ФЛУПИРТИН ИЛИ ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМЫЕ СОЛИ - ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ИНДУЦИРОВАННЫМ АКТИВНЫМИ РАДИКАЛАМИ КИСЛОРОДА АПОПТОЗОМ ЛИМФОЦИТОВ Российский патент 2003 года по МПК A61K31/4425 A61P7/00 A61P37/00 

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к применению флупиртина или его фармацевтически приемлемых солей в качестве лекарственного средства для профилактики и лечения заболеваний, которые ассоциированы с повреждением клеток системы гемопоэза, например, лимфоцитов. В частности, изобретение относится к лечению больных СПИДом.

Уровень техники
Флупиртин является известным неопиатным анальгетиком центрального действия.

Механизм действия флупиртина сложный и отличается от механизма действия опиат/опиоидных анальгетиков (Nickel, В., Postgrad, Med. J. 63 (Suppl.3), 19 (1987); Szelenyi, I., Nickel, В., Borbe, H.О., Brune К., Br. J. Pharmacol. 143, 89 (1989)). Электрофизиологические исследования показали, что флупиртин может оказывать влияние как на супраспинальную, так и на спинальную области в ноцицептивных случаях (Carisson, К. H., Jurna, I., Eur. Pharmakol. 143, 89 (1987); Bleyer, H., Carisson К. H., Erkel, H. J., Jurna, I., Eur. J. Pharmacol. 151, 259 (1988); Nickel, В., Aledter, A., Postgrad Med. J. 63 (Suppl. 3) 41 (1987)).

Флупиртин применяют также в лечебных целях при острых болях, вызванных нарушением функций двигательного аппарата.

Флупиртин успешно применяют для лечения больных ревматизмом и другими дегенеративными заболеваниями.

Кроме хорошего анальгетического действия флупиртин вызывает расслабление мускулатуры и поэтому используется для снятия мышечных напряжений или лечения заболеваний, сопровождающихся мышечными напряжениями (DE 4022442).

Далее, при исследовании расслабляющего действия флупиртина на крысах было показано, что действие флупиртина ингибируется возбуждающей аминокислотой N-метил-D-аспартатом (NMDA). На основании данных по действию флупиртина как антагониста NMDA, флупиртин можно использовать для лечения заболеваний ЦНС, вызванных NMDA, например, церебральной ишемии, нейродегенеративных заболеваний, эпилептических припадков (DE 4327516).

Химическая формула флупиртина следующая: 2-амино-3-этоксикарбониламино-(п-фторбензиламино)-пиридин. Синтез флупиртина и его фармакологически приемлемых солей описан в патентах DE 1795858, DE 3133519 и DE 3416609.

Сущность изобретения
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что флупиртин обладает способностью ингибировать апоптоз клеток системы гемопоэза, например, лимфоцитов.

В связи с этим появилась возможность лечения заболеваний, ассоциированных с повреждениями клеток системы гемопоэза.

Особенное значение при этом имеет лечение ВИЧ-инфициированных пациентов/больных СПИДом.

В соответствии с этим, объектом изобретения является применение флупиртина или его фармацевтически приемлемых солей в качестве лекарственного средства для лечения и профилактики заболеваний, ассоцированных с индуцированным окислительным стрессом апоптозом лимфоцитов.

Для объяснения открытого авторами нового действия флупиртина необходимо провести фармакологические исследования.

Перечень фигур чертежей
Фиг.1
Инкубирование неинфицированных [о] и инфицированных ВИЧ-1 клеток СЕМ [•] в присутствии различных концентраций флупиртина. Приведены средние значения 10 параллельных экспериментов; значения стандартных отклонений - не выше 10%.

Фиг.2
Действие флупиртина на спонтанный апоптоз лимфоцитов, выделенных из крови неинфицированных испытуемых [незаштрихованные столбцы] и из крови пациентов, инфицированных ВИЧ-1 [заштрихованные столбцы]. Через один день клетки анализируют с помощью проточной цитометрии. Исследуют лимфоциты, выделенные из крови 12 инфицированных пациентов и 8 здоровых испытуемых; приведены средние значения и стандартные отклонения.

