СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИТОХИТОДЕЗА Российский патент 2003 года по МПК A61K35/78 A61K31/722 

Изобретение относится к области получения биологически активных веществ естественного происхождения и касается синтеза комплексов на молекулярном уровне хитодеза - водорастворимой формы хитозана с сухим экстрактом лекарственного растения или фитосборов, которые могут быть использованы в медицине в качестве биологически активной добавки к пище, в ветеринарии и косметике.

Известно применение кислоторастворимого хитозана (или хитина) в качестве биологически активных добавок (БАД) к пище: Хитосорб (Neways, Inc. U.S.A); Хиторич (Enrich Int. U. S. A); Хитосан (Pharma - Med Inc. U.S.A); Хитозан (Tanshi Group, Китай); Хитозан Альга плюс (Литораль, Санкт-Петербург); Хитан (Биоинженерия, Москва). В этих БАД хитозан (или хитин) используется в виде мелкодисперсного порошка в чистом виде или механически совмещенным с аскорбиновой кислотой, порошком бурых морских водорослей (морская капуста, фукус), цветной капусты и вспомогательных компонентов (лимонная кислота, желатин и другие).

Для растворения хитозана в кислой среде требуется существенно больше времени по сравнению с временем пребывания содержимого в желудке и двенадцатиперстной кишке, хитин в этих средах вовсе не может быть переведен в растворимое состояние. Поэтому в желудочно-кишечном тракте эти БАД в основном выполняют роль энтеросорбента, усвоение хитозана, проникновение в кровь и различные органы затруднено.

Известны способы лечения различных заболеваний с помощью БАД к пище на основе хитодеза и сухих экстрактов сборов лекарственных растений (фитохитодезов), технология получения которых не раскрыта [Трескунов К.А., Комаров Б.А. Способ лечения онкозаболеваний. Патент РФ 2165253 от 20.01.98; Способ лечения бронхиальной астмы. Патент РФ 2172634 от 18.08.98; Погорельская Л.В., Трескунов К.А. и др. Способ лечения инфекционных заболеваний. Патент РФ 2174000 от 22.02.2000].

Ближайшим решением является способ, описанный в патенте 2174000 от 22.02.2002 "Способ лечения инфекционных заболеваний" и включающий получение фитохитодеза - молекулярного комплекса экстракта лекарственного растения или фитосбора и хитодеза - водорастворимой формы хитозана полифракционного состава. Недостатками этого способа являются: получение экстрактов лекарственных растений или фитосборов только в среде нейтральной воды, отсутствие в хитозане полифракционного состава фракций с числом звеньев в цепи от мономера - глюкозамина до 10-мера и фракции с молекулярной массой (ММ) от 120 до ~150 kDa, а также использование хитозана с определенной степенью деацетилирования (СД).

Расширение биологической активности достигается путем получения жидкого экстракта, сухого лекарственного растения или фитосбора в деминерализованной воде или в присутствии основания, кислоты, олигомеров хитозана в форме катионного или анионного полиэлектролита, раствор фитохитодеза получают путем растворения хитодеза на основе хитозана полифракционного состава с молекулярной массой от мономерного звена - глюкозамина до ~150 kDa и степенью деацетилирования от ~68 до ≤95% в жидком экстракте растительного сырья при соблюдении соотношения в целевом продукте хитодеза и сухого экстракта, равном 1: 0,6-0,9.

Известно, что в методах фитотерапии применяют лекарственные растения и их сборы при максимально возможном извлечении комплекса биологически активных соединений [Фитотерапия. Методические рекомендации 2000/63 МЗ РФ М:2000]. При получении настоев, отваров и жидких экстрактов из растительного сырья в заводских условиях извлекается не более 10-15% биологически активных веществ (БАВ), поэтому степень утилизации сырья достигает 60-65%, а при многотоннажности загрузок потери БАВ увеличиваются [С.И. Успенская, В.В. Дюкова, Е. Б. Романенко, Л.В. Прохорова, А.Б. Лапин, Н.Б. Леонидов. Сухие растительные экстракты - новая технология, новое качество. -Российский хим. журн., 1997, т. 41, 5, с. 124]. Кроме этого, существуют проблемы, связанные с дозированием, хранением и транспортировкой настоев, отваров и жидких экстрактов.

