СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ПОДВИЖНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МИКРООБЪЕКТОВ Российский патент 2003 года по МПК G01N27/26 G01N33/483 C12Q1/02 

Изобретение относится к биологии и экспериментальной медицине, а именно к способам измерения поверхностного потенциала различных биологических микрообъектов, например клеток микроорганизмов.

Известен способ оценки электрофоретической подвижности (ЭФП) бактерий (Бурлакова Е.В., Колье О.Р., Кригер Ю.А., Физико-химические методы в биологии. -М., 1958).

Сущность способа заключается в том, что используется система деполяризующихся электродов и капиллярных трубок (агаровых мостиков), непосредственно примыкающих к камере, заполненной суспензией исследуемых биологических объектов. Подача напряжения осуществляется через систему KCl-агаровых мостиков.

Недостатком способа является падение напряжения в системе деполяризующихся электродов, трудно поддающееся учету. Данное падение напряжения зависит от капиллярных трубок, примыкающих к камере, их длины, расположения. Кроме того, использование системы деполяризующихся электродов исключает герметизацию камеры.

Известен другой способ определения электрофоретической подвижности (Abramson H.A., Moyer L., Corin M., Electrohoresis of proteins and the chemistry of cell surface. N.Y., 1942) с использованием герметически закрытой камеры, имеющей деполяризующие KCl-агаровые системы, управляемые краном.

Недостатком данного метода является сложность изготовления герметичной конструкции камеры для выполнения данного способа и установление этой конструкции в строго горизонтальном положении. В процессе работы камеры через 5 с наступает "отравление" ионами К⁺ и Cl^- пространства камеры, что искажает электрофоретическую подвижность.

Наиболее близким к заявляемому является способ измерения ЭФП в герметичной камере с плоскопараллельными Pt электродами (Фробишер. Основы микробиологии, М. : Мир, 1965, с.168). При выполнении способа камера для измерений ЭФП заполнялась суспензией биологических объектов на основе водных растворов.

Недостатком является то, что, присутствующие в водных растворах растворенные вещества блокируют диссоциирующие группы на поверхности клеток биологических объектов, искажая значения ЭФП и, для коррекции этого, требуется обязательное применение деполяризующих электродов.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что в качестве среды измерения используется дистиллированная или бидистиллированная вода.

Предлагаемый способ заключается в использовании в качестве материала исследований биологических систем дистиллированной или бидистилированной воды, которая по физико-химическим свойствам является диэлектриком, исключающим проявления электролиза при подаче напряжения на электроды камеры. В силу существования двойного электрического слоя между жидкой и твердой фазами явление электролиза имеет такое же проявление, что и в буферных системах. Однако здесь полностью исключается явление электролиза, что делает возможным отказаться от сложной системы измерения с использованием буферных растворов той или другой природы.

Проведение измерений проводилось следующим образом.

Пример 1. Измерение электрофоретической подвижности клеток прокариотических микроорганизмов.

Перед непосредственным измерением электрофоретической подвижности микроорганизмов камера промывалась дистиллированной или бидистилированной водой для исключения присутствия побочных продуктов. Культуры выращивались на мясопептонном агаре при 37^oС в течение 24 ч. Смыв клеток культуры проводили дистиллированной или бидистиллированной водой с последующим трехкратным отмыванием при центрифугировании в бидистиллированной воде. Взвесь микроорганизмов сравнивали со стандартом 1,5х10⁹ с помощью фотоэлектрокалориметра, рН взвесей контролировали потенциометрически. Заполнение камеры взвесью клеток микроорганизмов на дистиллированной или бидистиллированной воде осуществлялось с помощью шприца объемом, соответствующим рабочей емкости камеры. Для исключения наличия воздуха в камере, препятствующего измерениям, выходные трубки камеры после заполнения рабочей емкости камеры исследуемой взвесью микроорганизмов закрывались силиконовыми пробками. Измерения дзета-потенциала проводились методом относительного смещения. На электроды камеры подавался ток от генератора низких частот (0,1-1 Гц). При этом каждая клетка микроорганизмов колеблется пропорционально заданной частоте с амплитудой, определяемой собственным зарядом, т. е. дзета-потенциалом. Измерительная шкала окуляра располагалась параллельно оси колебания клеток. Скорость перемещения клеток измеряли амплитудно-частотным методом на уровне Смолуховского. Производили измерение 100 отдельных клеток микроорганизмов и вычисляли среднее. Результаты измерений приведены в таблице.

Пример 2. Измерение электрофоретической подвижности эукариотических клеток.

Подготовка камеры к работе и проведение измерений осуществляли аналогично, как в примере 1. Взвесь клеток эукариотов готовили на дистиллированной и бидистилированной воде с одноразовой отмывкой от первоначальной среды и быстро начинали выполнение измерений для получения результатов, поскольку клетки эукариотов подвержены ускоренному спонтанному лизису.

Результаты представлены также в таблице.

Пример 3. Измерение электрофоретической подвижности других биологических микрообъектов (тени эритроциов).

Подготовка камеры к работе и проведение измерений осуществляли аналогично, как в примере 1. Результаты представлены также в таблице.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования дистиллированной или бидистиллированной воды для измерения электрофоретической подвижности биологических микрообъектов. Обнаружены недостоверные различия при использовании дистиллированной или бидистиллированной воды для приготовления взвеси биологических микрообъектов и последующего измерения ЭФП. Это позволяет использовать дистиллированную или бидистиллированную воду для измерения электрофоретической подвижности биологических микрообъектов, неподверженных индуцированному гипоосмотическому лизису в ходе исследования.

Сущность технического решения заключается в том, что использование дистиллированной или бидистиллированной воды исключает погрешности при приготовлении буферов, стандартизует процесс измерения и обеспечивает точность при использовании способа измерения электрофоретической подвижности в камере с плоскопараллельными металлическими электродами.

Изобретение относится к биологии и экспериментальной медицине. Способ заключается в заполнении камеры с электродами суспензией биологических микрообъектов, приготовленной на дистиллированной или бидистиллированной воде. Регистрируют амплитуду колебания в поле зрения микроскопа. Способ позволяет повысить точность измерения. 1 табл.

Способ измерения электрофоретической подвижности биологических микрообъектов, включающий приготовление суспензии биологических микрообъектов в дистиллированной или бидистиллированной воде, помещение ее в камеру с электродами, подачу на электроды электрического тока и последующую регистрацию амплитуды колебания биологических микрообъектов в поле зрения микроскопа.