КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ СПИДА, ИЛИ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКИ, ИЛИ СВЯЗАННЫХ С НИМИ НАРУШЕНИЙ Российский патент 1999 года по МПК A61K38/16 

Данное изобретение относится к области профилактики и лечения синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), системной красной волчанки (СКВ) и связанных с ними заболеваний. (Используемые далее заголовки и обозначения не являются ограничивающими данное изобретение).

Предшествующий уровень техники
В последние пятнадцать лет основные исследования во многих странах были направлены на разработку эффективных вакцин и методов лечения СПИДа, однако достигнуты весьма скромные успехи. СПИД является заболеванием, возникающим в результате хронического инфицирования, вызванного вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). По меньшей мере десять миллионов человек во всем мире и по меньшей мере один миллион человек в США инфицированы СПИДом. Широко признано, что ВИЧ является причиной СПИДа, но до сих то, как именно ВИЧ инфицирование приводит к СПИДу, является объектом активных научных исследований является. Проводящиеся в настоящее время исследования по разработке вакцины для профилактики СПИДа до сих пор основаны на попытках усиления иммунного ответа на ВИЧ, однако они пока не привели к получению необходимого эффекта. Имеются тысячи публикаций, описывающие попытки разработок методов лечения и вакцин путем стимулирования иммунной системы к распознаванию и разрушению вируса. Главной проблемой оказалось то, что ответ антител и цитотоксических T-клеток, стимулированных прототипами вакцин, не позволял защитить ни от ВИЧ инфицирования, ни от прогрессирования заболевания СПИДом из-за высокого уровня мутации ВИЧ.

Был разработан ряд препаратов для лечения СПИДа (главным образом, противовирусные препараты с тем же способом действия, что и у 3'-азидо-3'-диокситимидина, АЗТ), но ни один из них не продемонстрировал возможность по предотвращению развития СПИДа после ВИЧ инфицирования. Основная проблема заключается в том, что ВИЧ быстро мутирует, приводя к изменению в вирусно закодированных белках, являющихся мишенью противовирусных лекарственных препаратов, что приводит к быстрому развитию лекарственной невосприимчивости.

Системная красная волчанка (СКВ) является заболеванием, которое рассматривается обычно как абсолютно не связанное со СПИДом. СКВ является аутоиммунным заболеванием и поражает, главным образом, женщин. В США более полмиллиона женщин страдают СКВ в формах от умеренных до тяжелых. СКВ является аутоиммунным заболеванием со многими иммунологическими аномалиями, такими как лимфоаденопатия, гипергаммаглобулинемия, лейкопения, отложение комплексов антиген-антитело и антител, приводящих к хроническим распространенным поражениям соединительной ткани от умеренной до тяжелой формы, проявляющимся в виде кожной сыпи, артральгии, артрита, анемии, повреждений внутренних органов, неврологических проявлений, жара и других системных симптомах. Симптомы изменяются по интенсивности в течение многих лет и СКВ обычно лечат иммуносупрессивными лекарственными препаратами, от нестероидных противовоспалительных препаратов до иммуносупрессивных стероидов, но они не дают эффективного лечения. СКВ может быть результатом иммунной активации, запущенной с помощью ретровируса, однако никакие ретровирусы, проявляющие себя как вызывающие СКВ, не были идентифицированы. В GB 9411534.2, поданном Holms R. D. 8-го июня 1994 г., описано, как ВИЧ индуцирует аутоиммунный механизм, напоминающий таковой при СКВ, который, в конечном счете, приводит к СПИДу.

Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение основывается на избирательном уменьшении некоторых иммунных ответов на ВИЧ путем применения пептидов белков человека, в частности, белка человека, называемого эзрин, что является новым и неочевидным решением проблемы профилактики и лечения СПИДа. Некоторые исследователи описали аутоиммунитет, связанный с ВИЧ инфицированном, однако ими не установлено, что ВИЧ индуцированный аутоиммунитет является непосредственной причиной СПИДа. Настоящее изобретение основано на открытии автором молекулярного механизма ВИЧ индуцированного аутоиммунитета, приводящего к СПИДу, и аналогии между ВИЧ индуцированным заболеванием и аутоиммунным заболеванием, таким как системная красная волчанка (СКВ). Настоящее изобретение относится к препаратам, ингибирующим приводящие к СПИДу и СКВ аутоиммунные процессы путем индукции некоторых видов иммуносупрессии или иммунной толерантности. В GB 9411534.2, поданном Holms R.D. 8-го июня 1994 г., описаны методы лечения и вакцины для лечения и профилактики СПИДа, основанные на этом новом аутоиммунном механизме, индуцированном ВИЧ.

Заявитель высказывает предположение, что как раз перед началом эпидемии СПИДа, ВИЧ приобрел небольшой кусочек ДНК человека, что позволило ему развить специфический механизм для более эффективной репликации путем активирования иммунной системы человека. К сожалению, производные этой человеческой последовательности, закодированные в ВИЧ, не только активируют систему, но также индуцируют аутоиммунитет и апоптоз. Когда пептид, принадлежащий вирусу, в комплексе с определенными типами ГКГ, видится как достаточно чужеродный для индукции иммунного ответа, и обладает достаточной гомологией с человеческими пептидами для активации Т-клеток. Последние могут распознавать как вирусные, так и человеческие антигены, что может спровоцировать серьезную опасность в виде хронического аутоиммунного ответа. Этот тип молекулярной мимикрии был постулирован для индукции некоторых аутоиммунных заболеваний, включая рассеянный склероз. Иммунная система млекопитающих также имеет тенденцию к сильной активации чужеродными антигенными пептидами, которые очень похожи, но не такие как собственные антигены.

Последовательность аминокислот ВИЧ
NH₂ThrLysAlaLysArgArgValVaIGluArgGluLysArgCOOH, в положениях от 498 до 510 (в консервативной части C4) по карбоксильному концу ВИЧ gp120 (предсказанная альфа-спиральная область) закодирована между прямыми повторениями предполагаемого передвижного элемента и становится новым добавлением ДНК человека к вирусу. Область gp120 у человека является иммунодоминантной и у некоторых индивидуумов ответственна за синтез до 70% всех антител, генерируемых к вирусу, хотя антитела и не являются вирус-нейтрализующими. Пептид, принадлежащий этой области, также является ГКГ класса I-рестриктированным эпитопом для индукции цитотоксических T лимфоцитов (ЦТЛ). Последовательность во всех изолятах ВИЧ-1 и ВИЧ-2 сохраняется на фоне высокой частоты мутаций (она даже более стабильна, чем CD4 связующий сайт), но отличается от эквивалентной SIV последовательности.