Эти недостатки в существенной степени устраняются при использовании сухих экстрактов, основными стадиями в технологии получения которых являются экстракция и высушивание водных экстрактов. С целью максимального извлечения БАВ из растительного сырья ГНИИ "Биоэффект" разработан специальный метод полифракционного извлечения БАВ путем подбора эстрагентов и кратности обработки, экспериментально устанавливаемые для каждого сырья, с последующей распылительной сушкой или лиофилизацией в зависимости от термостабильности извлекаемых БАВ. При лиофильной сушке летучие компоненты: насыщенные и ненасыщенные органические кислоты, их эфиры и полиароматические соединения частично теряются [С. И. Успенская, В.В. Дюкова, Е.Б. Романенко, Л.В. Прохорова, А.Б. Лапин, Н.Б. Леонидов. Сухие растительные экстракты - новая технология, новое качество. - Российский хим. журн., 1997, т. 41, 5, с. 124].

Предлагаемый метод извлечения БАВ из растительного сырья в деминерализованной воде или в растворе олигомера хитозана в присутствии (и без) хлористоводородной кислоты и лиофилизация жидких экстрактов в присутствии хитозана полифракционного состава позволяют в максимальной степени избежать потерь БАВ. Образование прочных комплексов и хелатов с хитозаном способствует более полному извлечению из сырья и уменьшает летучесть компонентов экстрагированных БАВ при лиофилизации. Это приводит к увеличению количества экстрагируемых веществ и повышению биологической активности экстракта.

Испытания фитохитодезов в качестве БАД к пище начаты с 1992 г. Применение фитохитодезов в клинической практике позволило обнаружить высокую их эффективность в профилактике и лечении различных заболеваний [Червинец В.М., Богатов В.В., Соловьев В.А., Шомина С.А., Петрова М.Б., Комаров Б.А. Способ повышения чувствительности бактерий к биодеструктивному действию лазерного излучения в сочетании с фотосенсибилизатором. - Патент РФ 2151601 от 09.09.1999; Червинец В. М., Комаров Б.А. Способ лечения хронического гастрита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. - Патент РФ 2150271 от 13.10.1999; Трескунов К.А., Комаров Б.А. Способ лечения онкозаболеваний. - Патент РФ 2165253 от 20.01.1998; Червинец В.М., Богатов В.В., Шомина С.А., Комаров Б.А. Способ местного лечения острых периостатитов. - Патент РФ 2153318 от 13.10.1999; Трескунов К.А., Комаров Б.А. Способ лечения бронхиальной астмы. - Патент РФ 2172634 от 18.08.1998; Погорельская Л.В., Трескунов К. А. , Трякина И.П., Комаров Б.А., Турьянов М.Х., Петрова Е.В. Способ лечения инфекционных заболеваний. - Патент РФ 2174000 от 22.02.2000].

Предлагаемый способ получения фитохитодезов на основе пищевого хитозана полифракционного состава испытан в лабораторных и производственных условиях. В настоящее время производятся опытные партии фитохитодезов, которые находятся на сертификации в Федеральном Центре Госсанэпидемнадзора МЗ РФ.

Сущность изобретения демонстрируется следующими примерами.

Пример 1. В эмалированную емкость объемом 8 л заливают 5-5,5 л деминерализованной воды, нагревают до кипения, загружают 500 г сухого, измельченного в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи фитосбора: лист мяты перечной, подорожника большого, цвет ромашки лекарственной по 2 вес. части, трава зверобоя продырявленного и тысячелистника обыкновенного по 1 вес. части - доводят до кипения и кипятят в течение 3 мин, затем настаивают при температуре 50-60^oС в течение 1 ч. После фильтруют и отжимают, объем доводят до 3,4 л. Приготавливают 2-3 мас.% раствор высокомолекулярного хитозана (с ММ=300-500 kDa и определенным значением СД) в водной уксусной кислоте 1 мас. %, при необходимости фильтруют, затем при перемешивании порционно добавляют 2,5 мас.% водного раствора NaOH и доводят рН среды до 6,8-7,5. Высадившийся хитозан отфильтровывают, промывают деминерализованной водой, доводят содержание хитозана в суспензии до 2-3 мас.% и обрабатывают перекисью водорода концентрации 0,1-0,15 мас. % при ≤80^oС в течение 10-50 мин с последующей двух- или трехкратной промывкой деминерализованной водой и отжимом суспензии до содержания хитозана ~ 7,2 мас. %. При ≤40^oС в 3,4 л жидкого экстракта растворяют 47,1 г L-глутаминовой кислоты при перемешивании гомогенизатором марки MPW-302 в течение 1-1,5 мин, после этого при интенсивно работающем гомогенизаторе порционно добавляют навески фракций хитозана: 400 г суспензии хитозана, 7,2 мас. % (28,8 г) с ММ 80-100 kDa и СД 80-85%; 450 г суспензии хитозана, 7,2 мас. % (32,4 г) с ММ 80-100 kDa и СД 68-72%; 70 г суспензии хитозана, 7,2 мас. % (5,04 г) с ММ ≤25 kDa и СД 80-85%; 80 г суспензии хитозана, 7,2 мас. %, (5,76 г) с ММ ≤25 kDa и СД 68-72% в соответствии с мольным отношением L-глутаминовой кислоты и NН₂-групп всех фракций хитозана, равным 1: 1, и перемешивают до растворения в течение 1,5-2 мин. Полученный раствор замораживают и лиофилизируют. Выход сухого фитохитодеза 218 г, содержание сухого экстракта фитосбора 98,9 г (45,4 мас.%). Выход сухого экстракта (на 100 г исходного сухого растительного сырья) 19,8 мас.%.

