СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУППОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ СИНОВИАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области диагностического исследования синовиальной жидкости (СЖ) путем регистрации результатов реагирования антител СЖ с антигенами эритроцитов крови разных групп.

СЖ представляет собой многокомпонентную биологическую среду, содержащую водные растворы электролитов, белково-полисахаридные комплексы и специфический протеогликан - гиалуроновую кислоту (ГУК). Они образуют многоступенчатую пространственную структуру, уровнями которой являются гидратные оболочки вокруг полярных составляющих синовии, ассоциаты макромолекул белков и полисахаридов, пространственно связанные комплексы таких ассоциатов, жидкокристаллические структуры на основе соединений холестерина и др. [1. Ермаков С.Ф., Родненков В.Г., Белоенко Е.Д., Купчинов Б.И. Жидкие кристаллы в технике и медицине. - Мн.: ООО «Асар», М.: ООО «ЧеРо», 2002. - 412 с.]. Именно такая структура обусловливает возможность выполнения СЖ присущих ей функций (метаболическая, трибологическая, трофическая и барьерная), обеспечивающих многолетнюю работу сустава. Структурные изменения СЖ на любом из этих уровней, происходящие при нарушении обмена веществ в организме, приводят к недостаточному выполнению синовией этих функций и к заболеваниям суставов.

В последние десятилетия определилась тенденция лечения суставов с помощью заменителей СЖ, содержащих ГУК. Представители этой группы медикаментов - «Гиалган» («Hyalgan», фирма «Fidia», Италия), «Синвиск» («Synvisc», фирма «Biomatrix», США), «Ортовиск» («Ortovisk», фирма «Anika Therapeutics, Inc.» США) и др. - преимущественно восполняют вязкость жидкой прослойки в суставе и не всегда эффективны при лечении артрозов [2. Pinchuk L.S., Nikolaev V.I., Tsvetkova Е.A., Goldade V.A. Tribology and Biophysics of Artificial Joints. London: Elsevier, 2006. - 350 p.].

Поиски заменителей СЖ, максимально идентичных ее молекулярной структуре и биосовместимых с организмом человека, привели к использованию в качестве такого лекарственного средства (ЛС) сыворотки собственной крови пациента (аутосыворотки) [3. Чернякова Ю.М. Оптимизация диагностики и лечения синовита путем контроля биофизических свойств синовиальной жидкости (экспериментально-клиническое исследование). - Автореф. дис.... канд. мед. наук. Минск, Бел НИИТО, 2006. - 18 с.] и препаратов на ее основе [4. Белоенко Е.Д., Чернякова Ю.М., Пинчук Л.С. Трибологическое обоснование метода хондропротекции с помощью аутосыворотки крови и гиалуронатов // Доклады НАН Беларуси. - 2007. - Т.51, №2. - С.72-75]. Очевидно, что идеальным заменителем СЖ в суставе является СЖ, взятая из другого сустава. Это предполагает целесообразность использования для хондропротекции донорской СЖ человека и необходимость создания банков для ее хранения. В связи с этим становится актуальной задача определения биологической совместимости донорской СЖ с тканями и биологическими жидкостями организма пациента, т.е. разработки метода определения в донорской СЖ антител к антигенам эритроцитов пациента. Применяемые в медицине методы анализа СЖ позволяют оценить преимущественно ее химический и клеточный состав, но не дают информации о групповой принадлежности СЖ.

Известен способ определения белка в биологической жидкости [5. Авт. свид. 1681182 СССР. Способ определения белка в биологической жидкости // Шатохина С.Н., Теодор И.А., Мокурина Т.В. и др. МПК GO01N 1/28. Опубл. 1991], согласно которому каплю исследуемой жидкости высушивают на стекле при температуре 18-30°С. На высушенной капле определяют ширину и диаметр краевой зоны, в которой преимущественно концентрируется белок. По этим параметрам вычисляют содержание белка.

Способ оценки внутрисуставного воспаления [6. Патент 2159434 РФ. Способ оценки характера внутрисуставного воспаления // Базарный В.В., Петрович Н.С, Бердюгина О.В., Поляков В.Ю. МПК G01N 33/52, 33/483. Опубл. 2000] состоит в определении структурно-оптических параметров СЖ методом поляризационной фотометрии. Каплю СЖ помещают в 0,9% раствор NaCl и определяют коэффициент поглощения смеси, по величине которого судят о фазе воспаления сустава.

