Настоящее изобретение относится к растительной белковой сыворотке, обогащенной аглюконизофлавоном, сывороточному белковому материалу на основе аглюконизофлавона, материалу на основе аглюконизофлавона, материалу с высоким содержанием генистеина, материалу с высоким содержанием даидзеина и способам их получения из растительной белковой сыворотки.
Изофлавоны содержатся в различных растениях из семейства бобовых, в том числе в растительных белковых материалах, например сое. Эти соединения включают в себя даидзин, 6''-ОАс даидзин, 6''-OMal даидзин, даидзеин, генистин, 6''-ОАс генистин, 6''-OMal генистин, генистеин, глицитин, 6''-ОАс глицитин, 6''-OMal глицитин, глицитеин, биочанин А, формононетин и кауместрол. Обычно горький привкус сои связан с содержанием этих соединений.
В процессе производства коммерческих продуктов, таких как растительные белковые изоляты и концентраты, особое внимание уделяется удалению этих материалов. Например, в традиционном процессе производства соевого белкового изолята, в котором соевые хлопья подвергаются экстракции в водной щелочной среде, большая часть изофлавонов растворяется в экстракте вместе с соевым белком. Белок осаждается из экстракта путем подкисления и отделяется для образования изолята, тогда как остающаяся сыворотка содержит большую часть растворенных изофлавонов. Изофлавоны, оставшиеся в белковом изоляте, осажденном кислотой, обычно удаляются с помощью тщательного промывания изолята. Сыворотка и промывная жидкость обычно отбрасываются. Изофлавоны, содержащиеся в растительной белковой сыворотке, содержат изофлавонглюкозиды (глюконы), конъюгаты изофлавона и аглюконизофлавоны. Изофлавонглюкозиды содержат молекулу глюкозы, присоединенную к изофлавоновому остову соединения. Конъюгаты изофлавона содержат дополнительные остовы, присоединенные к молекуле глюкозы, например, 6''-ОАс генистин содержит ацетатную группу, присоединенную к молекуле глюкозы в шестом положении. Аглюконизофлавоны состоят из изофлавонового остова, без присоединения молекулы глюкозы.
Соевая сыворотка содержит три «группы» изофлавоновых соединений, включающих, соответственно, глюкозид, конъюгат и аглюконовые части: группа генистеина, диадзеина и глицитеина. Группа генистеина включает в себя глюкозидгенистин, конъюгаты 6''-OMal генистина (6''-малоновый эфир генистина) и 6''-ОАс генистин (6"-уксусный эфир генистина) и аглюконгенистеин. Группа даидзеина включает в себя глюкозиддаидзин, конъюгаты 6''-OMal даидзин и 6''-ОАс даидзин и аглюкондаидзеин. Группа глицитеина включает в себя глюкозид глицитин, конъюгат 6''-OMal глицитин и аглюкон глицитеин.
Все изофлавоны представляют интерес для медицинских оценок, однако, аглюконы являются специфическими изофлавонами, представляющими особый интерес. Генистеин и даидзеин способны значительно уменьшить риск сердечно-сосудистых заболеваний ("Plant and Mammalian Estrogen Effects on Plasma Lipids of Female Monkeys", Circulation, vol.90, p.1259 (октябрь 1994)). Генистеин и даидзеин также, возможно, способны снимать симптомы состояний, вызванных пониженным или измененным уровнем эндогенного эстрогена у женщин в таких состояниях, как менопауза или предменструальный синдром. Кроме того, недавно было обнаружено, что аглюгонизофлавоны, содержащиеся в растительных материалах, таких как соя, способны останавливать рост раковых клеток у человека, например раковые клетки груди или простаты (Peterson, Bames, "Genistein Inhibition of the Growth of Human Breast Cancer Cells, Independence from Estrogen Receptors and the Multi-Drug Resistance Gene", Biochemical and Biophysical Research Communications, vol.179. No 1, pp.661-667, 30 августа, 1991; Peterson, Bames, "Genistein and Biochanin A Inhibit the Growth of Human Prostate Cancer Cells but not Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Autophosphorylation", The Prostate, vol 22, pp.335-345 (1993); и Barnes et al., "Soybeans Inhibit Mammary Tumors in Models of Breast Cancer", Mutagens and Carcinogens in the Diet. pp.239-253 (1990)).