Пример 2. Аналогично примеру 1, но экстракцию фитосбора: плоды шиповника коричного, корень солодки голой, трава мяты перечной и зверобоя продырявленного по 2 вес. части, трава крапивы двудомной и донника лекарственного по 1 вес. части - проводят в растворе олигомеров хитозана с числом звеньев в цепи от 1 до 10 в деминерализованной воде при отношении концентраций растительного сырья и олигомеров хитозана, равном, мас.%: 8,3-9,1:026. Выход сухого фитохитодеза 191,6 г, содержание сухого экстракта фитосбора 72,5 г (37,9 мас.%). Выход сухого экстракта (на 100 г исходного сухого растительного сырья) 14,5 мас.%.

Пример 3. Аналогично примеру 1, но экстракцию кукурузных рылец проводят в растворе олигомеров хитозана с числом звеньев в цепи от 1 до 10 и хлористоводородной кислоты в деминерализованной воде при отношении концентраций растительного сырья, олигомеров хитозана и хлористоводородной кислоты, равном, мас. %: 8,3-9,1: 0,026:0,0053. Выход сухого фитохитодеза 179,1 г, содержание сухого экстракта растения 60 г (33,5 мас.%). Выход сухого экстракта (на 100 г исходного сухого растительного сырья) 12 мас.%.

Пример 4. Аналогично примеру 1, но экстракцию листьев брусники проводят в растворе хлористоводородной кислоты, 0,0053 мас.%, в деминерализованной воде. Выход сухого фитохитодеза 177,2 г, содержание сухого экстракта растения 58,1 г (32,8 мас.%). Выход сухого экстракта (на 100 г исходного сухого растительного сырья) 11,6 мас.%.

Пример 5. Аналогично примеру 1, но экстракцию омелы белой при кипячении в течение 10 мин проводят по четырем способам, описанным в примерах 1, 2, 3 и 4, и совмещают равные объемы жидких экстрактов. Выход сухого фитохитодеза 199,1 г, содержание сухого экстракта растения 80 г (40,1 мас.%). Выход сухого экстракта (на 100 г исходного сухого растительного сырья) 16 мас.%.

Пример 6. Аналогично примеру 1, но экстракцию фитосбора: корень аира болотного, лапчатки прямостоячей и солодки голой, трава крапивы двудомной, пастушьей сумки, сушеницы топяной, тысячелистника обыкновенного, полыни горькой, фиалки трехцветной, вероники дубравной, лист эвкалипта и цвет пижмы обыкновенной, кора ивы по 2 вес. части, донник лекарственный 1 вес. часть - проводят в растворе хитозанилмоноамида янтарной кислоты [Патент РФ 2144040 от 07.04.1998] на основе олигомеров хитозана с числом звеньев в цепи от 1 до ~ 10 в деминерализованной воде при отношении концентраций фитосбора и олигомерного хитозанилмоноамида янтарной кислоты, равном, мас.%:8,3-9,1:0,026, а навески фракций хитозана: 850 г суспензии хитозана, 7,2 мас.% (61,2 г) с ММ 100 - 120 kDa и СД 80-85% и 150 г суспензии хитозана, 7,2 мас.% (10,8 г) с MM ≤25 kDa и СД 80-85% разбавляют полученным экстрактом фитосбора до содержания хитозана в суспензии 4 мас.% и проводят аморфизацию хитозана путем интенсивного перемешивания в течение ≥1,5 мин гомогенизатором марки MPW-302, затем при умеренно работающем гомогенизаторе в течение ~3 мин порционно добавляют эквимолярное количество янтарного ангидрида (32,6 г на 72 г сухого хитозана) в виде порошка с размером частиц не более 100 мкм. Продукт выделяют лиофилизацией. Выход сухого фитохитодеза 200 г, содержание сухого экстракта фитосбора 95 г (47,5 мас.%). Выход сухого экстракта (на 100 г исходного сухого фитосбора) 19,0 мас.%.

