороткой альфа в рабочем разведении (с физраствором) 1:128, другую - бета в рабочем разведении 1:64.
Сыворотки брались по 3 мл. Хроматография длилась 8 ч. По истечении этого вре- мени исследуемый материал переносили в
пробирки: объект, который омывался сывороткой альфа - в одну пробирку, а объект, который омывался сывороткой бета - в другую пробирку. В пробирки закапывали по одной капле физраствора и элюировали в термостате при +5б°С в течение 30 мин. Затем элюат перенесли в другие пробирки и в каждую из них в отдельности добавляли по 1 капле 0,3%-ной взвеси стандартных эритроцитов группы А и В. В ту пробирку, где находился исследуемый материал, через который пропустили сыворотку альфа, добавили эритроциты группы А, а в другую - группы В. Пробирки центрифугировали 4 мин при 1000 об. в минуту. Извлекали их из центрифуги, встряхивали и содержимое переносили на предметные стекла и подвергали микроскопическому исследованию. При этом в объекте, куда добавлялись эритроциты группы А агглютинация не наступила, а в объекте, куда добавляли эритроциты группы В, наступила хорошо выраженная агглютинация. Следовательно, в объекте установлен агглютиноген В, что соответствует третьей группе крови. В последующем, при проверке, у гр-ки У была установлена эта группа крови.
Положительный эффект от использования предлагаемого способа заключается в повышении точности определения принадлежности человеческих волос, что достигается благодаря использованию аффинной хроматографии. Точность определения согласно предлагаемому способу составляет
93,4%, а согласно прототипу- 56,7%. Повышение точности способа обеспечивается путем увеличения площади соприкосновения антигенов исследуемого материала с антителами сыворотки, что достигается благодаря разрушению структуры волос путем их измельчения и смешивания с индифферентным сорбентом, а также за счет непрерывного смывания объектов исследования сывороткой, что также ускоряет осуществление способа до 6-8 ч (согласно прототипу - 20ч).
Формула изобретения Способ определения агглютиногенов в
волосах человека путем расщепления их, добавления изосыворотки альфа и бета и выявления агглютиногена в реакции абсорбции элюции, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа, перед добавлением изосыво- ротки материал волос смешивают с индиферентным сорбентом в соотношении 1:3-1:10, а воздействие изосывороткой проводят путем хроматографии при непрерывном их взаимодействии в течение 6-8 ч.
Изобретение относится к области медицины, биологии и может найти применение в судебной медицине и антропологии при определении антигенов в тканях эпидер- мального и костного происхождений, в частности в волосах. Цель изобретения - повышение точности и ускорение способа Это достигается тем, что исследуемый объект смешивают с индифферентным сорбентом в соотношении 1 3-110 и помещают в хроматографическое устройство В нем объект непрерывно омывают изосыворотками в течение 6-8 ч Затем по наличию агглютинации эритроцитов определяют принадлежность агглютиногенов той или иной группе лиц.
| Дианова Т.Н | |||
| Судебно-медицинская экспертиза, 1974, № 1, с.33-35. |