Как сказано выше, аглюконизофлавоны включают в себя даидзеин, генистеин и глицитеин. Эти аглюконы имеют следующую общую формулу:
где R1, R2, R3 и R4 являются группами Н, ОН или ОСН3. Генистеин имеет данную формулу, в которой R1=OH, R2=H, R3=ОН и R4=OH, даидзеин имеет формулу, в которой R1=OH, R2=H, R3=Н и R4=OH, глицитеин имеет формулу, в которой R1=OH, R3=OCH3, R3=Н и R4=OH.
Настоящее изобретение касается аглюконов и обогащения растительной белковой сыворотки и сывороточного белкового материала этими соединениями, и, в особенности, материала с высоким содержанием генистеина, материала с высоким содержанием даидзеина и материала, содержащего аглюкониизофлавон. Данное изобретение также относится к способам получения обогащенной аглюконом растительной белковой сыворотки, обогащенного аглюконом материала растительного сывороточного белка, материала с высоким содержанием генистеина, материала с высоким содержанием даидзеина и материала, содержащего аглюконизофлавон.
Известен общий процесс превращения конъюгатов изофлавона, содержащегося в растительном белке, в аглюконизофлавоны, он описан в заявке на изобретение США N 08/477102, поданной 7 июня 1995 г., в настоящее время заявка находится на рассмотрении и принадлежит правопреемнику настоящего изобретения. Также известны способы превращения изофлавонглюкозидов в аглюконизофлавоны. Способ превращения изофлавонглюкозидов в аглюконизофлавоны в растительной белковой сыворотке описан в заявке на изобретение PCT/US94/10699, в настоящее время заявка находится на рассмотрении и принадлежит правопреемнику настоящего изобретения.
В области превращения изофлавонглюкозидов в аглюконизофлавоны известны и другие способы, описанные, например, Obata и др. в заявке на изобретение в Японии 258669. Такие процессы не предусматривают превращения конъюгатов изофлавона в аглюконизофлавоны или получения материала с высоким содержанием генистеина, материала с высоким содержанием даидзеина, или материала, содержащего аглюконизофлавон. Кроме того, такие способы позволяют достигать только умеренной степени конверсии гликозидов в аглюконы и требуют для достижения этой умеренной степени конверсии значительного промежутка времени. Таким образом, данные способы нежелательны для широкомасштабных коммерческих производств.
Целью настоящего изобретения явилось получение обогащенной аглюконизофлавоном растительной белковой сыворотки и разработка способа ее получения из растительной белковой сыворотки.
Другой целью настоящего изобретения явилось получение сывороточного белкового материала, содержащего аглюконизофлавон, и способ его получения из растительной белковой сыворотки.
Следующей целью настоящего изобретения явилось получение материала с высоким содержанием генистеина и способ его получения из растительной белковой сыворотки.
Дальнейшей целью настоящего изобретения явилось получение материала с высоким содержанием даидзеина и способ его получения из растительной белковой сыворотки.
Другой целью настоящего изобретения явилось получение материала, содержащего аглюконизофлавон, и способ его получения из растительной белковой сыворотки.
Эти и другие цели изобретения были достигнуты, как это описывается ниже, в подробном описании изобретения.
Сущность изобретения
Данные цели были достигнуты тем, что в способе получения растительного сывороточного материала, обогащенного аглюконизофлавоном, из растительного сывороточного материала, содержащего конъюгаты изофлавона, согласно изобретению растительный сывороточный материал обрабатывают при температуре 2°С-121°С и pH 6-13,7 до тех, пока больше 50% конъюгатов изофлавона не превратится в изофлавонглюкозиды; и упомянутые изофлавонглюкозиды подвергают ферментации в упомянутом растительном сывороточном материале при температуре 5°С-75°С и pH 3-9 до тех пор, пока больше 50% изофлавонглюкозидов не превратится в аглюконизофлавоны.