Пример 7. Аналогично примеру 6, но экстрагируют фитосбор (состав идентичен составу фитосбора в примере 2) в деминерализованной воде при 40-50^oС в течение ~ 48 часов, аморфизацию хитозана в виде его суспензии (~4 мас.%) в экстракте фитосбора осуществляют в реакторе с высокоскоростной дисковой мешалкой, а янтарный ангидрид берут в количестве на ~15% большем эквимолярного (37,5 г на 72 г сухого хитозана). Выход сухого фитохитодеза 194,5 г, содержание сухого экстракта фитосбора 85 г (43 мас.%). Выход сухого экстракта (на 100 г исходного сухого фитосбора) 17 мас.%.

Обнаруженная в клинической практике высокая эффективность фитохитодеза в определенной степени обусловлена частичным проникновением хитозана в кровь и различные органы. Этот факт установлен на количественном уровне при специальном исследовании динамики проникновения и выведения олигомеров ³H-хитозана с числом звеньев в цепи от 1 до 10 в кровь и различные органы самцов мышей линии С-57/ВС. Олигомеры ³Н-хитозана вводились в виде раствора в воде в дозе 4 мг/кг веса животного (~100 мкг на одно животное), что соответствует приему 5-7 раз в день двойных доз для человека весом 70-90 кг (1 доза хитодеза равна 25 мг).

Оказалось, что наиболее активно ³Н-хитозан проникает в печень, в которой максимальное его содержание (≤1,2 мас.% от введенного количества) обнаруживается через 3 минуты после перорального введения, затем содержание хитозана сначала снижается быстро (до ~ 15 мин), потом плавно (до 20 часов). Отметим, что в крови и органах ³H-хитозан обнаруживается уже через 1 мин после введения. Существенно, что качественные испытания кислоторастворимого ³H-хитозана с ММ 87 kDa и СД 76%, полученном методом гетерогенной деструкции (что приводит к полифракционности состава), также обнаруживают проникновение в кровь и различные органы, но в этом случае через 15 мин его содержание в крови в ~1,7 раз меньше по сравнению с олигомерным ³H-хитозаном при равных дозах и условиях введения, в дальнейшем содержание в крови этих двух типов ³H-хитозана выравнивается. Содержание кислоторастворимого ³H-хитозана в печени через 15 мин после введения в три раза меньше, чем олигомерного ³H-хитозана. Очевидно, что изменением содержания олигомерной фракции (от 1 до 10 звеньев в цепи) в хитозане полифракционного состава можно регулировать степень проникновения его в кровь и различные органы.

Особенно важные результаты получены при исследовании динамики проникновения и выведения кислоторастворимого ³H-хитозана при его введении per os в водном экстракте сбора лекарственных растений: плоды шиповника коричного, корень солодки голой, трава мяты перечной и зверобоя продырявленного по 2 вес. части, трава крапивы двудомной и донника лекарственного по 1 вес. части [Погорельская Л.В., Трескунов К.А., Трякина И.П., Комаров Б.А., Турьянов М. Х. , Петрова Е.В. Способ лечения инфекционных заболеваний. - Патент 2174000 22.02.2000] . Обнаружено, что после введения в течение ~2 часов содержание ³H-хитозана в крови и органах практически не изменяется, а с 2 до 4 часов наблюдается тенденция к увеличению содержания ³H-хитозана в крови, почках и тимусе. Исключением является печень, включение в которую ³H-хитозана подавляется в течение времени наблюдения. Данное явление может быть обусловлено особой ролью растительных лектинов, некоторые из которых могут выполнять роль хитозаназы (или хитиназы) [Погорельская Л.В., Корсун В.Ф., Журавлев Ю. С. , Турьянов М.Х. Фитотерапия в инфекционной практике. - М.: РМАПО МЗ, 1998, с. 44].

