КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ МЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ФАКТОР РОСТА ЭПИДЕРМИСА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2003 года по МПК A61K38/18 A61K31/75 

Изобретение относится к композиции для местного применения, содержащей фактор роста эпидермиса человека (ФРЭЧ). Более конкретно данное изобретение относится к композиции для местного применения, содержащей сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена (общее обозначение: Poloxamer), имеющий вязкость 4-10 сантипуаз при 37^oС, 60 об/мин, в качестве основания для состава природного или рекомбинантного фактора роста эпидермиса человека, предназначенного для местного применения. Композиция для местного применения в соответствии с данным изобретением применима для лечения кожных повреждений, включая раны, разрезы, ожоги и т.д.

Фактор роста эпидермиса человека представляет собой полипептид, состоящий из 53 аминокислотных остатков с тремя дисульфидными связями (см. Cohen, S., J. Biol. Chem., 237, 1555-1562, 1962; Savage, C.R., J. Biol. Chem., 248, 7669-7672, 1973). Сообщалось о том, что фактор роста эпидермиса человека играет очень важную роль в процессе роста эпидермальных и кожных клеток у млекопитающих (см. Sporn, M.B., et al., Nature (London) 313, 745-747, 1985; Sporn, M. B. , et al., N. Engl. J. Med., 303, 878-880, 1980). Он также принимает участие в процессе заживления ран (см, Buckley, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7340-7344, 1985) на молекулярном уровне. С тех пор проводились многочисленные исследования, относящиеся к заживлению кожных ран при помощи фактора роста эпидермиса человека.

Несмотря на то, что фактор роста эпидермиса человека проявляет хорошую активность при стимулировании дифференциации эпидермальных клеток in vitro, разработка составов, содержащих фактор роста эпидермиса человека, для лечения местных ран является очень трудной задачей из-за того, что указанный фактор оказывает лишь незначительное действие на заживление ран при его клиническом применении. Причины, по которым фактор роста эпидермиса человека не оказывает желаемое действие при лечении ран в живом организме, следующие: указанный фактор как белок очень неустойчив, особенно в присутствии воды, при комнатной температуре, и его период полураспада составляет меньше часа, что намного короче периода времени, необходимого для индуцирования синтеза ДНК клеток в области раны, который составляет приблизительно 8-12 часов (см. J. Surg. Res. , 43, 333, 1987). Более того, после нанесения фактора роста эпидермиса человека на кожу указанный фактор теряет свою биологическую активность в результате его денатурации и разложения протеолитическими ферментами, присутствующими в области раны.

Чтобы обеспечить желаемый эффект фактора роста эпидермиса человека в процессе заживления ран, необходимо постоянно поддерживать его эффективный уровень, применяя указанный фактор в области раны в любое время на протяжении первых нескольких дней, которые являются наиболее важными при заживлении ран (см. J. Surg. Res., 43, 333, 1987; J. Lab. Clin. Med., 108, 103, 1986). В этом отношении были проведены исследования по разработке состава пролонгированного действия, способного непрерывно доставлять фактор роста эпидермиса человека в область раны.

В качестве одного из результатов таких исследований описание патента США 4944948 раскрывает фактор роста эпидермиса человека/состав липосомного геля, включающего нейтральные фосфолипиды, отрицательно заряженные фосфолипиды и холестерин, способные непрерывно доставлять указанный фактор в область раны; а также публикация ЕР 0312208 описывает водный состав, включающий различные фармацевтически приемлемые растворимые в воде или способные к набуханию водой полимеры в качестве основы для равномерного выделения фактора роста эпидермиса человека.

Однако несмотря на то, что вышеупомянутые известные публикации описывают составы, способные непрерывно выделять фактор роста эпидермиса человека в течение 12 часов и более, они не подходят для промышленного применения, поскольку оказывают небольшое заживляющее действие в области раны.

В частности в соответствии с публикацией ЕР 0312208 в результате получения состава геля с применением полимеров в качестве основы для непрерывного выделения фактора роста эпидермиса человека в течение 12 часов и более при высокой концентрации указанный фактор медленно выделяется из геля и непрерывно доставляется в область раны, а затем сам гелевый состав способен обеспечить действие по заживлению раны в результате образования покрытия на ране для создания подходящей влажности в области раны и предупреждения инвазии в нее патогенных организмов. Однако, поскольку такой гелевый состав имеет очень высокую вязкость, составляющую 1000-12000000 сантипуаз при комнатной температуре, его втирание в области раны может вызвать раздражение. Очень трудно наносить состав на рану, имеющую большую площадь поражения и вызывающую сильную боль, такую как ожог. После этого гелевый состав образует дополнительный покров в области раны, физически ингибируя миграцию эпидермальных клеток в результате митогенной активности фактора роста эпидермиса человека, тем самым замедляя его действие на заживление рамы. Поэтому гелевый состав, описанный в вышеуказанной известной публикации, имеет следующий серьезный недостаток: при его клиническом применении в области раны действие фактора роста эпидермиса человека по заживлению ран не обеспечивается в достаточной степени.

