СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОЖНОГО ПОКРОВА Российский патент 2004 года по МПК A61K9/70 A61K35/36 

Способ относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине.

Известен способ восстановления кожного покрова, основанный на пересадке на раневую поверхность культивированных эпителиоцитов (Rapid Amplification of Human Keratinocyte Stem Cell in Culture and Application to Skin Grafting and Reconstructive Surgery. / Rheinwald J.G., O'Connell W.T., Lindberg K., Bronstein B. //.J. Cell. Biochem. - 1992. - Suppl.16F. - p.120-126). Существенными недостатками этого метода являются такие сложные технические проблемы, как высокая стоимость работ, необходимость специальных ростовых сред с низким содержанием кальция, многочисленный лабораторный персонал, имеющий хорошую специальную подготовку, значительные сроки получения достаточного по площади трансплантата из аутоклеток пациента (3-4 недели). Последнее условие резко повышает риск развития осложнений и ухудшает прогноз для пострадавшего. Пересадка одних эпителиальных клеток не решает проблему восстановлении толщины кожи, уменьшенной в результате повреждения кожи.

Также известен способ восстановления кожного покрова, заключающийся в том, что аллофибробласты, полученные при культивировании, пересаживают на раневую поверхность длительно незаживающих ран донорских участков, сверху трансплантат покрывают парафинизированной марлей и накладывают сухую асептическую повязку. Фибробласты стимулируют регенерацию эпидермиса из сохранившихся частей кожных дериватов (Аллотрансплантация культивированных фибробластов на незаживающие раны после аутодермопластики (Д.С. Саркисов, Е.В. Глушенко, Ш.Р. Гуруков, С.С. Морозов, В.П. Туманов, Н.В. Бережков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1991. - № 5, - с.542-544). Недостатком этого способа является вынужденное резкое изменение условий существования культивированных фибробластов при их переносе из условий in vitro на раневую поверхность, что отрицательно влияет на жизнедеятельность этих клеток и объясняет не более восьмидесяти процентов эффективности применения этого способа. Причем не исключается вероятность развития реакции отторжения трансплантата, имеющая место в ряде случаев. Покрытие трансплантата парафинизированной марлей с наложенной сверху асептической повязкой вызывает травмирование раневой поверхности при движениях тела и при смене повязки, а также затрудняет отток раневого отделяемого.

В литературе описан способ восстановления кожного покрова (Comparative assessment of cultured skin substitutes and native skin autograft for treatment of full-thickness burns/ Boyce ST, Goretsky MJ, Greenhalgh DG, Kagan RJ, Rieman MT, Warden GD.// Ann. Surg. - 1995. - Dec; 222 (6): 743-52), который выбран нами в качестве прототипа. Суть этого способа состоит в том, что клетки эпидермиса и дермы, выращенные в условиях культивирования на субстратном комплексе, состоящем из коллагена и гликозаминогликанов, пересаживают вместе с этим комплексом на раны безтимусных мышей. В течение первых 14 суток до завершения васкуляризации трансплантата последний орошают кондиционированной ростовой средой и физиологическим раствором с факторами роста.

Однако этот известный способ имеет очевидные недостатки:

1) орошение раны не позволяет обеспечить длительное равномерное омывание трансплантата растворами с питательными веществами и факторами роста, а также не исключает высыхание клеток на субстратном комплексе;

2) орошение раны ведет к повышенному расходу растворов с питательными веществами и факторами роста;

3) испарение воды при орошении изменяет концентрацию растворенных веществ и осмолярность растворов;

4) выливаемые растворы ведут к намоканию животного и его переохлаждению, питательные вещества задерживаются вокруг трансплантата и создают условия для роста микроорганизмов, что увеличивает вероятность развития инфекционного воспаления;

5) орошающая повязка не исключает механические повреждения пересаженного комплекса при движениях животного и засорения трансплантата инородными телами;

6) предварительное культивирование клеток в питательной среде на субстрате in vitro, а также дальнейшая трансплантация комплекса на реципиентную поверхность и период его васкуляризация in vivo ведут к суммированию времени протекания идущих последовательно процессов подготовки трансплантата, его пересадки с непосредственным закрытием раневой поверхности и периодом васкуляризации трансплантата, что замедляет сроки лечения и при обширных повреждениях не способствует сохранению жизни пострадавшего.

Техническим результатом заявляемого изобретения является сокращение сроков восстановления кожного покрова, повышение эффективности использования растворов, их экономия, защита трансплантата от высыхания и механических повреждений, а также профилактика инфекционных осложнений.