Способ тестирования на наличие ревматического заболевания [7. Патент 2173462 РФ. Способ тестирования на наличие ревматического заболевания // Соколова Л.А., Мальчикова Л.П. МПК G01N 33/48, 33/68. Опубл. 2001] состоит в морфологическом изучении структуры высушенных капель СЖ и сыворотки крови в поляризованном свете. Сравнивают образовавшиеся на месте высушенных капель сферолитные и дендритные образования. По преобладанию структур одного или второго типа диагностируют остеоартроз, ревматоидный или реактивный артрит.

В артрологии применяют способ [8. Патент 2194989 РФ. Способ интраоперационного прогнозирования развития реактивного артрита после операционного лечения закрытой травмы коленного сустава // Сыромятникова Е.Д., Малыгина М.А. МПК G01N 33/52. Опубл. 2002] прогнозирования развития реактивного артрита после операционного лечения закрытой травмы коленного сустава. Во время операции производят отбор СЖ, а затем спектрофотометрически регистрируют концентрацию в ней среднемолекулярных пептидов, а с помощью микроскопа определяют содержание некротических субстанций. По этим показателям прогнозируют степень осложнения заболевания и отдаленный результат операции.

Недостаток названых способов [5-8] состоит в том, что они не дают информации о групповой принадлежности СЖ и ее биологической совместимости с тканями других организмов.

Известен способ оценки метаболических костных заболеваний [9. Патентная заявка 98/03421 Японии. Способ диагностики метаболических костных заболеваний // Яно К., Кобаяси Ф., Гото М. и др. МПК G01N 33/53, С12Р 21/08. Опубл. 1999], согласно которому СЖ или кровь пациента подвергают иммунологическому анализу. В каплю исследуемой жидкости вводят флуоресцентный агент, который связывается с комплексом антиген-антитело. Таким образом определяют концентрацию фактора, ингибирующего остеокластогенез (OCIF), по которой судят о наличии и типе заболевания.

Этот способ относится к диагностике заболеваний суставов и не позволяет определить групповую принадлежность СЖ.

Анализ патентных аналогов показывает, что задача определения групповой принадлежности синовиальной жидкости до сих пор не ставилась.

Прототипом изобретения можно считать открытый австрийским врачом, лауреатом Нобелевской премии К.Ландштайнером, способ определения групп крови системы АВ0. Он состоит [10. Инструкция по переливанию донорской крови и ее компонентов. Регистр. №118-1103 М3 РБ от 01.12.2003 г.] в смешении капель исследуемой крови со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками групп 0αβ (I), Аβ (II), Вα (III), АВ₀ (IV). Затем регистрируют реакцию агглютинации, которая начинается в течение первых 10-30 с после смешения. Через 3 мин в смесь добавляют изотонический раствор NaCl и продолжают наблюдение в течение 5 мин. По сочетанию положительных и отрицательных результатов агглютинации судят о групповой принадлежности исследуемой крови.

Недостатки прототипа:

- сыворотка крови является малоинформативным агентом для определения биологической совместимости донорской СЖ и тканей организма реципиента, т.к. не содержит клеток, а именно эритроцитов, на которых преимущественно локализованы антигены реципиента;

- вязкость крови более чем на порядок ниже вязкости СЖ, что обусловливает иное содержание операций, приводящих к агглютинации, если подобный способ применить к СЖ;

- СЖ представляет собой пространственно организованную структуру, имеющую признаки дальнего порядка, содержащиеся в ней антитела связаны и имеют гораздо меньшую биологическую активность, чем антитела крови, поэтому способ-прототип к ней не применим.

Задачи, на решение которых направлено изобретение:

1) найти тестовые препараты с большой концентрацией эритроцитов, антигены которых активно реагируют с антителами донорской СЖ;

2) разработать методику, позволяющую повысить биохимическую активность антител СЖ в реакциях агглютинации;

3) оптимизировать по критериям ускорения и информативности технологические режимы реакций агглютинации донорской СЖ с найденными препаратами.