Предпочтительно растительный сывороточный материал обрабатывают при значении pH от 9 до 10 и температуре от 45°С до 73°С, в течение от 4 до 6 часов.
Более предпочтительно растительный сывороточный материал обрабатывают при значении pH от 10 до 11 и температуре от 5°С до 50°С, в течение от 0.5 до 1 часа.
В предпочтительном варианте осуществления способа по крайней мере 80% или даже 90% конъюгатов изофлавона превращают в изофлавонглюкозиды.
Упомянутые изофлавонглюкозиды подвергают ферментации в растительном сывороточном материале предпочтительно при температуре от 35°С до 45°С.
При этом ферментация включает в себя добавление эффективного количества добавочного фермента к растительному сывороточному материалу.
В качестве добавочного фермента предпочтительно используют сахаридазу, способную расщеплять 1,4-глюкозидные связи.
Используют добавочный фермент, выбранный из группы, включающей α-глюкозидазы, β-глюкозидазы, β-галактозидазы, глюко-амилазы, пектиназы и их смеси.
При этом, по крайней мере, 80% или 90% изофлавонглюкозидов превращают в аглюконизофлавоны.
В качестве растительного сывороточного материала можно использовать соевую сыворотку.
Способ предпочтительно включает выделение содержащего аглюконизофлавоны сывороточного белкового материала, содержащего белок и аглюконизофлавоны, из упомянутого растительного сывороточного материала, обогащенного аглтоконизофлавоном.
Содержащий аглюконизофлавоны сывороточный белковый материал предпочтительно выделяют с помощью по крайней мере одного метода из группы, включающей ультрафильтрацию, коагуляцию под воздействием тепла и обезвоживание.
Содержащий аглюконизофлавоны сывороточный белковый материал предпочтительно получают посредством вымораживания растительного сывороточного материала и отделения содержащего аглюконизофлавоны сывороточного белкового материала от охлажденной сыворотки.
При этом содержащий аглюконизофлавоны сывороточный белковый материал предпочтительно выделяют из концентрированного растительного сывороточного материала.
Поставленная цель достигается также тем, что в способе получения материала с высоким содержанием генистеина из растительного сывороточного материала, содержащего конъюгаты изофлавона, согласно изобретению растительный сывороточный материал обрабатывают при температуре 2°С-121°С и pH 6-13,7 до тех пор, пока больше 50% конъюгатов изофлавона не превратится в изофлавонглюкозиды, и упомянутые изофлавонглюкозиды подвергают ферментации в упомянутом растительном сывороточном материале при температуре 5°С-75°С и pH 3-9 до тех пор, пока больше 50% изофлавонглюкозидов не превратится в аглюконизофлавоны, затем выделяют содержащий аглюконизофлавоны сывороточный белковый материал, содержащий белок и аглюконизофлавоны из упомянутого растительного сывороточного материала, обогащенного аглюконизофлавоном, после чего производят экстракцию содержащего аглюконизофлавоны сывороточного белкового материала водно-спиртовым экстрагентом для получения экстракта, обогащенного аглюконизофлавоном, и осуществляют контакт получившегося экстракта с материалом адсорбента до тех пор, пока конечный материал не отделится от экстракта.
При этом используют водно-спиртовой экстрагент, содержащий от 30% до 90% спирта.
Предпочтительно используют водно-спиртовой экстрагент, имеющий значение pH около изоэлектрической точки упомянутого белка в данном содержащем аглюконизофлавон сывороточном белковом материале, в частности, используют водно-спиртовой экстрагент, имеющий значение pH от 3 до 6.
Содержащий аглюконизофлавоны сывороточный белковый материал предпочтительно экстрагируют экстрагентом, при этом весовое соотношение экстрагента и сывороточного белкового материала не превышает 11:1.