Фиг.3
Снижение гибели лимфоцитов вследствие индуцированного апоптоза после обработки флупиртином. Апоптоз MNZ неинфицированных испытуемых [незаштрихованные столбцы] и пациентов, инфицированных ВИЧ [заштрихованные столбцы] , индуцируют с помощью системы HX/XOD. Флупиртин добавляют в клетки за 6 ч до обработки системой, генерирующей радикалы кислорода. На следующий день клетки анализируют с помощью проточной цитометрии. Определяют количество клеток, погибших вследствие общего апоптоза, а затем из этой величины вычитают количество клеток, погибших вследствие спонтанного апоптоза. Таким образом рассчитывают величину индуцированного апоптоза. Исследуют лимфоциты 12 инфицированных больных и 8 неинфицированных испытуемых; приведены средние значения и стандартные отклонения.

Сведения, подтверждающие возможность использования изобретения
Фармакологические исследования
Материалы
Малеат флупиртина [2-амино-3-этоксикарбониламино-6-(п-фторбензиламино)-пиридин-малеат] ; для выделения препаратов гликопротеина ВИЧ-1-gp 120 используют вирус ВИЧ-1, штамм НТLV_IIIB (Ророviс et al., 1984). Чистота полученного препарата gр 120 по данным электрофореза в полиакриламидном геле составляет более 95% (Muller et al., 1988).

Определение противоретровирусной активности
Методика получения суспензии ВИЧ-1 описана (Sarin ei al., 1987). Клетки линии Т-лимфобластов СЕМ (концентрация при посеве: 1•10⁵ клеток/мл) суспендируют в среде и инфицируют ВИЧ-1 (штамм НТLV_IIIB). При этом используют 50-кратную дозу по отношению к инфекционной дозе, вызывающей инфицирование 50% клеток в культуре (CCID₅₀). CCID₅₀ - инфекционная доза, которая вызывает инфицирование 50% клеток в мл клеточной культуры. Образцы культур объемом 1 мл инкубируют в течение 5 дней. Флупиртин добавляют в культуру клеток в различных концентрациях за два часа до инфицирования. Число живых клеток определяют колориметрическим методом с использованием 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенилтетразолий бромида (МТТ) (Scudiero et al., 1988). Подсчет проводят с помощью ELISA-Ридера, согласно опубликованной ранее методике (Muller et al. , 1991). В процессе инкубирования на стадии деления число инфицированных клеток СЕМ увеличивается в 0,13 раз и неинфицированных СЕМ-клеток - в 2,16 раза.

Отбор крови
Пробы периферической крови отбирали [i] у 12 ВИЧ-1 инфицированных гомосексуальных мужчин (средний возраст: 35 лет; возраст (22-43 года), а также (ii) у 8 здоровых; ВИЧ-1 - серонегативных и с одинаковой степенью риска мужчин почти одинакового возраста (средний возраст: 30 лет; интервал: 23-35 лет). Больные были распределены по категориям, согласно классификации, рекомендованной CDC (Centers for Disease Control) (CDC, 1992). Исследование ВИЧ-1 сероположительных больных проводили, анализируя кровь бессимптомных вирусоносителей (CDC: А1, А2, среднее число клеток CD-4 - 407/мкл, интервал 209-698/мкл). Ни у одного из пациентов не обнаружено симптомов опухолевых заболеваний и инфекций, либо ни один из пациентов в течение 10 недель перед отбором крови не проходил курс лечения иммунодепрессантами, например, кортикостероидами.

Получение клеток и их обработка
Мононуклеарные клетки (MNZ) получают и обогащают из гепаринизированной крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности фикол-гипак (Rossol et al. , 1990). 0,5•10⁶ клеток культивируют в культуральной среде, конечный объем 500 мкл; в качестве среды используют среду MEM, состав среды - 10 мМ HEPES, 2,6% бикарбоната натрия, 100 ед/л пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10% фетальной сыворотки теленка (FKS) и 1 мМ глутамата. Полученные клетки обрабатывают соответствующим химическим веществом непосредственно после выделения.