Поставленные задачи решаются тем, что капли исследуемой СЖ предварительно разбавляют изотоническим раствором хлорида натрия в соотношении 3:2, а затем смешивают разбавленный раствор с эритроцитными массами доноров, имеющих группы крови 0αβ (I), Аβ (II), Вα (III), АВ₀ (IV) с положительными Rh⁺ и отрицательными Rh^- резус-факторами. После этого наблюдают за смесью, определяя наличие (положительная реакция) или отсутствие (отрицательная) агглютинации. Она происходит в течение 10 мин после смешения и приводит к образованию в смеси новой фазы в виде микрочастиц размером порядка 10-100 мкм. После завершения реакции смесь сохраняет розовый оттенок, менее насыщенный, чем у исходной смеси. В заключение по сочетанию положительных и отрицательных результатов реакции определяют групповую принадлежность СЖ, аналогично тому, как это делают при определении групп крови.

Сущность изобретения состоит в следующем. СЖ имеет двойственную природу. Ее основу составляет диализат крови, просачивающийся через стенки капилляров в межуточную ткань синовиальной оболочки. Последняя вырабатывает ГУК, которая соединяется с диализатом, придавая ему гелеобразную структуру. Химический состав ГУК, вырабатываемой разными организмами, одинаков. Поэтому групповую принадлежность и тканевую совместимость СЖ должны определять антитела, содержащиеся в диализате, а следовательно, в крови пациента. Таким образом, задача определения групповой принадлежности синовии решается путем высвобождения антител, физико-химически связанных в структуре СЖ, придания им биологической активности и создания условий для максимально быстрого реагирования антител СЖ с антигенами эритроцитов, содержащихся в тестовых препаратах.

Примеры осуществления способа

СЖ получали во время проведения лечебно-диагностических пункций и операций на коленных суставах от пациентов (с их согласия) с травматической патологией и синовитами неиммунного генеза. В процессе общепринятого клинико-лабораторного обследования у них были определены группы крови по системе АВ0 и резус-принадлежность с использованием набора стандартных гемагглютинирующих сывороток [10]. В экспериментах с СЖ в качестве тестовых антигенов использовали эритроцитные массы доноров, изготовленные для трансфузий на станции переливания крови. Образцы СЖ хранили в пластмассовых пробирках при температуре минус 25°С не более месяца.

В лунки пластинки белого цвета помещали по 2-3 капли исследуемой СЖ. Добавляли в лунки изотонический (0,9%) раствор хлорида натрия в соотношении 3:2 и смешивали стеклянной палочкой. Затем вносили в лунки по 0,01 мл эритроцитной массы, которая выделена из крови анализируемой группы, смешивали жидкости и, периодически покачивая пластину, наблюдали за реакцией в смеси.

Положительная реакция состояла в агглютинации, которой соответствовало образование в исходной гомогенной смеси новой фазы. Агглютинаты СЖ имели вид микрочастиц размером порядка 10-100 мкм и напоминали частицы мелкого песка. При покачивании пластины они «переползали» по лунке («ржавая» вода) и во внешнему виду отличались от хлопьевидных агглютинатов, характерных для крови. После завершения агглютинации смесь, содержащая СЖ, сохраняла розовый оттенок, менее насыщенный, чем цвет исходной смеси (в процессе агглютинации крови окраска смеси исчезает). Длительность описанного процесса агглютинации СЖ составляет не более 10 мин. Если СЖ, помещенную в лунки пластины, разбавлять раствором хлорида натрия в меньшем количестве, чем 3:2, продолжительность агглютинации резко возрастает (вдвое и более). Увеличение количества раствора выше оптимального соотношения создает неудобства при смешивании реагентов и затрудняет регистрацию момента начала агглютинации.

Отрицательная реакция при смешивании СЖ и эритроцитов соответствовала отсутствию изменений в образце, который в течение 10 и более минут наблюдения выглядит как однородная, равномерно окрашенная красноватого цвета жидкость без осадка.

Для определения совместимости СЖ и эритроцитов по резус-фактору проводили пробу с 33% раствором полиглюкина. На дно пробирки помещали две капли исследуемой СЖ, добавляли одну каплю полиглюкина и одну каплю эритроцитной массы крови анализируемых группы и резуса. Пробирку покачивали в течение 5 мин, перемешивая жидкости, затем добавляли в смесь 5 мл изотонического раствора хлорида натрия и снова смешивали содержимое пробирки покачиванием. После этого оценивали реакцию совместимости компонентов.