Эта последовательность 13 аминокислот ВИЧ
NH₂ThrLysAlaLysArgArgValVaIGluArgGluLysArgCOOH, вероятно, является эпитопом для индукции аутоиммунитета, поскольку она обладает высокой степенью гомологии (50% или более) с некоторыми человеческими последовательностями. Аминокислотные последовательности ВИЧ, мимикрирующие под человеческие последовательности, называются автором Virus Homologous Peptide (далее обозначается как VHP), а вышеуказанная ВИЧ аминокислотная последовательность называется автором VHP1. Группа последовательностей аминокислот человека, принадлежащих эндогенным белкам человека, под которые мимикрирует вирус, называется автором Human Endogenous Peptide (далее обозначается как HEP).

Хотя автор и предлагает следующий новый иммунологический процесс для описания механизма действия этих пептидов человека (HEP), следующий иммунологический процесс служит только для иллюстрации изобретения, но не должен восприниматься как ограничивающий его каким-либо образом.

Автор предполагает, что существует механизм положительной селекции для ВИЧ мутантов, который сохраняет ВИЧ последовательность VHPI (NH₂ThrLysAlaLysArgArgValVaIGluArgGluLysArgCOOH) в положении от 498 до 510 (консервативная C4 область) в C-концах gp120 ВИЧ. Эта последовательность сохраняется, потому что, когда она представлена некоторыми молекулами ГКГ класса 1 (в частности, ГКГ класса 1 B8 и ГКГ класса 1 B35) и большей частью молекул ГКГ класса II DR, то это является очень важным для индуцирования большого числа активированных Т-клеток, в которых происходит ВИЧ инфицирование и ВИЧ рекпликация. К сожалению, активированные CD4+ Т-клетки умирают или быстро погибают после активации VHPI, и популяция CD8+ Т-клеток, активированных VHPI, повышает уровень аутореактивных ответов. Возможно, сочетание обоих иммунологических процессов приводит к СПИДу.

Результатом хронического ВИЧ инфицирования является длительная презентация VHPI, продуцируемых ВИЧ, и длительная стимуляция иммунной системы. Хотя присутствие активированных Т-клеток является важным фактором для ВИЧ репликации, ВИЧ только инфицирует и убивает небольшое количество VHPI активированных Т-клеток. Большинство активированных Т-клеток умирает в результате гиперстимуляции VHPI или разрушается путем включения механизма отрицательной обратной связи в иммунной системе, включая аутореактивные Т-клетки. Т-клетки постоянно продуцируются организмом для восполнения потерь у хронически инфицированного ВИЧ пациента, но конечным результатом является постепенное истощение CD4+ T-клеток в течение нескольких лет.

Автор также предполагает, что длительная презентация VHP пептида некоторыми молекулами ГКГ класса 1 из ВИЧ инфицированных клеток нарушает толерантность иммунной системы организма-хозяина к собственным пептидам, таким, которые являются производными эзрина и других HEP, представленных на активированных T и B-клетках. Общий уровень активации приводит к стимуляции аутореактивных цитотоксических T-клеток и хронической активации В-клеток с чрезмерным продуцированием ряда антител, включая антитела к аутоантигенам. Ключевой стадией в активации аутоиммунного процесса у ВИЧ инфицированных индивидуумов является стимуляция аутореактивных CD8+ клеток, которые экспрессируют T-клеточные рецепторы (ТКР), распознающие как VHP, так и HEP.

Объектом настоящего изобретения является профилактика и лечение СПИДа и СКВ и связанных с ними нарушений путем индукции специфической иммунологической толерантности, которая ингибирует вышеуказанный патологический механизм. Объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая фармацевтическое количество очищенного пептида или смеси двух или более различных пептидов, длиной до тридцати аминокислот, или производных молекул с дополнительными химическими группами, присоединенными к таким пептидам, содержащих аминокислотную последовательность с по меньшей мере 50%-ной гомологией более чем четырнадцати, последовательных аминокислот со следующей последовательностью аминокислот человека:
NH₂ThrGluLysLysArgArgGluThrVaIGluArgGluLysGIuCOOH (последовательность четырнадцати аминокислот обозначается далее как HEP1), и очищенного пептида или смеси двух или более различных пептидов, длиной до тридцати аминокислот, или производных молекул с дополнительными химическими группами, присоединенными к таким пептидам, содержащих аминокислотную последовательность по меньшей мере пяти последовательных аминокислот со 100%-ной 20 гомологией с HEP1. Следующим объектом изобретения является очищенный пептид, содержащий последовательность четырнадцати аминокислот НЕР1. Следующим объектом изобретения является получение составляющих пептидов и пептидных производных с по меньшей мере 50% гомологией более чем четырнадцати последовательных аминокислот с HEP1, и очищенного пептида или смеси двух или более различных пептидов длиной до тридцати аминокислот или производных молекул с дополнительными химическими группами, присоединенными к таким пептидам, содержащих аминокислотную последовательность по меньшей мере пяти последовательных аминокислот со 100%-ной гомологией с HEP1, для профилактики и лечения СПИДа и связанных с ним заболеваний, которые ингибируют in vivo у человека, частично или полностью, вирус ВИЧ, что определяется либо in vitro исследованием ВИЧ p24 антигена, либо in vitro исследованием ВИЧ инфекциозности. Следующим объектом изобретения является получение составляющих пептидов и пептидных производных, с, по меньшей мере, 50% гомологией более чем четырнадцати последовательных аминокислот с HEP1, и очищенного пептида или смеси двух или более различных пептидов длиной до тридцати аминокислот или производных молекул с дополнительными химическими группами, присоединенными к таким пептидам, содержащих аминокислотную последовательность по меньшей мере пяти последовательных аминокислот со 100%-ной гомологией с HEP1, для профилактики и лечения СПИДа и связанных с ним заболеваний, и для профилактики и лечения системной красной волчанки и связанных с ней заболеваний, которые ингибируют in vivo у человека, частично или полностью, аутоиммунные или аутореактивные ответы, измеряемые in vitro методом T-клеточной пролиферации.