Индуцирование апоптоза активным кислородом
Активные радикалы кислорода получают с использованием системы гипоксантиноксидазы (НХ) и ксантиноксидазы (XOD) (Bruck et al., 1994). MNZ суспендируют в течение 24 ч, общий объем суспензии составляет 500 мкл MEM среды (как описано ранее). В исходную смесь добавляют от 0 до 80 мЕд/мл XOD и 1 мМ НХ. При концентрации XOD 80 мЕд/мл (Sigma, Мюнхен, Германия) наблюдается апоптоз более 90% лимфоцитов. Если специально не оговорено, в последующих экспериментах используют следующие концентрации ферментов: 10 мЕд/мл XOD и 1 мМ НХ. В этих условиях наблюдается апоптоз приблизительно 50% клеток. Если речь идет об исследовании определенного соединения - потенциального ингибитора и/или стабилизатора гибели клеток вследствие апоптоза, целесообразно останавливать апоптоз на указанном уровне. Флупиртин добавляют к клеткам за 6 ч перед добавлением системы, продуцирующей радикалы кислорода, инкубацию завершают на следующий день.

Анализ клеток с помощью проточной цитометрии
Апоптоз измеряют в проточном цитометре FACScan (Becton-Dickinson) с аргоновым лазером при длине волны возбуждения 448 нм, согласно ранее опубликованной методике (Schmid et al., 1994). Лимфоциты идентифицируют оптическими методами и характеризуют с помощью двух типов светорассеяния - малоуглового рассеяния для измерения размера клеток (FSC) и светорассеяния под углом 90^oС для определения параметра состояния поверхности клеток (гранулярности) (SSC). Для окрашивания апоптозных MNZ клеток их инкубируют в присутствии 20 мкг/мл 7-аминоактиномицина D (7-AAD) (Sigma), растворенного в PBS, в течение 20 мин при 4^oС без доступа света. Клетки, находящиеся в окрашивающем растворе, анализируют с помощью проточного цитометра. Красную флуоресценцию, свойственную 7-AAD, удаляют с использованием фильтра с длиной волны 650 нм.

7-AAD проникает в апоптозные клетки в результате дезинтеграции клеточных мембран и образует окрашенный продукт с ДНК вследствие интеркаляции. Полученные результаты обрабатывают с использованием программы LYSIS II. Средние значения числа каналов преобразовывают в усредненную интенсивность флуоресценции, размер клеток и гранулярность.

Введение флуоресцентной метки in situ с использованием системы TdT и окрашивание поверхности клеток
Для определения субпопуляций клеток после стадии апоптоза клетки обрабатывают системой терминальной трансферазы (TdT), согласно методу (Gorczyca et al., 1993) с небольшими модификациями. Суспензию клеток промывают два раза PBS (Gibco), а затем фиксируют 1% раствором параформальдегида (Riedel de Haen) в течение 10 мин при 4^oС. Затем клетки промывают два раза PBS, к которому добавляют 5% АВ-сыворотки и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Далее клетки осаждают и ресуспендируют в 50 мкл 2,5 мМ растворе хлорида кобальта, к которому добавляют 0,5 нМ биотин-16-дУТФ и 25 ед TdT. В эту смесь добавляют буфер: 200 мМ какодилата калия, 25 мМ трис-НСl и 0,25 мг/мл BSA; полученную смесь инкубируют при 37^oС в течение 30 мин в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя (Boehringer Mannheim, Манхайм, Германия). Затем клетки два раза промывают PBS (5% АВ-сыворотки и 0,5% BSA) и ресуспендируют в 100 мкл забуференного окрашивающего раствора, содержащего 5 мкг/мл меченного флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) авидина (степень чистоты соответствует таковой для клеточного анализа). Для одновременного окрашивания поверхности клеток их дополнительно обрабатывают 20 мкг/мл моноклональными анти-СD3 антителами, меченными фикоэритрином (Becton-Dickinson). Флуоресценцию измеряют методом проточной цитометрии (Halliwell, 1987).

Результаты
Обработка флупиртином клеток СЕМ, инфицированных ВИЧ-1
Клетки СЕМ предварительно обрабатывают флупиртином в течение 2 ч и затем клетки оставляют неинфицированными или параллельно инфицируют ВИЧ-1. Через 5 дней в указанных культурах определяют количество клеток. Как показано на фиг. 1, концентрация клеток как в неинфицированных, так и в инфицированных культурах не зависит от обработки флупиртином (Р>0,1).

Флупиртин добавляют к культурам до конечной концентрации в интервале от 0,1 до 30 мкг/мл. Концентрация клеток в неинфицированных культурах составляет 446,880±31,020 клеток/мл, в ВИЧ-1 инфицированных культурах - 108,420±6,710 клеток/мл.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что флупиртин не токсичен по отношению к клеткам, но также не оказывает никакого влияния на ВИЧ-1 инфекцию in vitro в указанных условиях инкубации.