Сущность изобретения состоит в том, что раневая поверхность сразу покрывается коллагеновой губкой, которая закрепляется на раневой поверхности и вместе с областью повреждения заключается в изолятор, длительно и непрерывно заполненный периодически сменяемой культуральной средой с химиотерапевтическими средствами, одномоментно с погружением в питательную среду губку инфильтрируют суспензией взвешенных фрагментов тканей и клеточных конгламератов, через 15-20 часов коллагеновую губку инфильтрируют суспензией, содержащей преимущественно взвесь фибробластов и их кластеров. Далее на поверхность губки, окруженной водонепроницаемым барьером, наносят слой взвеси эпителиальных клеток и их кластеров, причем поверхность губки должна находиться в горизонтальном положении не менее 6 часов. За этот промежуток эпителиальные клетки прикрепляются к субстрату. Далее культивирование пересаженных клеток проводят в условиях помещения восстанавливаемого участка кожи в водную среду изолятора непосредственно на субстрате (коллагеновой губке), заякоренном на реципиентной поверхности животного.

Пример использования.

Эксперимент был проведен на 10 половозрелых беспородных белых крысах-самках массой 170-180 г. Под нембуталовым наркозом у животных проводили выщипывание шерсти. Все тело животного обрабатывали химическим антисептиком АХД-2000 специаль. Далее область промежности окружалась специальным моче- и калоприемником. Всем животным в условиях операционной наносились стандартные полнослойные раны кожи боковой поверхности туловища размерами 4,0×4,0 см. На раневую поверхность сразу помещалась гемостатическая коллагеновая губка производства Лужского завода "Белкозин" толщиной 2 мм и подшивалась к поверхностной фасции тонкими шелковыми нитями. Затем тело наркотизированного животного за исключением головы погружалось в горизонтальном положении в эмалированный лоток, заполненный сбалансированным солевым раствором Хэнкса. Из лоскута иссеченной кожи этой крысы выделялись участки размером 0,5×0,5 см и 1,0×1,0 см. Их освобождали от подкожного жирового слоя и проводили механическое измельчение под бинокулярным увеличением глазными ножницами на тонкие полоски шириной 0,1-0,3 мм. Причем полоски ткани, полученные из первого участка, подвергали дальнейшему измельчению с помощью вращающихся лезвий на мельчайшие кусочки. Затем фрагменты тканей измельченных участков кожи помещали в 0,25% раствор трипсина ("Gibco"). Причем фрагменты первого участка помещали в раствор фермента на 5 ч при температуре +18°С при постоянном покачивании, а второго - на 20 ч при температуре +4°С. По прошествии времени воздействия раствора трипсина на фрагменты тканей первого участка проводили инфильтрацию губки готовой суспензией с помощью шприца. После чего животное помещалось в специальный изолятор, обеспечивающий длительное погружение области повреждения в водный раствор (Устройство для обеспечения регенерации кожи после обширных раневых дефектов в водной среде "Регенератрон": описание свидетельства на полезную модель к с. №12525 // Бюллетень изобретений. - 2000. - № 2 / Иванищук П.П., Ковалев А.В., Смирнова И.К., Смирнов К.К./. Заявка № 99115722/20 (016506), приоритет от 16.07.99). Изолятор был постоянно заполнен (до полного восстановления кожи) сменяемым 8 раз в сутки сбалансированным солевым раствором Хэнкса (модифицированным), куда также добавляли глюкозу до концентрации 1 г/л, соду (NаНСО₃) в концентрации 0,35 г/л, метронидазол (10 мг/л) и пефлоксацин (10 мг/л).

Далее по известной методике (Парамонов Б.А., Порембский Я.О., Яблонский В.Г. Ожоги: Руководство для врачей. СПБ.: СпецЛит, 2000, - 480 с.) полоски кожи второго участка дважды промывали в растворе Хэнкса и под бинокулярным увеличением в чашке Петри отделяли микроинструментами дерму от эпидермиса. После отделения эпидермиса от дермы кусочки эпидермиса помещают к пробирку со смесью фосфатного буферного раствора (PBS) и 0,25% раствора трипсина в соотношении 1:1. Далее полоски помещают на термостатирующую "качалку" с частотой 40 колебаний в минуту при температуре +37°С на 12 мин. Для остановки действия фермента добавляли бычью сыворотку из расчета 5% от общего объема и выдерживали в течение 10-15 мин при комнатной температуре. Пробирку с эпидермисом 10 раз сильно встряхивают, полученный раствор отбирали пипеткой с отбитым носиком и фильтровали через воронку с нейлоновым фильтром в другую пробирку. Взвесь клеток центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин. Супернатант сливали, осадок разводили ростовой средой, диспергировали и переносили на поверхность коллагеновой губки. Для этого лабораторную крысу предварительно наркотизировали и помещали в эмалированный лоток, заполненный подогретым до 37°С раствором Хэнкса. Область пересадки окружали по краю водонепроницаемым барьером, стенки которого препятствуют растеканию раствора, основание барьера герметично крепили к интактной коже. Далее животное переносили в устройство "Регенератрон" до полного восстановления кожи.

Пример 2.