Близкое сходство между чужеродными VHP1 и собственными HEP1, когда они представлены некоторыми молекулами ГКГ, и возможная иммунорегуляторная роль HEP1 в здоровой иммунной системе, приводит к сильным стимулирующим сигналам, передающимся через иммунную систему в процессе ВИЧ инфицирования. Введение HEP1 в количестве, выше порогового для индукции иммунологической толерантности, вызовет блокирование VHPI опосредованной активации иммунной системы ВИЧ инфицированными T-клетками. Клинические результаты введения HEP1, предсказанные вышеописанной моделью ВИЧ индуцированного аутоиммунитета, свидетельствуют о понижении уровня иммунной активации, повышении содержания CD4 T-клеток и о падении уровня хронического ВИЧ инфицирования (фиг. 1).

Фиг. 1, озаглавленная "Иммунная активация и ВИЧ инфицирование", является схематической диаграммой, показывающей, как ВИЧ инфицированные CD4+ клетки активируют другие CD4+ и CD8+ 30 клетки с помощью презентации VHP на ГКГ молекулах. Меньшая часть CD4+ T-клеток, активированных в этом процессе, затем инфицируется ВИЧ, тогда как основная часть CD4+ T-клеток оказывается чрезмерно стимулированной и умирает. Некоторые из активированных CD8+ T-клеток являются аутореактивными и активируют аутоиммунный процесс, который убивает или подавляет активированные T-клетки, экспрессирующие HEP. Введение HEP1 блокирует процесс активации ВИЧ индуцированных T-клеток и ингибирует хроническое ВИЧ инфицирование.

Фиг. 2, озаглавленная "Ингибирование ВИЧ in vivo путем перорального введения HEP1 пациенту ПП", является графическим представлением данных стандартного клинического испытания по примеру 2 (данные на первый день испытания приняты за 100). На графике показан результат перорального введения HEP1: уменьшение количества частиц ВИЧ, как определено уровнем p24Ag, уменьшение ВИЧ инфекциозности, как определено исследованием TCID, и общее падение количества белых телец (уменьшение иммунной активации).

Фиг. 3, озаглавленная "Улучшение иммунного статуса путем подкожного введения HEP1 пациенту ПП in vivo", является графическим представлением данных стандартного клинического испытания по примеру 2 (данные на первый день испытания приняты за 100). На графике показан результат однократного подкожного введения большого количества HEP1: резкое возрастание CD4+ и CD8+ T-клеток.

Подробное описание изобретения
Индукция иммунологической толерантности пептидами, связанными с HEP1, и профилактика и лечение СПИДа
Неочевидное сходство между ВИЧ аминокислотной последовательностью; NH₂ThrLysAlaLysArgArgValVaiGluArgGluLysArgCOOH, положение от 498 до 510 (консервативная область C4) у C-конца ВИЧ gp120 (VHP1), и последовательностью в белках человека было исследовано с помощью компьютерного поиска на основе базы данных SwissProt белковых последовательностей (документ 25). Автор установил, что VHP1 обладает 70% гомологией последовательности по отношению к эволюционно сохраненному белку человека, называемому эзрин, между положениями 324-337 эзрина. Результат поиска для гомологии представлен в табл. 1.

Автором сделано неожиданное открытие, что девять из четырнадцати аминокислот были идентичны при сравнении ВИЧ аминокислотной последовательности в положениях между 498 и 510 gpl20 и аминокислотной последовательности белка человека ээрина в положениях между 324 и 337. Из предшествующего уровня техники не очевидно, что данная область является важной для иммунной регуляции.

Последовательность четырнадцати аминокислот HEP1, NH₂ThrGluLysLysArgArgGluThrVaIGluArgGluLysGIuCOOH, идентична аминокислотной последовательности между положениями 324 и 337 эзрина человека. Публикации, описывающие связанные с HEP1 пептиды у человека, отсутствуют.

Эзрин, белок человека, связывающий тубулин, был обнаружен в цитоплазме T-клеток и он фосфорилируется тирозинкиназой в процессе активации T-клеток. Эзрин известен также как Р81, цитовиллин или виллин-2, является белком, состоящим из 585 аминокислот. Гомология распространяется за предопределенную альфа-спиральную область эзрина и является смежной к сайту тирозинфосфорилирования 353. Ээрин является частью семейства связанных с ээрином белков, в которое входят эзрин, радиксин, моэзин и мерлин. Все эти белки объединяет область, которая показывает сходство с gpl20, но эзрин обладает более значительной гомологией с 9/13 идентичностями. Хотя эзрин ведет себя в T-клетках как растворимый белок и кажется диффузионно цитоплазматическим при иммунофлуоресцентном окрашивании, полагают, что критическая популяция эзрина связана с субмембранными кортикальными частями цитоскелетов (Identification of Ezrin as an 81-kDa Tyrosine-phosphorylated protein in T cells Egerton M., Burgess W. H., Chen D., Druker B.J., Bretsher A., Samelson L.E. The Journal of Immunology 1992 149: 1847-1852). Для аутоиммунной патологии СПИДа также может быть важным и то, что обнаружено, что эзрин локализуется в ядрах микроворсинок актиновых микрофиломентов в щеточной каемке кишечного эпителия, а также в нейронах. В кишечном эпителии, в ответ на стимуляцию, эзрин участвует в изменении клеточной мембранной морфологии (Identification of the Two Major Epidermal Growth factor-induced Tyrosine Phosphorylation Sites in the Microvillar Core Protein Ezrin, Krieg J., Hunter T., Journal of Biological Chemistry 1992 267: 19258-19265).