Подбор условий использования системы гипоксантин/ксантин-оксидаз
Концентрацию ксантиноксидазы (XOD) выбирают таким образом, чтобы степень апоптозных клеток в процентном отношении составляла приблизительно 50%.

Интенсивность флуоресценции апоптозных клеток составляет более 10 каналов флуоресценции. При концентрации XOD, равной 0 мЕд, только 6,6±2,1% клеток обладают интенсивностью флуоресценции выше указанной "линии отсечения" (более 10 каналов флуоресценции), то есть 6,6% клеток являются апоптозными. При увеличении концентрации XOD степень апоптозных клеток в процентном отношении также увеличивается и при 80 мЕд XOD количество апоптозных клеток достигает 93,2±6,8%. При 10 мЕд XOD количество апоптозных клеток составляет 50% (точно - 54,6±6,1%).

В отсутствие XOD для клеток характерно следующее распределение величин параметров FSC/SSC:
Размер клеток 349±27 (каналов флуоресценции) и гранулярность - 112±15. При концентрации фермента 80 мЕд размер клеток уменьшается и достигает значения 256±22, в то время как гранулярность увеличивается до 180±29. Такие изменения свидетельствуют о характерном апоптозе в соответствии с морфологическими изменениями клеток. При 10 мЕд XOD распределение клеток находится в середине обнаруженного ранее экстремального диапазона значений. Если специально не оговорено, концентрация фермента XOD составляет 10 мЕд.

Действие флупиртина на спонтанный апоптоз лимфоцитов человека
MNZ периферической крови как здоровых, так и инфицированных ВИЧ-1 больных исследуют, принимая во внимание спонтанный апоптоз. Клетки анализируют на следующий день после отбора крови у испытуемых. Как указано на фиг.2, в случае неинфицированных пациентов количество апоптозных клеток MNZ составляет 6,32±0,82%, в то время как у инфицированных ВИЧ-1 пациентов эта величина составляет 28,42±7,84% клеток. MNZ обеих групп обрабатывают флупиртином в течение 24 ч при различных концентрациях от 0,1 до 30 мкг/мл. Как указано на фиг. 2, флупиртин незначительно влияет на степень спонтанного апоптоза лимфоцитов (Р>0,1). То же самое имеет место в отношении апоптозных клеток как здоровых испытуемых, так и инфицированных ВИЧ-1 пациентов.

Снижение индуцированного апоптоза мононуклеаров при обработке флупиртином
Для индукции апоптоза MNZ как здоровых испытуемых, так и инфицированных ВИЧ-1 пациентов обрабатывают системой HX/XOD (образование радикалов кислорода). В суспензию клеток за 6 ч до индукции апоптоза добавляют флупиртин в различных концентрациях. Как указано на фиг.3, флупиртин в концентрации от 0,1 до 3,0 мкг/мл вызывает значительное снижение апоптозной гибели клеток (Р<0,001). При обработке флупиртином в концентрации 10 мкг/мл значительное защитное действие на лимфоциты наблюдается лишь в случае инфицированных испытуемых. При обработке флупиртином в концентрации от 0,3 до 3,0 мкг/мл наблюдаются наиболее значительные защитное действие и торможение индуцированного апоптоза. Снижение индуцированного апоптоза в образцах лимфоцитов здоровых испытуемых составляет 40%, а в образцах инфицированных пациентов - 60%.

Апоптоз лимфоцитов подтверждают анализом фрагментов ДНК. После инкубирования клеток в присутствии системы HX/XOD ДНК экстрагируют и проводят разделение фрагментов ДНК по размерам в агарозном геле с последующим блоттингом. На электрофореграмме выявляются фрагменты, содержащие 180 пар оснований или кратные им по величине. Такой набор фрагментов в виде "ступенек" характеризует фрагментацию ДНК, которая происходит в результате апоптоза (Wyllie, 1980). При обработке клеток флупиртином в концентрации 1 мкг/мл фрагментации ДНК не наблюдается.

Достоверные результаты анализа дот-блота также представлены и демонстрируют влияние флупиртина на клетки как при спонтанном, так и при индуцированном апоптозе. Для проведения указанной серии экспериментов индуцируют апоптоз MNZ в присутствии HX/XOD системы. В этих условиях в отсутствие флупиртина апоптоз клеток составляет 64,2±7,9%. Если клетки были обработаны флупиртином в течение 24 ч, то наблюдается уменьшение числа апоптозных клеток на 18,3±5,8%.