Как указано выше, поскольку известные составы фактора роста эпидермиса человека для местного применения не оказывают желаемого достаточного действия по заживлению раны в ее области, весьма желательной является разработка препарата для местного применения, способного оказывать достаточное действие указанного фактора по заживлению ран в живом организме.

Таким образом, авторы данного изобретения провели многочисленные исследования по разработке препарата для местного применения, способного оказывать достаточное действие по заживлению ран в живом организме. В результате мы установили, что препарат для местного применения фактора роста эпидермиса человека, включающий сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена, имеющий вязкость, составляющую 4-10 сантипуаз при 37^oС, 60 об/мин, способен оказывать хорошее действие указанного фактора на заживление ран, и таким образом, завершили данное изобретение.

Таким образом, данное изобретение относится к композиции, содержащей фактор роста эпидермиса человека для местного применения.

Более конкретно, данное изобретение относится к композиции для местного применения, включающей фактор роста эпидермиса человека в качестве активного ингредиента и сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена, имеющий вязкость, составляющую 4-10 сантипуаз при 37^oС, 60 об/мин, в качестве основы препарата для местного применения.

В данном описании степень вязкости измеряется величиной дин/с на см². Эта величина, если не указано иначе, измеряется в сантипуазах с применением вискозиметра Брукфилда. Если не указано иначе, вязкость измеряют при 37^oС, 60 об/мин.

Сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена, применяемый в качестве основы в данном изобретении, имеет вязкость, составляющую 4-10 сантипуаз, предпочтительно 4-6 сантипуаз при 37^oС, 60 об/мин. Если вязкость сополимера полиоксиэтилена-полиоксипропилена ниже 4 сантипуаз, то физическое заживляющее действие, присущее сополимеру полиоксиэтилена-полиоксипропилена, снижается и скорость выделения фактора роста эпидермиса человека становится слишком высокой, снижая его действие по заживлению ран. С другой стороны, вязкость сополимера полиоксиэтилена-полиоксипропилена выше 10 сантипуаз также является нежелательной, поскольку указанный сополимер образует в области раны лишний покров, ингибирующий миграцию эпителиальных клеток, стимулированных фактором роста эпидермиса человека, таким образом снижая действие по заживлению ран.

В соответствии с данным изобретением в результате включения фактора роста эпидермиса человека в препарат для местного применения для лечения ран с применением сополимера полиоксиэтилена-полиоксипропилена, имеющего вязкость 4-10 сантипуаз, покров, образуемый полимером, не служит физическим препятствием во время процесса по заживлению ран и проявляет присущее ему физическое заживляющее действие, а также индуцирует достаточное действие фактора роста эпидермиса человека по заживлению ран. Следовательно, описываемый состав для местного применения обеспечивает хорошее действие по заживлению ран при его применении в области раны.

Вязкость сополимера полиоксиэтилена-полиоксипропилена определяют в зависимости от температуры, молекулярной массы и содержания полимера. Так, для получения вязкости сополимера полиоксиэтилена-полиоксипропилена, составляющей 4-10 сантипуаз при 37^oС, 60 об/мин, предпочтительно использовать сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена, имеющий молекулярную массу приблизительно от 10000 до 15000, в количестве, составляющем 5-10 мас.% от общей массы композиции, либо использовать сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена, имеющий молекулярную массу приблизительно от 7000 до 10000, в количестве, составляющем 7,5-15 мас.% от общей массы композиции.

Более предпочтительно удобно обеспечивать вязкость в интервале 4-6 сантипуаз, применяя сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена, имеющий молекулярную массу приблизительно от 10000 до 15000, в количестве, составляющем 5-7,5 мас.% от общей массы композиции, либо сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена, имеющий молекулярную массу приблизительно от 7000 до 10000, в количестве, составляющем 7,5-12,5 мас.% от общей массы композиции.

В композиции для местного применения в соответствии с данным изобретением в качестве активного ингредиента фактора роста эпидермиса человека может быть использован природный или рекомбинантный указанный фактор. Содержание фактора роста эпидермиса человека в композиции предпочтительно составляет 0,01-1000 мкг/мл, в частности 1-100 мкг/мл.