Кроме эзрина, другие белки человека (собственные) также обладают более слабой первичной гомологичной последовательностью с VHP1; они включают Heat shock белок 89, белок NK-TR, T- комплексный белок, адренергический рецептор типа 2, креатинкиназу, ингибитор трипсина, альдегиддегидрогеназу, опиоидный 20 рецептор (каппа), рецептор глицина (цепь альфа-2) и рецептор рианодина. Мышиный гистон Н2В (очень похожий на человеческий гистон H2B) также обладает гомологией.

Объектом данного изобретения является то, что индукция толерантности может быть использована для выключения иммунной активации и аутоиммунитета, индуцированного ВИЧ, для предотвращения и лечения ВИЧ инфицирования и СПИДа. Данное изобретение относится к вакцине против СПИДа, включающей толерогенную дозу (значительно большую, чем пороговая доза, достаточная для стимуляции иммунного ответа) пептида с фармакологической степенью очистки или смеси двух или более различных пептидов с длиной до 30 аминокислот или производных молекул с дополнительными химическими группами, присоединенными к таким пептидам, содержащих аминокислотную последовательность по меньшей мере со 50%-35 ной гомологией более, чем четырнадцати последовательных амино кислот с HEP1, и очищенного пептида или смеси двух или более различных пептидов длиной до тридцати аминокислот или производных молекул с дополнительными химическими группами, присоединенными к таким пептидам, содержащих аминокислотную последовательность по меньшей мере пяти последовательных аминокислот со 100%-ной гомологией с HEP1, или любое их сочетание или подобные им пептиды. Предпочтительным путем введения является пероральный, хотя равным образом возможно достигнуть толерантности с помощью подкожных, внутривенных или внутримышечных введений стандартными методами. Одним аспектом данного изобретения является то, что пептидная вакцина на основе HEP1 может быть введена для профилактики и лечения СПИДа и ВИЧ инфицированных людей с помощью индукции толерантности к VHP последовательности. Другим аспектом данного изобретения является то, что пептидная вакцина на основе HEP1 может быть введена для лечения и профилактики СКВ у людей путем индукции толерантности к другим HEP последовательностям.

Осуществления изобретения
Пептиды, используемые для толерогенной вакцины, могут быть синтезированы, например, с помощью твердофазного метода, применяя либо Boc, либо Fmoc химию, или другим практическим путем для пептидного синтеза, известного специалистам по пептидному синтезу. После синтеза пептиды пропускают через смолу (по твердофазному методу) и подвергают снятию защитных групп с помощью трифторметансульфоновой кислоты или фтористого водорода или других средств. Пептиды могут быть обессолены с помощью колоночной хроматографии и очищены с помощью ВРЖХ. Степень очистки пептидов может быть продемонстрирована путем ВРЖХ с обращенной фазой или путем автоматического секвенирования. Не ограничивая возможные составы вакцин или способы лечения, предпочтительная композиция содержит пептид или пептиды, растворенные либо в стерильном фармацевтическом физиологическом растворе, либо в дистиллированной воде до конечной концентрации между 1 и 1000 мг/мл. Перед каждым использованием состав может быть подвергнут обработке с получением свежеприготовленного препарата, либо может храниться до 30 дней при -20^oC (см. примеры 1 и 2).

Методы использования изобретения
Индукция иммунологической толерантности при пероральном или подкожном введении растворов пептидов успешно достигалась в различных экспериментах на животных. Иммунологическая толерантность, индуцируемая пептидами, может протекать либо при индукции пептидами анергии T-клеток (прямое подавление), либо при индукции популяции супрессорных T-клеток (непрямое подавление). Специалистам в области индукции иммунологической толерантности известны способы индукции толерантности у животных путем перорального, подкожного, внутривенного или внутримышечного введения небольших пептидов, входящих в состав перекрестно реагирующих антигенов. Примеры таких способов были описаны в следующих публикациях:
Could specific oral tolerance be a therapy for autoimmune disease, Stephen H., Thompson G., Staines N.A., Immunol. Today 1990 II: 396-399
Induction of immunity and oral tolerance with polymorphic class II major histocompatibility complex allopepetides in the rat, Sayegh M.H., Khoury S. J. , Hancock W.W., Weiner H.L., Carpenter C.B., Proc Nati Acad Sci USA 1992 89: 7762-7766
Oral tolerance in experimental autoimmune encephalomyelitis, Whitacre C. C., Gienapp I.E., Orosz C.G., Bitar D.M., The Journal of Immunology 1991 147 2155-2163
Prevention of experimental autoimmune myasthenia gravis by manipulation of the immune network with a complementary peptide for the acetylcholine receptor, Araga S. , LeBoeuf R.D., Blalock J.E., Proc Nati Acad Sci USA 1993 90: 8747-8751
Preipheral N-cell tolerance induced in native and primed by subcutaneous injection of peptides from the major cat allergen Feldl, Briner T.J., KuoM., Keating K.M., Rogers B.L., Greenstein J.L., Proc Nati Acad Sci USA 1993 90; 7608-7612
Два фактора являются важными для индукции толерантности: высокая доза растворимого пептидного антигена и отсутствие каких-либо ко-стимулирующих частиц или вспомогательных агентов. Обычно иммунологическая активация протекает при значительно меньших дозах пептидного антигена, чем указанная выше пороговая доза, при которой пептидный антиген индуцирует толерантность или ингибирование иммунного ответа (например, у человека очень маленькая доза в 10 нг небольшого чужеродного пептидного антигена может индуцировать сильный иммунный ответ, тогда как 10 миллиграммовая доза может ингибировать иммунный ответ). Уровень доз для индукции толерантности варьируется для различных пептидов, однако количество или концентрация может быть определена экспериментально. Подкожное введение пептидов приводит к конечной концентрации пептидов в 50-100 раз выше, чем при пероральном пути, и поэтому толерантность может быть достигнута при меньшем количестве пептида, чем при пероральном пути введения. В том случае, когда раствор пептида предназначен для введения путем инъекции, раствор пептида должен быть стерильно профильтрован для удаления частиц и каких-либо микробиологических загрязнений.