Полученные результаты однозначно свидетельствуют о том, что флупиртин является перспективным лекарственным средством, например, для лечения индуцированного апоптоза лимфоцитов у больных СПИДом.

В патенте DE-OS 4327516 описано нейрозащитное действие флупиртина, например, при церебральной ишемии, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, инфекционно индуцированных нейродегенеративных заболеваниях, таких как, например, при СПИД-энцефалопатии или болезни Крейтцфельда-Якоба.

СПИД-энцефалопатия с прогрессирующим слабоумием является признаком неврологического осложнения при заболевании СПИДом. Например, одной из причин возникновения СПИД-энцефалопатии считают индуцированное ВИЧ (gр120) выделение нейротоксинов NMDA-агонистического действия, например, хинолиновых кислот из инфицированных макрофагов, что в свою очередь приводит к некрозу нервных клеток.

СПИД-энцефалопатия и СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита) относятся к различным системам органов. Первое заболевание связано, как уже отмечалось, с неврологическими осложнениями при СПИДе (апоптоз нервных клеток), в то время как второе заболевание представляет собой "приобретенную иммунонедостаточность", которая ассоциирована с нарушением функционирования иммунной системы, выраженным снижением числа Т-хелперных клеток (апоптоз клеток основной составляющей системы гемопоэза).

Согласно изобретению, действие флупиртина заключается в подавлении индуцированного апоптоза клеток гемопоэтической системы, например, лимфоцитов. Такое действие является достаточно неожиданным, так как до настоящего времени не было доказано существование NMDA рецепторов вне центральной нервной системы. В связи с этим для специалистов не было оснований предполагать защитное действие флупиртина не только по отношению к нервным клеткам, но и к клеткам системы гемопоэза.

Согласно изобретению, к другим заболеваниям, для профилактики и лечения которых можно применять флупиртин, относятся, например, следующие: заболевания, вызванные применением медикаментов (таких, как цитостатики и кортикостероиды), а также заболевания, вызванные отравляющими веществами, облучением, и другие заболевания, индуцирующие нейтропению/лимфоцитопению, заболевания, вызванные медикаментами, или инфекции (например СПИД), индуцирующие тромбоцитопению.

Флупиртин можно использовать для профилактики и лечения известным способом в виде следующих лекарственных форм: таблетки, таблетки с пленочным покрытием, твердые желатиновые капсулы, мягкие желатиновые капсулы, гранулы, драже, свечи, микрокапсулы, водные или масляные суспензии, раствор в масле, растворы для внутримышечного введения, растворы для внутривенного введения. Приемлемыми солями для приготовления лекарства являются все физиологически устойчивые соли флупиртина, например, гидрохлорид, малеат, сульфат и глюконат флупиртина.

Согласно изобретению содержание флупиртина в лекарственном препарате составляет от 0,1 до 3000 мг, предпочтительно от 10 до 500 мг. Указанные разовые дозы лекарства можно принимать 1-5 раз в день, предпочтительно 1-3 раза в день.

Дозировку всегда относят к основной форме флупиртина. Если назначают соли флупиртина, то следует провести перерасчет в соответствии с молекулярным весом. Согласно изобретению, приготовление фармацевтических и галеновых препаратов проводят по общепринятым стандартным методикам. Например, тщательно смешивают флупиртин и носитель и/или вспомогательное вещество с помощью перемешивания или гомогенизации, причем обработку ведут при температуре от 20 до 80^oС, предпочтительно от 20 до 50^oС.

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии. Предложено новое лекарственное средство для лечения или профилактики заболеваний, связанных с индуцированным активными радикалами кислорода апоптозом лимфоцитов, в частности, СПИДа. Средство представляет собой флупиртин или его фармацевтически приемлемые соли в качестве фармацевтической композиции. Изобретение расширяет арсенал средств заявленного назначения. 1 з.п.ф-лы, 3 ил.

1. Применение флупиртина или его фармацевтически приемлемых солей в качестве лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний, связанных с индуцированным активными радикалами кислорода апоптозом лимфоцитов. 2. Применение флупиртина или его фармацевтически приемлемых солей по п. 1, отличающееся тем, что заболевание представлено СПИДом.