При этом содержащий аглюконизофлавоны сывороточный белковый материал предпочтительно дважды экстрагируют водно-спиртовым экстрагентом, причем общее весовое отношение количеств объединенных порций экстрагента и сывороточного белкового материала не превышает 11:1.
Можно использовать материал адсорбента, находящийся в форме частиц.
Контакт экстракта с материалом адсорбента предпочтительно включает обратимое связывание генистеина с материалом адсорбента.
Экстракт предпочтительро пропускают через материал адсорбента с элюентом для отделения материала с высоким содержанием генистеина от экстракта.
Материал с высоким содержанием генистеина содержит по крайней мере 40% генистеина, предпочтительно по крайней мере 90% генистеина.
Поставленная цель достигается также следующим изобретением - способом получения материала с высоким содержанием даидзеина.
В способе получения материала с высоким содержанием даидзеина из растительного сывороточного материала, содержащего конъюгаты изофлавона, согласно изобретению растительный сывороточный материал обрабатывают при температуре 2°С-121°С и pH 77 6-13,7 до тех пор, пока больше 50% конъюгатов изофлавона не превратится в изофлавонглюкозиды, и упомянутые изофлавонглюкозиды подвергают ферментации в упомянутой растительном сывороточном материале при температуре 5°С-75°С и pH 3-9 до тех пор, пока больше 50% изофлавонглюкозидов не превратится в аглюконизофлавоны, затем производят выделение содержащего аглюконизофлавоны сывороточного белкового материала, содержащего белок и аглюконизофлавоны из упомянутого растительного сывороточного материала, обогащенного аглюконизофлавоном, и производят экстракцию содержащего аглюконизофлавоны сывороточного белкового материала водно-спиртовым экстрагентом для получения экстракта, обогащенного аглюконизофлавоном, и осуществляют контакт получившегося экстракта с материалом адсорбента до тех пор, пока материал с высоким содержанием даидзеина не отделится от экстракта.
При этом предпочтительно используют водно-спиртовой экстрагент, содержащий от 30% до 90% спирта, имеющий значение pH около изоэлектрической точки упомянутого белка в данном сывороточном белковом материале, содержащем аглюконизофлавон. В частности, используют водно-спиртовой экстрагент, имеющий значение pH от 3 до 6.
Содержащий аглюконизофлавоны сывороточный белковый материал предпочтительно экстрагируют экстрагентом при весовом отношении количеств экстрагента и сывороточного белкового материала, не превышающем 11:1.
В частности, содержащий аглюконизофлавоны сывороточный белковый материал предпочтительно дважды экстрагируют водно-спиртовым экстрагентом, причем общее весовое отношение количеств порций экстрагента и сывороточного белкового материала не превышает 11:1.
Можно использовать материал адсорбента, находящийся в форме частиц.
При этом контакт экстракта с материалом адсорбента также включает обратимое связывание даидзеина экстракта с материалом адсорбента.
Экстракт предпочтительно пропускают через материал адсорбента с применением элюента для выделения материала с высоким содержанием даидзеина из экстракта.
Материал с высоким содержанием даидзеина предпочтительно содержит по крайней мере 40% даидзеина.
Поставленная цель была также достигнута следующим изобретением - способом получения растительного сывороточного материала, обогащенного аглюконизофлавоном.