Объектом изобретения является то, что предпочтительные дозы составляют от 1 мг до 5000 мг пептида с фармацевтической степенью очистки или смеси двух или более различных пептидов, длиной до тридцати аминокислот, или производных молекул с дополнительными химическими группами, присоединенными к таким пептидам, содержащих аминокислотную последовательность с по меньшей мере 50% гомологией более, чем четырнадцати последовательных аминокислот с HEP1, и очищенного пептида или смеси двух или более различных пептидов длиной до тридцати аминокислот или производных молекул с дополнительными химическими группами, присоединенными к таким пептидам, содержащим аминокислотную последовательность по меньшей мере пяти последовательных аминокислот со 100%-ной гомологией с HEP1 или любое их сочетание или подобные им пептиды.

Хотя теоретически возможно ожидать индуцирования толерантности с пептидами на основе какой-либо ВИЧ аминокислотной последовательности, существует большая опасность того, что защитный иммунный ответ против ВИЧ может быть ингибирован. Существует также определенная опасность, связанная с вводимыми пептидами на основе VHP1, для индуцирования иммунологической толерантности так как неправильная доза пептидов на основе VHP1 может обострить заболевание путем усиления иммунной активации. Преимуществом данного изобретения является то, что введение пептидов на основе последовательности аминокислот человека, вероятно, значительно безопаснее, чем пептидов, основанных на ВИЧ аминокислотной последовательности.

Следующие примеры служат только для иллюстрации изобретения и не должны расцениваться как ограничивающие его каким-либо образом.

Пример 1.

Модель in vitro VHP1-индуцированного аутоиммунитета в клетках человека от неинфицированных доноров
Материалы и методы
Пептидный синтез
Пептид VHP1 и контрольный пептид, используемые в данном исследовании, были синтезированы путем твердофазного метода с применением Fmoc химии. Они были пропущены через смолу и подвергнуты снятию защитных групп с помощью трифторметансульфоновой кислоты. Пептиды были обессолены на колонке P-10 в PBS (pH 7,3). Гомогенность пептидов была определена путем ВРЖХ с обращенной фазой. Пептиды были секвенированы с помощью автоматической деградации Эдмана с применением газофазной секвенции и было показано, что их чистота составляет >95%. Были синтезированы следующие пептиды:
Последовательность 13 аминокислот VHPI, относящихся к ВИЧ:
NH₂ThrLysAlaLysArgArgValVaIGluArgGluLysArgCOOH
Контрольная последовательность 14 аминокислот:
NH₂LeuGluAspArgArgAlaAlaValAspThrValCysArgAlaCOOH
Доноры
Все доноры, вызвавшиеся для данного испытания, были ВИЧ-негативными. Фенотип ГКГ доноров был определен до начала эксперимента. Количество подтипов категорий A, B и C фенотипа ГКГ класса 1 и количество подтипов категорий DR, DP и DQ фенотипа ГКГ класса 2 представлены в табл. 2.

Рост короткоживущих VHP1 индуцированных культур.

У 8 ВИЧ серонегативных индивидуумов, вызвавшихся быть донорами в испытаниях, были выделены мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК). Четыре донора FM, SW, WW, JMC (Trigger+) были положительными либо для ГКГ B35, либо для B8, и четыре донора TМ, JF, KB, ML (Trigger-) были отрицательными для ГКГ B35 или для B8. МКПК (10⁶/мл) от каждого из доноров были инкубированы в присутствии VHP1 или контрольного пептида при 100 нг/мл в течение 4-8 часов для получения клеток-эффекторов. В качестве контроля служили облученные МКПК, не стимулированные VHP1.

Цитотоксическое исследование
Короткоживущие VHP1 индуцированных культуры аутореактивных T-клеток (эффекторные клетки) были исследованы на цитотоксическую активность в отношении аутологичных ФГА T-клеточных бластов, 5 стимулированных 5 мкг/мл ФГА в течение 4-5 дней при концентрации 10 клеток на лунку в отсутствии контрольного или VHPI пептида (клетки-мишени). 1-2•10⁶ клеток-мишеней были помечены 250 mCu ⁵¹Cr в 0,3 мл среды в течение 1 часа при 37^oC. Клетки-мишени три раза промывали средой, разбавляли до концентрации 10⁵ или 10⁴ клеток/мл и 100 мл клеточной суспензии прибавляли в каждую V-образную лунку 96-луночного микротитровального планшета. Клетки-эффекторы были добавлены к клеткам-мишеням при соотношении эффектор: мишень (Э:М) от 50:1 до 6,25:1. Культуры инкубировались в течение 4 часов при 37^oC и супернатант собирался и подсчитывалось высвобождение ⁵¹Cr. Процент цитотоксичности рассчитан по формуле: 100•(высвобождение в эксперименте - спонтанное высвобождение)/(максимальное высвобождение - спонтанное высвобождение). Самопроизвольное высвобождение и максимальное высвобождение были определены инкубированием клеток-мишеней в среде или в 1,0% Тритоне х-100, соответственно. Результаты были обсчитана в виде значений±стандартные отклонения (СД) трипликатных культур и положительным результатом считалась область специфического лизиса, превышающая 20%. Было повторено цитотоксическое исследование с аллогенными клетками-мишенями от доноров (мишень-1, мишень-2 и мишень-3), и процент специфического лизиса подсчитывался при соотношении эффектор: мишень 10:1.

Исследование T-клеточной пролиферации
Исследование T-клеточной пролиферации осуществлялось путем культивирования либо МКПК, либо T-клеточных линий (10⁴ клеток /лунку) на микротитровочных планшетах с 96-ти U-образными лунками в течение трех дней при 37^oC, стимулированных свежеоблученными аутологичными МКПК и r-IL2 либо вместе, либо без 1 мкМ VHP1. МКПК или T-клеточные линии были выдержаны при отсутствии 35 r-IL2 в течение 24 часов перед исследованием. Три положительные контрольные культуры МКПК или T-клеточных линий были стимулированы 10 мкг/мл ФГА, 10 мкг/мл PPD и 0,1 мкг/мл CET (стафилококковый энтеротоксин), соответственно, для определения максимальной пролиферации. В качестве отрицательных контролей были использованы нестимулированные культуры МКПК или T-клеточной линии и необлученной МКПК или T-клеточной линией при тех же самых условиях. В течение последних 6 часов перед собиранием клеток в культуры добавляли 1 mCu/лунку [³H] тимидина. Клетки собирают на фильтрах из стекловолокна с помощью полуавтоматического харвестера и включение меченого тимидина определяли жидкостной сцинцилляционной спектрометрией. Результаты выражены в виде подсчетов в минуту (cpm) средних для триплетных культур.

