СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ К БИОДЕСТРУКТИВНОМУ ДЕЙСТВИЮ ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ В СОЧЕТАНИИ С ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОМ Российский патент 2000 года по МПК A61K31/722 A61N5/67 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, лазерной медицине. Низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ) в практической медицине применяют в основном для стимуляции нарушенных обменных процессов и трофики тканей (1), в частности, в хирургической практике для воздействия на раневой процесс с целью ускорения заживления различных ран и предупреждения их нагноения. Однако НИЛИ оказывает незначительное бактериостатическое при полном отсутствии бактерицидного действия на биологические свойства золотистых стафилококков (2) и других видов бактерий (3, 4).

Для повышения эффективности лазерного излучения применяют фотосенсибилизаторы (ФС) в основном в онкологической практике как средство усиления цитотоксичности и фотоактивности в отношении раковых клеток (5). О фотосенсибилизаторах, повышающих чувствительность микроорганизмов к лазерному изучению, в литературе имеются мало сообщений. Так, например, предложены различные красители (6): кристаллический фиолетовый тионин, метиленовый синий, протопорфирин IX, дериваты гематопорфирина, толлуидинового синего О, дисульфонат алюминий фталоцианин, которые проявляли киллинговую активность при действии лазерного излучения плотностью от 16 до 320 J/см², максимальная гибель бактерий при этом была не выше 99%.

К недостаткам указанных способов можно отнести: 1) необходимость поддерживать постоянную концентрацию растворов фотосенсибилизаторов, 2) невозможность предотвратить диффузию и растекание красителей в тканях, 3) отсутствие прочных связей красителей с поверхностными структурами микроорганизмов, 4) отсутствие эффекта концентрации красителя на поверхности микроорганизмов, 5) длительность окрашивания, связанная с необходимостью использования низких концентраций красителей во избежание повреждения соматических клеток, 6) недостаточная антибактериальная активность, 7) отсутствие иммуномодулирующего эффекта, 8) использование с лазерами большой мощности и высокой плотностью потока лазерного изучения и т.д.

Прототипом заявляемого способа, по нашему мнению, является способ повышения чувствительности микроорганизмов к биодеструктивному действию лазерного излучения (7), основанный на обработке микроорганизмов 1% (масса/объем) водным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) или молибдата аммония (МА) в течение 5-10 сек с последующим воздействием равного объема 0,25% (масса/объем) раствора метиленовой сини (МС). Предполагалось, что на поверхности бактерий формируется биопленка с метиленовым синим, который и является фотосенсибилизатором.

К недостаткам прототипа можно отнести: 1) применение ФВК и МА как соединений, содержащих ионы вольфрама и молибдена, которые в той или иной степени могут оказывать токсичное влияние на клетки организма человека, 2) подобные комплексы могут служить аллергизирующим фактором, 3) не оказывает иммуностимулирующего и ранозаживляющего действия.

Авторы предлагают оригинальный способ обоснования применения хитозана с метиленовой синью в качестве средства (фотосенсибилизатора), повышающего чувствительность бактерий к низкоинтенсивному лазерному облучению. В качестве препарата, способного вступать во взаимодействие с различными отрицательно зараженными молекулами красителей, протеинов, гликопротеинов поверхности микроорганизмов нами был выбран хитозан.

Хитозан, представляющий собой аминополисахарид естественного происхождения из хитина панциря краба, состоит из звеньев 2-амино-D-глюкозы и N-ацетилглюкозамина, вызывает пролонгирующее действие лекарственных препаратов, усиливает их лечебный эффект. Хитозан разрешен МЗ РФ как пищевая добавка - структурообразователь. Кроме того, хитозан обладает сорбционной, деадгезивной и иммуномодулирующей активностью (8, 9). Эти положительные свойства и послужили основой использования хитозана в качестве сорбента, способного вступать в реакции комплексообразования одновременно с разными классами отрицательно заряженных молекул (метиленовая синь - протеины оболочки микроорганизмов). При этом, к поверхности микробных клеток при помощи хитозана прочно прикрепляется NNN'N'-тетраметилтионинхлорид (метиленовая синь), являющаяся фотосенсибилизирующей меткой к лазерному изучению.

Способ заключается в обработке раны или воспалительного очага 1% раствором хитозана на 0,25% растворе водной соляной кислоте с 0,25% водным раствором метиленового синего и воздействуют НИЛИ в терапевтических режимах облучения.

В связи с этим целью нашей работы было изучение сравнительного влияния принципиально нового полупроводникового лазера ILD 650 АЛТ "Мустанг", (фирма "Техника", Москва) длиной волны красного диапазона (λ = 0,63 мкм), работающего в импульсном режиме (f = 80 Гц и f = 3000 Гц), и ИК-излучения (λ = 0,89 мкм, f = 80 Гц, "Мустанг 022") на жизнеспособность 16 видов грамположительных (St. aureus, Candida parapsilosis, Candida crusea, Acnietobacter anitratus, и др.) и грамотрицательных (Pseudomonas maltophila, Rs.putida, Hafnia alvei, Rhododorula и др.) микроорганизмов "in vitro" и "in vivo" в чистом виде и с применением ФС. Параметры лазерного излучения как "in vitro", так и "in vivo" были идентичными, а именно: время облучения ИК-лазера составляло 4 мин, P_mах = 10 Вт с разовой дозой облучения 0,02 Дж/см²; время облучения красного импульсного лазера также было 4 мин, P_mах = 5 Вт и разовой дозой облучения (f = 80 Гц) - 0,01 Дж/см², а при f = 3000 Гц - 0,4 Дж/см² (расчет доз по таблицам Козлова В.И. и Буйлина В.А. (10).