Исследования продолжаются. Но уже сейчас можно заключить, что многие обнаруженные разными исследователями и школами свойства пищевого хитозана обусловлены именно его способностью к частичному быстрому усвоению и проникновению в кровь и различные органы при условии наличия, по-видимому, в хитозане подобной олигомерной фракции, точнее, при условии применения хитозана полифракционного состава в виде его водорастворимой формы. Высокомолекулярная фракция хитозана выполняет важную роль энтеросорбента с эффективными бактериостатическими свойствами [Патент РФ 2174000 от 22.02.2002]. Этот факт может лежать в основе разнообразных положительных эффектов в клинической практике применения хитодезов и фитохитодезов.

Кроме этого, эффективность хитодеза может быть обусловлена важным его качеством растворимости в воде, слюне. При пероральном применении только водорастворимых форм хитозана при постепенном изменении среды в двенадцатиперстной кишке от кислой до нейтральной или слабо щелочной (7<рН≤7,3) возможен переход хитозана в коллоидное состояние. (Известно, что для фазового выделения кислоторастворимого хитозана потребуется увеличение рН среды до значений 8,5-9,0). Удельная поверхность коллоидных частиц может достигать 10⁶-10⁸ м² на 1 г. Очевидно, что адсорбционные, хелато- и комплексообразующие свойства хитозана в этом состоянии существенно усиливаются, что повышает детоксицирующее, противовоспалительное действие, а также способствует эффективной очистке эпителия кишечника, устранению причин целиаз-болезни. Повышенная активность хитозана в коллоидном состоянии позволяет применять умеренные дозы на один прием - 25 мг хитодеза и 15-23 мг сухого экстракта лекарственных растений, что облегчает изменение дозировки и порядка приема в острых случаях.

Биологическая активность фитохитодезов зависит также от степени экстракции БАВ из растительного сырья. Присутствие хитозана в лиофилизируемом растворе способствует уменьшению потерь летучих компонентов в экстракте, что также способствует в конечном итоге повышению биологической активности фитохитодезов и сохранению этой активности более длительное время. Определенную роль играет среда, в которой происходит экстракция растительного сырья. Присутствие в деминерализованной воде небольших количеств основания (пример 2) или кислоты (пример 4) олигомеров хитозана в виде катионного полиэлектролита (пример 3) или анионного полиэлектролита (пример 6) может способствовать более полной экстракции из растительного сырья веществ с противоположными функциональными группами.

Изобретение относится к медицине, ветеринарии и косметике. Получают фитохитодез - молекулярный комплекс хитодеза водорастворимой формы хитозана полифракционного состава с молекулярной массой от мономерного звена - глюкозамина до ~150 kDa и степенью деацетилирования от ~68 до ≤95% с сухим экстрактом лекарственного растительного сырья. Причем получение хитодеза проводят на основе хитозана, выделенного из раствора щелочью при рН 6,8-7,5 и аморфизированного, и органической кислоты или ангидрида органической кислоты. Стадию получения раствора хитодеза осуществляют в жидком экстракте лекарственных растений в деминерализованной воде при условии соотношения в целевом продукте хитодеза и сухого экстракта фитосбора 1 : 0,6-0,9 соответственно и выделяют целевой продукт методом сублимационной сушки. Изобретение позволяет повысить биологическую активность средства.

Способ получения фитохитодеза - молекулярного комплекса сухого экстракта лекарственного растения или фитосбора и хитодеза водорастворимой формы хитозана полифракционного состава, включающий выделение целевого продукта методом сублимационной сушки, отличающийся тем, что готовят гомогенный раствор хитозана, его выделяют путем обработки щелочным агентом до рН среды 6,8-7,5, проводят аморфизацию хитозана в виде его водной суспензии в кавитационных или механических полях со сдвиговым воздействием в присутствии неорганических, органических кислот или их ангидридов в жидком экстракте сухого лекарственного растения или фитосбора, полученного в деминерализованной воде, или в деминерализованной воде в присутствии кислоты, или в деминерализованной воде в присутствии олигомеров хитозана в форме катионного или анионного полиэлектролита, причем используют хитозан полифракционного состава с молекулярной массой от мономерного звена - глюкозамина до ~ 150 kDa и степенью деацетилирования от ~ 68 до ≤95%, а раствор фитохитодеза получают путем растворения образовавшегося хитодеза на основе хитозана в жидком экстракте растительного сырья при соблюдении соотношения в целевом продукте хитодеза и сухого экстракта 1 : 0,6-0,9 соответственно.