Результаты
Индукция аутореактивных клеток с помощью VHP1
Короткоживущие культуры МКПК доноров, положительных к B8 или B35 (триггер+), стимулированные с помощью VHP1, продуцировали эффекторы, которые показывали значительные аутоцитотоксические ответы против активированных аутологичных T-клеточных мишеней при исследованиях цитотоксичности по высвобождению ⁵¹Cr. Короткоживущие культуры МКПК от доноров, положительных к B8 или B35, стимулированные контрольным пептидом (контроль) и короткоживущие культуры МКПК от доноров, отрицательных к B8 или B35 (триггер-), не продуцировали значительные уровни этих аутоцитотоксических эффекторов. Зависимость аутоцитотоксических ответов от фенотипа ГКГ инфицированных доноров в короткоживущих культурах МКПК, стимулированных VHP1, показана в табл. 3.

Идентификация мишени VHP1 индуцированных аутореактивных клеток.

Для установления ГКГ специфичности цитотоксических клеток, стимулированных VHP1, затем были проведены цитотоксические исследования с аллогенными ФГА-активированными T-клеточными мишенями, имеющими различный ГКГ фенотип. Эффекторы, принадлежащие короткоживущим культурам МКПК от доноров с ГКГ B8 или B35 (триггер+), инкубировали с VHP1 в течение 4-8 часов. Клетки мишени были взяты от доноров с B8 B35 (триггер+) или B27 (триггер-) фенотипами ГКГ. Мишень МКПК инкубировали с радиоактивным ⁵¹Cr в течение одного часа перед смешиванием с эффекторами. Эффекторные клетки смешивались с радиомеченными клетками-мишенями и инкубировались в течение 4 часов и лизис измеряли выделением радиоактивного ⁵¹Cr (табл. 4).

Измерения процентов специфического лизиса путем высвобождения ⁵¹Cr при соотношении эффектора к мишени 10:1 (табл. 5)
Эффекторы JMC-B8 эффективно поражали обе, B8 и B35, мишени, но не B27 мишени. Эффекторы WW-B35 эффективно поражали обе, B8 и B35, мишени, но не B27 мишени (та же специфичность, что и у эффекторов JMC-B8). Эффекторы SW-B35 показывали такую же модель специфичности в том, что они распознавали обе, B8 и B35 мишени, но не B27 мишени, однако уровень общей цитотоксической активности от этого донора был ниже.

B8 и B35, оба, обладают одинаковой триггерной последовательностью аминокислот в альфа-один домене ГКГ класса 1, в то время как B27 обладает другой последовательностью. (GB 9411534.- 2, поданный Holms R.D. 8 июня 1994 г.). Фенотипы B8 и B35 ассоциируются с высокой чувствительностью к развитию СПИДа после ВИЧ инфицирования в ряде клинических исследований. Заявитель приходит к выводу, что VHP1 представляется в контексте с ГКГ класса 1 B8 и B35 для эффекторных T-клеток в короткоживущих культурах МКПК. Заявитель также приходит к выводу, что TCR B8 и B35 эффекторных T-клеток распознают общий эпитоп в ГКГ класса 1 B8 и B35 мишенях, которые отсутствуют на ГКГ класса 1 В27. Вероятно, общий эпитоп является сочетанием общей ГКГ класса 1 В триггерной последовательности (присутствует в альфа один домене обоих B8 и B35, но не B27) плюс пептиды человека, похожие на HEP1 (собственные пептиды, гомологичные VHP1).

Аутореактивная T-клеточная линия была получена от донора WW (HLA-B35 фенотипа) путем стимуляции VHP1. Линия состояла из смешанной популяции 59% CD4+ T-клеток и 28% CD8+ T-клеток. Исследование пролиферации проводили для измерения уровня 35 пролиферации в T-клеточной линии к аутологичным (собственным) клеткам. T-клеточная линия WW энергично отвечала на аутоантигены, представленные на аутологичных облученных МКПК, на уровнях, похожих таковым в контрольных позитивных культурах, стимулированных ФГА или PPD.

Обсуждение
Автор делает вывод, что VHP1 (в низких концентрациях) активирует иммунную систему и индуцирует значительные уровни аутоцитотоксических клеток у доноров с фенотипом ГКГ, связанных с чувствительностью к быстрому развитию СПИДа (B8 или B35), в то время как он не является столь активным у доноров, которые не несут фенотип ГКГ, связанный с чувствительностью к быстрому развитию СПИДа. Корреляция между VHPI чувствительностью и чувствительностью к быстрому развитию СПИДа предполагает, что экспрессия и правильная презентация VHPI последовательности у ВИЧ инфицированных людей может быть важной стадией в процессе болезни, приводящей к СПИДу.

Пример 2
Клиническое испытание HEP1 у ВИЧ инфицированного пациента
Целью данного исследования было определить на ВИЧ инфицированном пациенте, может ли индукция иммунологической толерантности к HEP1 уменьшить иммунную активацию и ВИЧ инфицирование. В плане первого клинического эксперимента было пероральное введение HEP1 пациенту при дневной дозе 10 мг (нижний предел предпочтительного уровня дозы). Спустя приблизительно три месяца произвели подкожное введение HEP1 при более высокой дозе в 140 мг. Для оценки терапевтического преимущества HEP1 путем предварительного, в процессе каждого исследования и определения и последующего отбора образцов крови были измерены следующие параметры развития болезни: ВИЧ уровни путем исследования p24 антигена, ВИЧ инфекциозность путем исследования клеточного TCID и иммунная активация путем количественного определения различных лимфоцитов.

Пациент
Пациент ПП добровольно принимал перорально пептид HEP1 во время посещения ВИЧ клиники при Earling Hospital NHS Trust. Пациента ПП, белого мужчину 32 лет, ВИЧ инфицированного в течение восьми лет, подвергали испытанию с количеству T-клеток, равным 80 клеток/мм³. В предшествующие пять лет до испытания он не подвергался никакому противовирусному лечению (например, АЗТ). В процессе испытания пациент являлся HCV отрицательным (2-е поколение Abbott), гепатит Б отрицательным и имел группу крови А резус (Д) положительный.