Поскольку композиция для местного применения в соответствии с данным изобретением, имеющая вышеуказанный состав, находится в жидком состоянии при комнатной температуре, фактор роста эпидермиса человека как фармакологически активный ингредиент может быть равномерно диспергирован в основе, включающей сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена. Поэтому в отличие от известных гелевых составов при нанесении композиции в соответствии с данным изобретением в области раны указанная композиция обеспечивает хорошее проникновение активного ингредиента в эту область и может быть равномерно распределена в ней, увеличивая площадь контакта кожи с фактором роста эпидермиса человека, таким образом обеспечивая прекрасное действие по заживлению ран. Кроме того, композиция в соответствии с данным изобретением также имеет то преимущество, что, поскольку она находится в жидком состоянии, имеющем низкую вязкость, она может быть получена в виде состава для распыления, который может быть нанесен на рану просто распылением, а не втиранием и, следовательно, не вызывать физического раздражения раны.

Композиция в соответствии с данным изобретением может также содержать фармацевтически приемлемые добавки, которые могут быть обычным способом использованы при получении препарата для местного применения, например стабилизатор, наполнитель и т.д., помимо активного ингредиента, т.е. фактора роста эпидермиса человека, и сополимера полиоксиэтилена-полиоксипропилена в качестве основы.

При необходимости композиция в соответствии с данным изобретением может быть подвергнута хранению в лиофилизированном виде, а затем при использовании растворена в подходящем растворителе. Следовательно, композиция в соответствии с данным изобретением может быть подвергнута устойчивому хранению в течение длительного периода времени.

Данное изобретение более конкретно проиллюстрировано нижеследующими примерами и экспериментами. Однако следует отметить, что данное изобретение никоим образом не ограничено этими примерами.

Пример 1.

Фактор роста эпидермиса человека - 5 мг
Poloxamer 188 - 10 г
Метил параоксибензоат - 200 мг
Вторичный кислый фосфат натрия - 340,23 мг
Хлорид натрия - 832,77 мг
Фосфорная кислота - Достаточное количество
Очищенная вода - Достаточное количество
Всего - 100 мл
Раствор получают, используя вышеупомянутые компоненты в указанных количествах, в соответствии с известным способом. В частности фосфатный буфер получают из вторичного кислого фосфата натрия, хлорида натрия и фосфорной кислоты. К полученному фосфатному буферу добавляют Poloxamer 188 и диспергируют в нем при перемешивании. Затем к смеси добавляют метил параоксибензоат в качестве консерванта и фактор роста эпидермиса человека в качестве активного ингредиента, получая 100 мл раствора для местного применения в соответствии с данным изобретением.

Пример 2.

Фактор роста эпидермиса человека - 5 мг
Poloxamer 407 - 7,5 г
Метил параоксибензоат - 200 мг
Вторичный кислый фосфат натрия - 340,23 мг
Хлорид натрия - 832,77 мг
Фосфорная кислота - Достаточное количество
Очищенная вода - Достаточное количество
Всего - 100 мл
Фосфатный буфер получают, используя вторичный кислый фосфат натрия, хлорид натрия и фосфорную кислоту в указанных количествах. К полученному фосфатному буферу добавляют Poloxamer 407 и диспергируют в нем при перемешивании. Затем к смеси добавляют метил параоксибензоат в качестве консерванта и фактор роста эпидермиса человека в качестве активного ингредиента, получая 100 мл раствора для местного применения в соответствии с данным изобретением.

Эксперимент 1. Сравнение действия фактора роста эпидермиса человека по заживлению ран в зависимости от вида основы на животной модели с раной
На спине крыс выбривают волосы и на нее наносят депиляторный агент (Neet Cream, выпускаемый I1 Dong Pharm.) для удаления волос. Затем крысам внутримышечно вводят стрептомицин (выпускаемый Chong Kun Dang Corp.) в дозе 0,5 г/кг. Крыс подвергают анестезии при помощи внутрибрюшинной инъекции натрия пентобарбитала в дозе 40 мг/кг. Рану индуцируют удалением эпидермиса и дермы при помощи операционных ножниц на одном участке диаметром 10 мм. Затем при условии, что область раны открыта, размер раны через один день после ее нанесения принимают за исходную площадь раны.