В способе получения растительного сывороточного материала, обогащенного аглюконизофлавоном, из растительного сывороточного материала, содержащего конъюгаты изофлавона, согласно изобретению растительный сывороточный материал обрабатывают при температуре 2°С-121°С и pH 6-13,7 до тех пор, пока больше 50% конъюгатов изофлавона не превратится в изофлавонглюкозиды; и упомянутые изофлавонглюкозиды подвергают ферментации в упомянутом растительном сывороточном материале при температуре 5°С-75°С и pH 3-9 до тех пор, пока больше 50% изофлавонглюкозидов не превратится в аглюконизофлавоны, выделяют содержащий аглюконизофлавоны сывороточный белковый материал, содержащий белок и аглюконизофлавоны, из упомянутого растительного сывороточного материала, обогащенного аглюконизофлавоном, подвергают экстрагированию содержащий аглюконизофлавоны сывороточный белковый материал водно-спиртовым экстрагентом для получения экстракта, обогащенного аглюконизофлавоном, и осуществляют контакт получившегося экстракта с материалом адсорбента до тех пор, пока материал, содержащий глицитеин, не отделится от экстракта.
При этом способ предпочтительно включает экстракцию содержащего аглюконизофлавоны сывороточного белкового материала водно-спиртовым экстрагентом для получения экстракта, обогащенного аглюконизофлавоном, и концентрирование получившегося экстракта до 15%-30% от его первоначального объема, а затем осаждение материала, содержащего аглюконизофлавон, посредством добавления воды к экстракту.
При этом водно-спиртовой экстрагент содержит от 30% до 90% спирта.
Содержащий аглюконизофлавоны сывороточный белковый материал предпочтительно экстрагируют экстрагентом при весовом соотношении количеств экстрагента и сывороточного белкового материала, не превышающем 11:1.
Содержащий аглюконизофлавоны сывороточный белковый материал предпочтительно дважды экстрагируют водно-спиртовым экстрагентом, причем общее весовое отношение количеств порций экстрагента к сывороточному белковому материалу не превышает 11:1.
При этом предпочтительно используют водно-спиртовой экстрагент, имеющий значение pH около изоэлектрической точки данного белка в данном аглюконизофлавоновом сывороточном белковом материале, в частности используют водно-спиртовой экстрагент, имеющий значение pH от 3 до 6.
К экстракту предпочтительно добавляют воду при весовом отношении вода:экстракт, составляющем от 6:1 до 8:1.
Осажденный материал, содержащий аглюконизофлавоны, предпочтительно промывают водой, причем весовое отношение вода:содержащий аглюконизофлавоны материал составляет от 0,8:1 до 2:1.
Экстракт и воду охлаждают для достижения максимально полного осаждения содержащего аглюконизофлавоны материала.
Способ предпочтительно включает растворение содержащего аглюконизофлавоны материала в водно-спиртовом растворе и контакт водно-спиртового раствора, содержащего растворенный содержащий аглюконизофлавоны материал, с материалом адсорбента до тех пор, пока материал с высоким содержанием генистеина или даидзеина не отделится от раствора.
Описание предпочтительных вариантов выполнения изобретения
Исходным материалом для осуществления способа является растительная белковая сыворотка, которая является водным раствором растворимых белков, изофлавонов и других водорастворимых соединений, остающихся после удаления сгустков белка из растительного белкового экстракта. В предпочтительном варианте выполнения изобретения исходным материалом является соевая сыворотка, так как этот способ особенно подходит для получения обогащенной аглюконизофлавоном сыворотки, аглюконизофлавонового сывороточного белкового материала, материала с высоким содержанием генистеина, материала с высоким содержанием даидзеина и материала, содержащего аглюконизофлавон, из продуктов сои.
Исходный растительный белковый материал содержит конъюгаты изофлавона, изофлавонглюкозиды и аглюконизофлавоны. Например, соевая сыворотка содержит: изофлавонглюкозиды - генистин, даидзин и глицитин; конъюгаты изофлавона - 6''-малоновые эфиры генистина, даидзина и глицитина и 6''-уксусные эфиры генистина и даидзина; и аглюконизофлавоны - генистеин, даидзеин и глицитеин. В исходном сывороточном материале сои изофлавоны преимущественно находятся в виде конъюгатов изофлавона.