Синтез HEP1 пептида
Сокращения
DCC-дициклогексилкарбодиимид
DIC-диизопропилкарбодиимид
DCM-дихлорметан
DMF-диметилформамид
TFA-трифторуксусная кислота
Boc-трет-бутилоксикарбонил
HOBT-гидроксибензотриазол
DIEA-диизопропилэтиламин
DCU-дициклогексилмочевина
HF-фтористый водород
370 мг HEP1 (пептид из 14 аминокислот) был синтезирован путем Boc-синтеза на основе последовательность эзрина человека: NH₂ThrGluLysLysArgArgGiuThrVaIGluArgGluLysGIuCOOH
0,05 ммоль смолы (Boc-аминокислотная -OCH₂ pam смола) и трехкратный избыток активированного Boc-аминокислотного раствора (активированного с помощью 0,5 М HBTU в DMF и 2,5 ммоль DIEA) связывают путем следующих стадий. Смолу промывают DMF, Вос защитные группы удаляют 100%-ной TFA, реакционную смесь сушат, промывают DMF в течение одной минуты, сушат, прибавляют активированный аминокислотный раствор, встряхивают в течение 10 минут при комнатной температуре, затем промывают и последовательность стадий повторяют для следующей аминокислоты. Для завершения синтеза реакционную смесь проточно промывают DMF, затем DCM и сушат. Пептид отщепляют от смолы с помощью HF (-5^oC в течение 1,5 часов), смесь промывают 50 мл эфира и HF выпаривают, и затем пептид растворяют в 6M гуанидине 0,1 М Трис для ВРЖХ препаративного разделения. После разделения пептид был проанализирован на чистоту с помощью ВРЖХ и определено, что чистота HEP1 превышала 99%. Пептидный раствор был высушен в вакууме до чистого белого пористого твердого вещества.

Получение HEP1 пептида для перорального введения
В сосуд, содержащий 221 мг лиофильно высушенного чистого HEP1, прибавляют приблизительно 5 мл стерильной дистиллированной воды для растворения пептида и раствор выливают в 50 мл мерную колбу и доводят в этой мерной колбе до объема точно в 50 мл с помощью дополнительного количества стерильной дистиллированной воды с получением конечной концентрации 4,42 мг/мл HEP1. Раствор переносят по 2,26 мл в двадцать две 5 мл-овые пластиковые пробирки и хранят при -20^oC (10 мг пептида на пробирку). Две пробирки хранились в клинике в качестве эталонных при -70^oC, а остальные 20 пробирок были направлены пациенту в вакуумном сосуде в сухом льду. До использования пациентом пробирки хранились в холодильнике при -20^oC. Каждое утро пациент размораживал одну пробирку (оставляя остальные замороженными в холодильнике) и проглатывал раствор за час до завтрака. Процедуру повторяли в течение двадцати дней.

Получение HEP1 пептида для подкожного введения
Пациенту ПП подкожно вводили HEP1 спустя три месяца после окончания перорального введения.

Получение
В сосуд, содержащий 147 мг лиофильно высушенного чистого HEP1 (никакие неорганические соли не прибавлялись), прибавляют 1 мл стерильной дистиллированной воды для растворения пептида с получением конечной концентрации 147 мг/мл HEP1. Раствор подвергают стерильной фильтрации, используя Sartorius фильтр с диаметром пор 0,2 микрон, присоединенный с стерильному 5 мл шприцу, и переносят в 5 мл стерильный контейнер.

Клеточное TCID исследование
Клеточный TCID является методом измерения относительного количества вирусных частиц внутри клеток. В пределах четырех часов после взятия образца у ВИЧ инфицированного пациента из образца были получены 10⁶ жизнеспособных ПКМК центрифугированием антикоагулированной крови над средой Ficoll-Hypaque для выделения лимфоцитов. Серийное разведение клеток пациента было проведено на 24-луночном планшете в убывающих количествах (1:1, 1:4, 1:16, 1:64 и 1: 256 и отрицательный контроль), используя 0,9 мл специальной среды (RPMI-1640), дополненной 15% эмбриональной сывороткой теленка и 10% интерлейкина 2. Инфицированные клетки затем ко-культивируют с 10⁶ ПКМК неинфицированного донора-человека, которые были стимулированы в течение 24-48 часов фитогемагглютинином (ФГА) для активации клеток, чтобы сделать их восприимчивыми к инфицированию ВИЧ. Ко-культуры затем дважды в неделю контролировались на присутствие антигена p24 в супернатантной жидкости в течение 14 дней, на протяжении этого периода планшеты центрифугировали в день 4, 7, 11 и 14 и затем осуществляли 50%-ную замену среды. Среда удалялась в дни 7 и 14 и хранилась в двойных 0,5 мл эппендорфовских пробирках (минимум 250 мкл/пробирка) для последующего исследования p24 антигена. Среда удалялась на 11 день и все остальные среды после 14 дня (после хранения для исследования на p24 антиген) объединяли и хранили в жидком азоте для следующих вирусных культур. Культура считалась положительной, если концентрация р24 антигена в супернатанте на 7 день и на 14 день превышала 30 пикограмм/мл (обычное пороговое значение). Наименьшее количество периферических мононуклеарных клеток, требуемых для получения положительной 35 культуры рассматривалось как конечная точка, а величина, обратная конечной точке разведения, показывала относительное число инфицированных клеток у пациента.

Исследование на р24 антиген
р24 антиген является как маркером ВИЧ инфицирования, так и прогрессии развития ВИЧ заболевания. Исследование на р24Ag определяет р24 антиген из ядра ВИЧ и путем использования мышиных моноклональных антител, расположенных на поверхности микролуночных планшетов. Исследование определяет ВИЧ в плазме, сыворотке или тканевой культуральной среде. При наличии антигена последний связывается с покрытыми антителами микролунками. Связанный антиген распознается с помощью биотинилированных антител к ВИЧ, которые взаимодействуют с конъюгированной стрепавидин-пероксидазой хрена. При взаимодействии пероксидазы с перекисью водорода в присутствии тетраметилбензидинового (TМВ) соединения появляется окрашивание. Образцы, являющиеся ВИЧ р24 антиген положительными, могут быть определены количественно путем построения стандартной кривой, используя серийное разведение антигенного реагента. Исследование не является точным ниже концентрации 30 пикограмм на мл.