Для изучения морфологических изменений в ходе репаративной регенерации ран кожи использовались стандартные гистологические методики.

Эксперимент проводили в два этапа. Вначале исследовали действие НИЛИ длин волн различного диапазона на жизнеспособность микробных клеток и активность их ферментных систем при действии лазера в чистом виде и при предварительной обработке культур ФС.

Было установлено, что полупроводниковые лазеры красного и ИК-диапазонов, не влияли на изменение жизнедеятельности и патогенности исследуемых микроорганизмов. В то время как предварительная обработка бактерий ФС перед лазерным воздействием не только значительно уменьшало их количество на 2 - 6 порядков, но и в некоторых случаях способствовала выраженному бактерицидному эффекту. При этом результаты облучения были неоднозначными. Так количество грамотрицательных бактерий, обработанных фотосенсибилизатором в суббактериостатической концентрации, снижалось с 5•10⁹ КОЕ/г до 1•10² КОЕ/г как при использовании ИК-излучения, так и красного импульсного лазера в одинаковой степени при частоте 80 Гц и 3000 Гц. Однако 100% гибель золотистого стафилококка, нагруженного ФС, вызывало только ИК-излучение. В то время как красный импульсный лазер при воздействии на данный штамм, не зависимо от частоты излучения, оказывал лишь уменьшение их количества.

В эксперимент на животных (42 крысы линии "Вистар" средним весом 120 г) брали St. aureus штамм 236, обладающий повышенной жизнестойкостью и выраженной патогенностью (попытка использования других микроорганизмов была безуспешной в связи с их быстрой гибелью и в конечном счете загрязнением раны золотистым стафилококком). На спине у крыс в межлопаточной области делали скальпированную, открытую рану размером 1х1 см. В нее вводили суточную суспензию St. aureus, соответствующую стандарту мутности N 6 по Mс Farland. Через 3 дня формировался воспалительный процесс. Все обследуемые животные были разбиты на 5 групп в зависимости от применения различных длин волн лазерного излучения и наличия фотосенсибилизатора (табл. 1).

Первая и вторая группы (рана обрабатывалась ФС) по 9 крыс подверглись, соответственно, воздействию импульсного НИЛИ красного и инфракрасного диапазонов выше представленными параметрами. В третьей и четвертой группах (рана не обрабатывалась ФС) также по 9 крыс и также использовали идентичные параметры лазерного излучения. НИЛИ проводили в течение 5 дней. Контрольную группу, рана которых, обрабатывалась только фотосенсибилизатором без применения лазера, составили 6 крыс. Эффективность воздействия оценивали по изменению культуры бактерий, взятой из раны до и после лазерной обработки.

В результате проведенных исследований установлено, что в группе крыс, рана которых не обрабатывалась фотоактивным веществом, количество выделенного из биоптата штаммов St. aureus, после применения импульсного НИЛИ красного и инфракрасного диапазонов было таким же, как и в контрольной группе, не зависимо от кратности облучения. В группе крыс, рана которых была обработана фотосенсибилизатором, красный импульсный лазер, также не вызывал снижения количества жизнеспособных бактерий по сравнению с контролем. В то время как ИК-лазер в группе крыс, рана которых была обработана фотосенсибилизатором, достоверно снижал количество St. aureus в биоптатах в 2-4 раза (p<0,05).

В дополнение к изучению бактериостатического эффекта были исследованы некоторые биохимические свойства стафилококков. При этом были получены неоднозначные результаты ферментативной активности исследуемых микроорганизмов. Было установлено, что в группе животных, рана которых обрабатывалась ФС, применение импульсного НИЛИ как красного, так и инфракрасного диапазонов в 2 раза усиливало каталазную активность St. aureus у 53,8% бактерий, по сравнению с группой, не обработанной ФС (p<0,05). В то время как у другой половины бактерий каталазная активность оставалась без изменений. Время положительной реакции на уреазу уменьшалось у 33,3% выделенных St. aureus, увеличивалось у 50% и оставалось на прежнем уровне также у 16,7% бактерий по сравнению с контролем (p<0,05). Гликолитическая активность золотистого стафилококка также была неодинаковой. Так, у 32,5% выделенных St. aureus она усиливалась по своей интенсивности в отношении глюкозы, лактозы, мальтозы, сахарозы и маннита. У 50% стафилококков - уменьшалась в отношении тех же сахаров и у остальных 17,5% - не изменялась (табл. 2).