Исходный материал растительной белковой сыворотки может быть получен как побочный продукт обычного процесса производства растительного белкового изолята. Источник растительного белка, например, такой как соя, обезжиренная путем экстракции растворителем, может быть подвергнут экстракции водным экстрагентом, имеющим pH выше изоэлектрической точки белка источника, с образованием экстракта, содержащего белок, изофлавоны и другие соединения, извлекаемые из источника растительного белка при экстракции. Экстракт отделяют от растительного материала, не растворимого в экстракте. Затем значение pH получившегося экстракта, содержащего растворимые белки и изофлавоны, доводят до приблизительно изоэлектрической точки белка с целью осаждения белка из экстракта, причем для белка сои это значение pH составляет 4.4-4.6. Осажденный белок отделяют для получения растительного белкового изолята, в результате чего остается исходный растительный белковый сывороточный материал. Основная часть изофлавонов остается в растворимом состоянии в сыворотке. Для увеличения содержания изофлавона в сыворотке могут потребоваться дополнительные промывания осажденного белка, при этом каждая порция промывной жидкости добавляется в сыворотку.
Исходным растительным белковым сывороточным материалом может служить высушенная посредством распылительной сушки растительная белковая сыворотка, растворенная в воде. Для облегчения работы растительную белковую сыворотку сушат посредством распылительной сушки для получения сывороточного белка (белка, оставшегося растворенным в сыворотке, после осаждения белкового изолята), изофлавонов и других соединений в виде твердых материалов. Материал, высушенный на распылительной сушке, добавляют в воду для воссоздания исходного растительного белкового сывороточного материала. В предпочтительном варианте выполнения изобретения раствор содержит около 2-10 г сывороточного высушенного материала на 100 г воды, так чтобы сыворотка не была бы слишком вязкой и содержала бы, тем не менее, достаточно изофлавонов для создания требуемой сыворотки, обогащенной аглюконизофлавоном, сывороточного белкового материала, содержащего аглюконизофлавон, материала с высоким содержанием генистеина, материала с высоким содержанием даидзеина и материала, содержащего аглюконизофлавон.
На первой стадии процесса содержащиеся в исходном материале растительной белковой сыворотки конъюгаты изофлавона превращают в изофлавонглюкозиды для получения обогащенной ими растительной белковой сыворотки. Степень превращения, как было обнаружено, зависит от pH и температуры сыворотки.
Для превращения конъюгатов изофлавона в изофлавонглюкозиды pH должен быть от 6 до 13.5. Если это необходимо, pH растительной белковой сыворотки должен быть доведен до нужного значения. Соевая белковая сыворотка обычно имеет значение pH 4.4-4.6, и для доведения pH до нужного к ней следует добавить основание или основной реагент. Значение pH может быть увеличено с помощью любого подходящего основания, щелочного реагента или основного реагента, повышающего pH системы, включая гидроксиды калия, кальция, натрия. Оказалось, что превращение происходит быстрее в относительно более сильной щелочной среде, преимущественно при pH 9-11. Необходимо поддерживать значение pH ниже 12, так как изофлавонглюкозиды - генистин, глицитин и, в особенности, даидзин - распадаются при значениях pH 12 и выше. Реакция идет медленнее при более низких значения pH, например при pH 6, тем не менее, реакция будет идти при повышенной температуре и/или повышенном давлении.
Значение температуры, при которой происходит превращение конъюгатов изофлавона в изофлавонглюкозиды, находится в интервале от 2°С до 121°С. Значение температуры, при котором превращение происходит быстрее, зависит от pH сыворотки. Как было показано, превращение происходит легче при более низких температурах, если значение pH является достаточно высоким. Например, при значении pH сыворотки около 11, превращение происходит быстро и эффективно при температуре от 5°С до 50°С. При значении pH сыворотки около 9, превращение эффективно происходит при температуре от 45°С до 73°С. Если pH сыворотки достаточно низкое, превращение происходит при повышенных температурах. Например, при значении pH сыворотки 6, превращение происходит при температуре от 80°С до 121°С. В предпочтительном варианте выполнения изобретения превращение происходит при 35°С при pH сыворотки порядка 11. В другом предпочтительном варианте выполнения превращение происходит при 73°С и pH сыворотки порядка 9.