Все эксперименты проводили при температуре воздуха 18-22°С. Результаты экспериментов приведены в таблице.

Эритроцитная масса (антигены)Синовиальная жидкость (антитела)0 αβ (I)A β (II)В α (III)AB ₀ (IV)Rh⁺Rh^-Rh⁺Rh^-Rh⁺Rh^-Rh⁺Rh^-0(1)Rh⁺--------Rh^---------А (II)Rh⁺++--++--Rh^-++--++--В (III)Rh⁺++++----Rh^-++++----AB(IV)Rh⁺++++++--Rh^-++++++--Примечание: «+» - агглютинация эритроцитов есть; «-» - агглютинации эритроцитов нет.

Анализ данных таблицы приводит к следующим выводам:

1. Реакции исследуемых СЖ с тестовыми эритроцитными массами аналогичны реакциям крови разных групп со стандартными гемагглютинирующими сыворотками. Агглютинация, происходящая при смешении эритроцитов II группы и СЖ людей, имеющих I и III группы крови, свидетельствует о наличии в СЖ антител (агглютининов α) против антигена А. Аналогичная реакция в смеси эритроцитов III группы с СЖ людей, имеющих I и II группы крови, доказывает присутствие в СЖ агглютининов β против антигена В. Следовательно, в СЖ людей I группы крови есть α- и β-агглютинины, у людей II группы - β-, а у III - α-агглютинины. Присутствие антител α или β (или α и β) в СЖ I, II и III групп обусловливает положительную реакцию с эритроцитами IV группы, содержащими А и В антигены. СЖ людей IV группы крови дает отрицательную реакцию с эритроцитами всех групп и, следовательно, не содержит антител к антигенам А и В.

2. Реакции Rh⁺ и Rh^- эритроцитных масс каждой группы крови с СЖ людей той же группы крови, но разной резус-принадлежности, одинаковы. Следовательно, резус-принадлежность СЖ и тестовых эритроцитных масс не влияет на результаты реакции в группах. Полиглюкиновая проба подтвердила отсутствие противорезусных антител в исследованных образцах СЖ. В экспериментах на совместимость СЖ и эритроцитов по Rh-фактору образцы были совместимы во всех случаях. Об этом свидетельствовал вид содержимого пробирок: жидкость светло-красная, без осадка и хлопьев, равномерно окрашенная, опалесцирующая.

3. СЖ человека обладает тем же набором групповых антител, что и сыворотка его крови. Следовательно, СЖ подобно сыворотке может участвовать в тканевом иммунном ответе. Установлено наличие 4-х групп СЖ человека, соответствующих его группе крови. Критерием биологической совместимости хондропротекторов на основе СЖ человека, а также использования при лечении суставов препаратов, содержащих донорскую СЖ, является совпадение групповой принадлежности препарата и крови реципиента.

Таким образом, задачи, поставленные при создании изобретения, решены.

Изобретение найдет применение в травматологии и ортопедии при лечении суставов путем инъекций СЖ доноров и ЛС, содержащих донорскую СЖ, а также в судебной медицине.

Изобретение относится к области медицины, а именно к методам лабораторного обследования, и касается способа определения групповой принадлежности синовиальной жидкости (СЖ). Способ осуществляется путем регистрации результатов реагирования антител СЖ с антигенами эритроцитов крови разных групп. По сочетанию положительных и отрицательных результатов реакции определяют групповую принадлежность СЖ. Использование способа позволяет определить групповую принадлежность СЖ при лечении суставов путем инъекций СЖ доноров и лекарственных средств, содержащих донорскую СЖ. 1 табл.

Способ определения групповой принадлежности синовиальной жидкости, отличающийся тем, что капли синовиальной жидкости разбавляют изотоническим раствором хлорида натрия в соотношении 3:2, смешивают разбавленный раствор с эритроцитарными массами крови групп 0αβ (I), Аβ (II), Bα (III), АВ₀ (IV) и регистрируют тип реакции смесей, который определяется отсутствием или наличием агглютинации, происходящей в течение 10 мин после смешения с образованием в смеси фазы микрочастиц размером порядка 10-100 мкм и сопровождающейся легким обесцвечиванием смеси, которая сохраняет розовый оттенок, менее насыщенный, чем цвет исходной смеси, после чего по сочетанию положительных и отрицательных результатов реакции определяют групповую принадлежность синовиальной жидкости.