Результаты микробиологического анализа содержимого ран экспериментальных животных коррелируют со светооптическими исследованиями.

При макроскопическом исследовании новообразованных тканей при заживлении экспериментальных ран отмечены некоторые отличия между группами животных сравниваемых серий (табл. 3).

Данные визуальных наблюдений находятся в соответствии с микроскопическими изменениями, происходящими в области повреждения (табл. 4, 5).

Микроскопические изменения, происходящие в области повреждения, подтверждают данные визуальных наблюдений.

Таким образом, в условиях применения ИК-лазера в сочетании с ФС изменяется скорость и характер осуществления отдельных этапов посттравматической регенерации инфицированных ран кожи, что приводит к сокращению общих сроков заживления на 3 дня.

Результаты нашего исследования показали, что как "in vitro" и "in vivo" эффективность воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения значительно возрастает при применении фотосенсибилизирующего вещества в большей степени при ИК-излучении, что подтверждают данные гистологических исследований. При этом выявлена неоднозначная ферментативная реакция St. aureus на лазерное облучение, свидетельствующая об их широких адаптационных возможностях, что требует дальнейшего изучения и объяснения. При этом нами не выявлены преимущества изолированного применения красного импульсного излучения в эксперименте, по сравнению с инфракрасным, что, вероятно, свидетельствует о необходимости более широкого осмысления и изучения вариантов сочетанного применения длин волн различного диапазона.

Преимущество предлагаемого способа повышения чувствительности бактерий к биодеструктивному действию лазерного излучения заключается в том, что в качестве фотосенсибилизатора применяется 1% раствор хитозана на 0,25% водной соляной кислоте в сочетании с 0,25% водным раствором метиленовой сини. Высокомолекулярный хитозан способен частично связываться с метиленовой синью и одновременно с отрицательно заряженными молекулами поверхности бактериальных клеток. Комплекс бактериальные клетки-хитозан-метиленовая синь становится восприимчивым к НИЛИ красного и особенно инфракрасного диапазонов. Кроме того, хитозан пролонгирует антисептическое действие метиленовой сини, обладает выраженным антимикробным, сорбционным, деадгезивным действием в отношении бактерий, а на поврежденные ткани в ране оказывает противовоспалительный, иммуномодулирующий эффект.

Литература
1. Лазеры в клинической медицине. Под рук. проф. С.Д.Плетнева // М., Мед., 1996, - 430 с.

2. Агуркова Г. Н. О действии лазерного излучения на некоторые свойства стафилококков. // Журн. микробиол.эпидемиол. и иммунол. - 1979, - N 5, - с. 101-103.

3. Баженов Р.А Влияние лазерного излучения на микроорганизмы. //Мед. журн. Узбекист. - 1991, N 7, - с. 26-28.

4. Байбеков И.М., Назыров Ф.Г., Ильхамов Ф.А и дp. Морфологические аспекты лазерных воздействий // Ташкент, 1996, - 208 с.

5. Печерских Е. В., Шитова Л.А., Якубовская Р.И и др. Исследование цитотоксичности и фотоактивности новых отечественных фотосенсибилизаторов в условиях in vitro. // В сб.: Лазерная и фотодинамическая терапия. Обнинск, 16-18 июня 1999, - с. 18-19.

6. "The Killing of Helicobacter pylori by low-power light in the presens of the photo sensitiser" Wilson C.E., Wilson M., Macrobert A.J., Sedwell J., Bown S.S. // J.Med.Microbiol., 1996, Apr., 44(4), - p. 245-252.

7. Стрелец Е.В., Богатов В.В., Червинец В.М., Чистов В.Б., Волков Ю.А. - Способ повышения чувствительности микроорганизмов к биодеструктивному действию лазерного излучения. - Уведомление о положительном результате формальной экспертизы (ФИПС 10 апр. 1998, от дел N 20), N 97121255/13 (023049).

8. Zonagen Inc. "Chitosan - induced immunopotency" US Patent N 94311532, 23.09.94.

9. Комаров Б.А., Трескунов К.А., Албулов А.И., Фоменко А.С. Применение хитодеза и фитохитодеза в клинической практике. //В сб.: Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана", Москва-Щелково, 1999, с. 148-150.

10. Козлов В.И, Буйлин В.А. Лазеротерапия с применением АЛТ "Мустанг" // М., Аспект-Пресс, 1995, - 143 с.

Изобретение относится к медицине и предназначено для повышения чувствительности бактерий к лазерному излучению в сочетании с фотосенсибилизатором. Воздействуют низкоинтенсивным лазерным излучением в сочетании с фотосенсибилизатором. В качестве фотосенсибилизатора используют хитозан с метиленовой синью. Способ позволяет эффективно повысить чувствительность бактерий к низкоинтенсивному лазерному излучению. 5 табл.

Способ повышения чувствительности микроорганизмов к биодеструктивному действию лазерного излучения в сочетании с фотосенсибилизатором, включающий воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения и фотосенсибилизатора, отличающийся тем, что в качестве фотосенсибилизатора применяют хитозан с метиленовой синью.