Эксперимент был проведен на 10 половозрелых беспородных белых крысах-самках массой 170-180 г. Под нембуталовым наркозом у животных в теплой воде с мылом мыли хвост, затем обрабатывали химическим антисептиком АХД-2000 специаль кожу хвоста. Всем крысам в условиях операционной наносились стандартные полнослойные опоясывающие раны кожи хвоста длиной 1,5 см. На раневую поверхность сразу помещалась гемостатическая коллагеновая губка производства Лужского завода "Белкозин" толщиной 2 мм и подшивалась к сухожилиям хвостового отдела позвоночника тонкими шелковыми нитями. Причем края губки укладывали под край раны. Затем животное заключалось в специальное устройство с емкостью-изолятором, обеспечивающее длительное непрерывное погружение хвоста в раствор и изоляцию хвоста с областью повреждения от внешней среды. Первоначально емкость-изолятор заполнялась солевым раствором Хэнкса. Из лоскута иссеченной кожи этой крысы выделялся участок размером 0,5×0,5 см. Далее проводили механическое измельчение под бинокулярным увеличением глазными ножницами на тонкие полоски шириной 0,1-0,3 мм. Половину количества полосок подвергали дальнейшему измельчению с помощью вращающихся лезвий на мельчайшие кусочки. Затем фрагменты тканей измельченных участков кожи помещали в 0,25% раствор трипсина ("Gibco"). Причем фрагменты первой порции помещали в раствор фермента на 5 ч при температуре +18°С при постоянном покачивании, а второй - на 20 ч при температуре +4°С. По прошествии времени воздействия раствора трипсина на фрагменты тканей первой порции проводили инфильтрацию губки готовой суспензией с помощью шприца. Емкость-изолятор была постоянно заполнена (до второго этапа пересадки) сменяемым 3 раза в сутки сбалансированным солевым раствором Хэнкса (модифицированным), куда также добавляли глюкозу до концентрации 1 г/л, соду (NaHCO₃) в концентрации 0,35 г/л, метронидазол (10 мг/л) и пефлоксацин (10 мг/л).

Далее фрагменты второй порции отмывали в растворе Хэнкса и под бинокулярным увеличением в чашке Петри отделяли микроинструментами дерму от эпидермиса. После отделения эпидермиса от дермы кусочки эпидермиса помещали в пробирку со смесью фосфатного буферного раствора (PBS) и 0,25% раствора трипсина в соотношении 1:1. Далее полоски помещали на термостатирующую "качалку" с частотой 40 колебаний в минуту при температуре +37°С на 12 мин. Для остановки действия фермента добавляли бычью сыворотку из расчета 5% от общего объема и выдерживали в течение 10-15 мин при комнатной температуре. Пробирку с эпидермисом 10 раз сильно встряхивали, полученный раствор отбирали пипеткой с отбитым носиком и фильтровали через воронку с нейлоновым фильтром в другую пробирку. Взвесь клеток центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин. Супернатант сливали, осадок разводили ростовой средой, диспергировали и переносили на поверхность коллагеновой губки. Область пересадки окружали по краю водонепроницаемым барьером, стенки которого препятствовали растеканию раствора, основание барьера герметично крепили к интактной коже. В дальнейшем до полного восстановления кожи емкость-изолятор была постоянно заполнена ростовой средой, состоящей из смеси сред DMEM и F12 в отношении 3:1 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, гентамицнна, метронидазола и пефлоксацина. Смена среды осуществлялась 3 раза в сутки с соблюдением правил антисептики.

Изобретение относится к области медицины, в частности к экспериментальной медицине. Способ обеспечивает сокращение сроков восстановления кожного покрова, а также повышает эффективность использования растворов, защиту трансплантата от высыхания и механических повреждений. Проводят трансплантацию клеток на субстратном комплексе в виде губки на реципиентную поверхность с последующим воздействием на трансплантат питательной средой, при этом губку закрепляют на раневой поверхности и с областью повреждения заключают в изолятор, длительно и непрерывно заполненный периодически сменяемой культуральной средой, одномоментно губку инфильтрируют суспензией из мелких фрагментов кожи, а через 20 часов пересаживают аутоклетки эпидермиса и дермы и далее их культивирование проводят непосредственно на субстрате, закрепленном на реципиентной поверхности животного.

Способ восстановления кожного покрова, включающий трансплантацию клеток на субстратном комплексе в виде губки на реципиентную поверхность, с последующим воздействием на трансплантат питательной средой, отличающийся тем, что губку закрепляют на раневой поверхности и с областью повреждения заключают в изолятор, длительно и непрерывно заполненный периодически сменяемой культуральной средой, одномоментно губку инфильтрируют суспензией из мелких фрагментов кожи, а через 20 ч пересаживают аутоклетки эпидермиса и дермы и далее их культивирование проводят непосредственно на субстрате, закрепленном на реципиентной поверхности животного.