Время, необходимое для практически полного превращения конъюгатов изофлавона в изофлавонглюкозиды, зависит от pH и температуры растительной белковой сыворотки. Необходимое время колеблется от 15 минут до 24 часов. Превращение происходит быстрее при повышенных значения pH и повышенных температурах. При pH порядка 9-10 практически полное превращение достигается примерно за 4-6 часов при 73°С. При pH порядка 10-11 практически полное превращение достигается примерно за 30 минут - 1 час при 35°С. В наиболее предпочтительном варианте выполнения конъюгаты изофлавона превращаются в изофлавонглюкозиды примерно за 45 минут при значении pH порядка 11 и температуре примерно 35°С.
Первая стадия превращения происходит с поразительной эффективностью, 80-100% конъюгатов изофлавона превращается в изофлавонглюкозиды. Как правило, степень превращения составляет, по крайней мере, 95%. Такие высокие степени превращения особенно привлекательны для использования процесса в промышленном масштабе.
На второй стадии процесса изофлавонглюкозиды, полученные на первой стадии, и изофлавонглюкозиды, ранее находившиеся в сыворотке, превращаются с помощью ферментативной реакции в аглюконизофлавоны. Процесс позволяет получить растительную белковую сыворотку, обогащенную аглюконизофлавоном, из сыворотки, обогащенной изофлавонглюкозидом.
Оказалось, что вторая стадия процесса зависит от концентрации ферментов, находящихся в сыворотке, и их характеристик. Для осуществления превращения требуются ферменты, способные расщеплять глюкозидную связь в изофлавонглюкозидах между остовом изофлавона и молекулой глюкозы. В предпочтительном варианте выполнения этими ферментами являются сахаридазы, способные расщеплять 1,4-глюкозидные связи. Концентрация ферментов, необходимая для превращения изофлавонглюкозидов в аглюконизофлавоны, зависит от целого ряда факторов, включая: тип ферментов, присутствующих в сыворотке, распределение концентраций ферментов, активности ферментов, концентрацию изофлавонглюкозидов, pH и температуру сыворотки во время процесса.
Ферменты могут присутствовать в растительной белковой сыворотке с самого начала, появиться в результате микробных процессов в сыворотке или быть внесены в качестве добавки. Ферменты, находящиеся в сыворотке с самого начала или появившиеся в результате микробных процессов, далее будут называться «остаточными» ферментами, добавленные ферменты будут называться «добавочными».
Подходящий фермент должен присутствовать в сыворотке для того, чтобы перевести, по крайней мере, большую часть, а предпочтительнее, практически все изофлавонглюкозиды в аглюконизофлавоны. Как правило, если остаточные ферменты оказываются неспособными провести превращение, добавочные ферменты должны быть добавлены в сыворотку. Как было отмечено выше, целый ряд факторов определяет, присутствуют ли ферменты в нужной концентрации для осуществления превращения.
Если в систему вводится добавочный фермент, он должен вносится в таких количествах, чтобы общая концентрация присутствующих ферментов составляла 0.1-10% по весу по отношению к весу сыворотки в расчете на сухой вес. В предпочтительном варианте выполнения изобретения добавочный фермент вводится в сыворотку независимо от того, присутствует ли в ней подходящий остаточный фермент, так как внесение добавочного фермента значительно снижает время, необходимое для достижения практически полного превращения глюкозидов в аглюконы.