CD4, CD8, NK
T-клеточные субпопуляции были измерены путем прибавления образца крови в 4,5 мл пробирку, содержащую EDTA, и меченых моноклональных антител к CD3, CD4 и CD8. Процентное содержание T-клеток в лимфоцитах периферической крови было определено с помощью проточно-цитометрических способов. Число CD4 и CD8 T-клеток определяли получением общего и дифференцированного количества белых клеток и умножением числа последних на соответствующий коэффициент метода проточной цитометрии.

Результаты: Пероральное введение HEP1
У пациента образцы крови были взяты за 69 дней до начала испытаний и в первый день испытаний до введения первой дозы HEP1 для определения исходных уровней маркеров прогрессии болезни. Пероральное введение раствора HEP1, содержащего 10 мг HEP1 было начато на 2 день испытаний и продолжалось до дня 22. Следующие образцы крови отбирались для анализа в день 7, день 14, день 21 и день 28 испытания (7 дней спустя последней дозы HEP1). Пациент не проявлял отрицательных реакций и продолжал чувствовать себя хорошо без введения HEP1.

Были исследованы следующие маркеры прогрессии ВИЧ заболевания: р24Ag (концентрация ВИЧ р24 протеина в пикограммах/мл в крови), TCID (инфекциозность ВИЧ в клетках образца крови, измеренная исследованием in vitro клеточной культуры, в котором серийное разведение образца было смешано с активированными неинфицированными МКПК, и уровень ВИЧ инфицирования определялся исследованием концентрации р24Ag), общее число белых клеток крови (иммунная активация измерялась числом белых клеток крови на мм³, CD4 (число CD4 положительных клеток на мм³), CD8 (число CD8 положительных клеток на мм³), NK (число естественных клеток киллеров на мм³), лимфоциты (число клеток на мм³), моноциты (число клеток на мм³) и гранулоциты (число клеток на мм³). Данные были рассчитаны делением каждого значения на соответствующее значение данного показателя на день 1 испытаний и умножением на 100 (см. табл. 6).

Эти предварительные клинические результаты показывают, что пероральное введение HEP1 уменьшает заражение вирусом на 46%, что было измерено по уровню р24Ag, уменьшает инфекциозность ВИЧ в 16 раз при исследовании в тесте TCID, и данный эффект сохранялся в течение 7 дней после обработки. Важно отметить, что уровень р25Ag был лишь немногим выше фона при 38 пикограмм/мл, так как 30 пикограмм/мл рассматривалось как обычное пороговое значение. Общее количество белых клеток крови повышалось перед началом лечения, но падало в процессе и по завершению лечения, что предполагает снижение иммунной активации, достигаемой в процессе лечения. Сохранение этого действия в течение 7 дней после обработки предполагает, что у пациента была индуцирована T-супрессорная клеточная популяция, которая снижает инфекциозность ВИЧ и иммунную активацию. Количество CD8 увеличивалось в процессе лечения, но значительного возрастания количества CD4 клеток обнаружено не было (при данной концентрации HEP1). (Фиг. 2).

Результаты
Подкожное введение HEP1
0,95 мл (объем, эквивалентный 140 мг HEP1) стерильного раствора был введен подкожно в брюшную стенку одной дозой в день 1 испытания по подкожному введению HEP1. Пациент ПП ощущал жжение, длящееся около 15 минут, но других неблагоприятных реакций не наблюдалось. Образцы крови брались в день -92, -57, - 8 и за день до введение HEP1 и в день 1^* четыре часа спустя после инъекции затем спустя б дней и спустя 13 дней после инъекции HEP1. Образцы были исследованы на р24, TCID, CD4, CD8, общее число белых клеток крови, лимфоциты, гранулоциты, моноциты, и 30 данные представлены в табл. 7 (нормализованные данные были рассчитаны как описано выше).

Подкожное введение одной большой дозы HEP1 привело к резкому увеличению как CD4 T-клеток (+50%), так и CD8 T-клеток (+28%) после введения HEP1 с последующим возвратом к доинъекционному уровню шесть дней спустя (данные р24Ag и TCID не были готовы ко времени подачи заявки). (Фиг. 3).

Изобретение предназначено для профилактики и лечения СПИДа, системной красной волчанки и связанных с ними заболеваний. Использование заявленной композиции значительно безопаснее, чем известных пептидных препаратов. Композиция содержит эффективное количество очищенного пептида или смеси из двух или более различных пептидов, содержащих до 30 аминокислот. Могут содержаться производные этих аминокислот с дополнительными химическими группами. Пептиды включают аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50 % состоит из гомологии следующей аминокислотной последовательности: NH₂ Thr Glu Lys Lys Arg Arg Glu Thr Val Glu Arg Glu Lys Glu COOH (HEPI). Кроме таких пептидов композиция содердит очищенный пептид или смесь двух или более различных пептидов, содержащих до 80 аминокислот или их производных с дополнительными химическими группами. Эти пептиды включают аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере пять последовательностей имеют 100%-ную гомологию HEPI. Композиция содержит фармацевтичесни приемлемый носитель. 3 ил., 7 табл.

Композиция для профилактики и лечения СПИДа, или системной красной волчанки, или связанных с ними нарушений, включающая фармацевтически эффективное количество очищенного пептида или смеси из двух или более различных пептидов, содержащих до 30 аминокислот, или их производных с дополнительными химическими группами, включающих аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50% состоит из гомологии следующей аминокислотной последовательности:
NH₂ThrGluLysLysArgArgGluThrValGluArgGluLysGluCOOH (HEP I),
очищенный пептид или смесь двух или более различных пептидов, содержащих до тридцати аминокислот или их производных с дополнительными химическими группами и включающих аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере пять последовательностей имеют 100%-ную гомологию HEP I, и фармацевтически приемлемый носитель.