В зависимости от вида применяемых основ испытуемых животных делят на 11 групп - необрабатываемая контрольная группа, экспериментальные группы (группы, получающие Poloxamer + фактор роста эпидермиса человека, поливинилпирролидон + фактор роста эпидермиса человека, декстран + фактор роста эпидермиса человека, желатин + фактор роста эпидермиса человека и полиметакриламид + фактор роста эпидермиса человека), а также другая контрольная группа, которой вводят только основу (группы, получающие Poloxamer, поливинилпирролидон, декстран, желатин и полиметакриламид). Через день после нанесения раны область раны каждого испытуемого животного обрабатывают дважды в день испытуемым лекарственным средством в количестве 0,5 мл на каждый раз. В первой испытуемой группе в качестве испытуемого лекарственного средства применяют препарат, в котором фактор роста эпидермиса человека содержится в количестве 5 мг на 100 мл раствора, полученный в соответствии с процедурой, описанной в примере 2, за исключением того, что вид и количество основы варьируют. В контрольных группах, получающих основу, применяют препарат, полученный в соответствии с процедурой, описанной в примере 2, за исключением отсутствия фактора роста эпидермиса человека. Рану обрабатывают испытуемыми лекарственными средствами, а площадь кожной области раны измеряют каждый день. Затем определяют оставшуюся степень раны на дни лечения, подсчитывая величину измеряемой площади ран в соответствии с количеством дней лечения по сравнению с исходной площадью раны, измеряемой после ее нанесения. Оставшуюся степень раны на дни лечения и дни лечения анализируют при помощи линейной регрессии с целью определения 50% времени заживления (НТ₅₀), которое равно количеству дней, представляющих 50% оставшуюся степень раны. Полученный результат представлен в нижеследующей таблице 1.

Как следует из таблицы 1, в том случае, когда Poloxamer 407, представляющий собой сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена, применяют в качестве основы в количестве 5-10 мас.% в соответствии с данным изобретением, он оказывает прекрасное действие по заживлению раны, при этом количество дней заживления составляет 3,3-3,8. В отличие от этого применение остальных растворимых в воде полимерных основ оказывает лишь небольшое действие по заживлению раны.

Эксперимент 2. Действие фактора роста эпидермиса человека по заживлению ран в зависимости от содержания сополимера полиоксиэтилена-полиоксипропилена на животной модели с раной
Для определения действия фактора роста эпидермиса человека по заживлению ран в зависимости от содержания сополимера полиоксиэтилена-полиоксипропилена, оказывающего наилучшее действие по заживлению ран в эксперименте 1, применяют исследуемый препарат, получаемый в соответствии с процедурой примера 2, в соответствии со способом, описанным в эксперименте 1. Испытуемых животных разделяют на необрабатываемую контрольную группу, группы, получающие Poloxamer в количестве 2,5, 5,0, 7,5, 10,0 и 12,5 мас.%, группы, получающие соответствующее количество Poloxamer, а также фактор роста эпидермиса человека в качестве активного ингредиента. Таким образом, определяют действие по заживлению ран в зависимости от содержания основы.

Как следует из таблицы 2, в том случае, когда содержание сополимера полиоксиэтилена-полиоксипропиле-на составляет 5-10 маc.%, он оказывает хорошее действие по заживлению ран, при этом количество дней заживления ран составляет 3,1-3,8 дней. В особенности когда содержание сополимера полиоксиэтилена-полиоксипропилена составляет 5-7,5 маc.%, он оказывает прекрасное действие по заживлению ран, при этом количество дней заживления ран составляет 3,1-3,3 дней.

Из результатов, полученных в вышеописанных экспериментах 1 и 2, можно сделать вывод о том, что среди различных полимеров, которые могут быть использованы в качестве основы препарата для местного применения, только сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена в количестве 5-10 маc.%, в особенности 5-7,5 маc. %, может оказывать прекрасное действие фактора роста эпидермиса человека по заживление ран.

Эксперимент 3. Вязкость сополимера полиоксиэтилена-полиоксипропилена в зависимости от молекулярной массы
Как следует из вышеописанных экспериментов 1 и 2, действие по заживлению ран существенно варьируется в зависимости от содержания сополимера полиоксиэтилена-полиоксипропилена. Кроме того, вязкость сополимеров полиоксиэтилена-полиоксипропилена может быть определена в зависимости от их молекулярной массы и содержания, а также температуры.

Поэтому, чтобы установить оптимальное содержание, зависящее от молекулярной массы сополимеров полиоксиэтилена-полиоксипропилена, определяют вязкость препарата, содержащего Poloxamer 407 (средняя молекулярная масса приблизительно 10000-15000), оказывающего наилучшее действие по заживлению ран, в количестве 5-10 маc.%, а также содержание Poloxamer 188 (средняя молекулярная масса приблизительно 7000-10000) в качестве низкомолекулярных сополимеров полиоксиэтилена-полиоксипропилена, имеющих такую же вязкость, как и в случае с Poloxamer 407, измеряя вязкость в каждом случае в соответствии со следующей процедурой.

Вязкость измеряют при помощи Synchro-Lectric вискозиметра Брукфилда (модель: RVF, США), а исследуемые препараты получают в соответствии со следующими способами. Poloxamer тщательно забирают в зависимости от его содержания и медленно помещают в мензурку, содержащую дистиллированную воду, при перемешивании. Перемешивание продолжают до тех пор, пока Poloxamer не растворится полностью. Полученный исследуемый раствор оставляют на 5 часов, а затем забирают около 200 мл раствора и помещают в инкубатор, предварительно нагретый до температуры от 25 до 37^oС.

Вискозиметр вертикально устанавливают в емкости, содержащей указанный раствор, вращают в течение 3 минут при скорости 60 об/мин, а затем записывают цифровую величину, появившуюся на шкале вискозиметра. Эксперимент повторяют три раза, получая среднюю величину.

Как следует из таблицы 3, когда содержание Poloxamer 407, оказывающего хорошее действие по заживлению ран, составляет 5-10 мас.%, то вязкость составляет 4-10 сантипуаз, а в случае с предпочтительным содержанием, составляющим 5-7,5 мас. %, вязкость составляет 4-6 сантипуаз. Следовательно, в качестве основы препарата для местного применения, содержащего фактор роста эпидермиса человека, для лечения ран предпочтительно применение сополимера полиоксиэтилена-полиоксипропилена, имеющего вязкость 4-10 сантипуаз, более предпочтительно 4-6 сантипуаз при температуре 37^oС.

Кроме того, содержание низкомолекулярного Poloxamer 188, имеющего такую же вязкость, как и в том случае, когда содержание высокомолекулярного Poloxamer 407 составляет 5-10 мас.% при 37^oС, составляет 7,5-15 мас.% Также содержание Poloxamer 188, имеющего такую же вязкость, как и в том случае, когда более предпочтительное содержание Poloxamer 407 составляет 5-7,5 мас.% при 37^oС, составляет 7,5-12,5 мас.% Поэтому можно сделать вывод о том, что для получения предпочтительной вязкости лучше использовать низкомолекулярный Poloxamer 188 в количестве 7,5-15 мас.%, более предпочтительно - 7,5-12,5 мас.%
Из результатов, полученных в вышеописанных экспериментах, следует, что среди различных полимеров, которые могут быть использованы в качестве основы препарата для местного применения с целью контроля скорости выделения активного ингредиента и защиты области раны физически, может быть использован сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена, имеющий вязкость 4-10 сантипуаз, в особенности 4-6 сантипуаз, при 37^oС, 60 об/мин, в соответствии с данным изобретением для получения препарата для местного применения, оказывающего хорошее действие по заживлению ран.

Изобретение относится к композиции для местного применения, содержащей фактор роста эпидермиса человека (hEGF). Ранозаживляющую композицию получают с применением 5-15 мас. % сополимера полиоксиэтилена-полиоксипропилена, имеющего вязкость 4-10 сП при 37^oС, 60 об/мин, в качестве основы состава для местного применения. Технический результат - улучшение способности фактора роста эпидермиса человека по заживлению ран, и, следовательно, композиция может быть использована для лечения кожных повреждений, включая раны, разрезы, ожоги и т.д. 6 з.п.ф-лы, 3 табл.

1. Ранозаживляющая композиция для местного применения, включающая эффективное количество фактора роста эпидермиса человека для заживления ран и 5-15 мас.%, сополимера полиоксиэтилена-полиоксипропилена, имеющего вязкость 4-10 сП при 37^oС, 60 об/мин. 2. Композиция по п.1, где фактор роста эпидермиса человека содержится в количестве от 0,01 до 1000 мг/мл. 3. Композиция по п.1, где вязкость сополимера полиоксиэтилена-полиоксипропилена при 37^oС, 60 об/мин составляет 4-6 сП. 4. Композиция по п.1, где сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена имеет молекулярную массу от 10000 до 15000, и его количество составляет от 5 до 10 мас.%. 5. Композиция по п.4, где сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена имеет молекулярную массу от 10000 до 15000, и его количество составляет от 5 до 7,5 мас.%. 6. Композиция по п.1, где сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена имеет молекулярную массу от 7000 до 10000, и его количество составляет от 7,5 до 15 мас.%. 7. Композиция по п.6, где сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена имеет молекулярную массу от 7000 до 10000, и его количество составляет от 7,5 до 12,5 мас.%.