Добавочные ферменты выбираются, исходя из оптимальной активности при выбранных по pH и температуре условиях, а также исходя из цены. В качестве добавочных используют ферменты, способные расщеплять связь в изофлавонглюкозидах между остовом изофлавона и остовом глюкозы, такие как, например, сахаридазы, способные расщеплять 1,4-глюкозидные связи. Предпочтительными добавочными ферментами являются коммерчески доступные ферменты α- и β-глюкозидазы, β-галактозидазы, глюкоамилазы и пектиназы. Особенно предпочтительными являются такие ферменты, как Биопектиназа 100L (которая преимущественно используется при pH порядка 3-6), Биопектинеза 300L (оптимальное значение pH примерно от 3 до 6), Биопектиназа OK 70L (оптимальное значение pH примерно от 3 до 6), Биолактаза 30,000 (оптимальное значение pH примерно от 3 до 6), Нейтральная Лактаза (оптимальное значение pH примерно от 6 до 8), все эти ферменты получены из Квест Интернэйшинэл, 1833 57-я Стрит, Пост Оффис Бокс 3917, Сарасота, Флорида 34243. Также особенно предпочтительными являются Лактаза F (оптимальное значение pH примерно от 4 до 6), Лактаза 50,000 (оптимальное значение pH примерно от 4 до 6), которые были получены из Амано Интернэйшинэл Энзим Ко, Инк., Пост Оффис Бокс 1000, Троя, Вирджиния 22974. Другими особенно предпочтительными ферментами являются: G-Зим G990 (оптимальное значение pH примерно от 4 до 6) и Концентрат Энсеко Фангал Лактазы (оптимальное значение pH примерно от 4 до 6), полученные из Энзим Девелопмент Корпорейшин, 2 Пен Плаза, Сюит 2439. Нью-Йорк, Нью-Йорк 10121; Лактозим 3000L (оптимальное значение pH примерно от 6 до 8), Альфа-Гал 600L (оптимальное значение pH при мерно от 4 до 6.5), полученные из Ново Нордиск Биоиндастриэлз, Инк., 33 Тэнер Роад, Данбэри, Коннектикут 06813; Нейтральная Лактаза (оптимальное значение pH примерно от 6 до 8), полученная из Файзер Фуд Сайенс Груп, 205 Ист 42-я Стрит, Нью-Йорк, Нью-Йорк 10017; и Максиласт L2000 (оптимальное значение pH примерно от 4 до 6), полученный из Джист Брокадз Ингредиенте, Инк., Кинг оф Пруссия, Пенсильвания 19406.
Если ферменты присутствуют в системе в достаточных концентрациях (остаточные, добавочные или оба вида), они контактируют с изофлавонглюкозидами, находящимися в сыворотке, при температуре, pH и в течение периода времени, достаточного для превращения, по крайней мере, большей части (предпочтительнее, полностью всех) изофлавонглюкозидов в аглюконизофлавоны. Если это необходимо, pH сыворотки, обогащенной изофлавонглюкозидами, должно быть доведено до значения pH, при котором ферменты активнее реагируют с изофлавонглюкозидами. Значения pH, при котором комбинированная смесь из остаточных и добавочных ферментов реагирует с изофлавонглюкозидами, составляют примерно от 3 до 9.
Как было показано, остаточные ферменты активны в интервале pH примерно от 7 до 9, хотя, вероятно, что pH сыворотки снижается по ходу реакции. Добавочные ферменты активны при оптимальном значении pH, установленном производителями ферментов, как было показано выше на примере нескольких конкретных ферментов. Обычно добавочные ферменты активны либо в нейтральной среде при pH примерно от 6 до 8, либо в кислой среде при pH примерно от 4 до 6. Также было показано, что кислые ферменты активны при pH около 3.
Значение pH сыворотки может быть изменено, в большинстве случаев понижено от относительно высокого или щелочного значения pH первой стадии, посредством добавления одной или более подходящих кислот, таких как уксусная, серная, фосфорная, соляная кислота, или любого другого подходящего реагента. Предпочтительно, используемый реагент должен быть пищевым кислотным реагентом или кислотой.
Интервал температур, в котором происходит превращение изофлавонглюкозидов в аглюконизофлавоны, составляет примерно от 5°С до 75°С. Температура значительно влияет на активность ферментов, и, тем, самым, на скорость превращения. Добавочные ферменты способны быть активными при температуре выше 72.5°С, например, Альфа-Гал 600L активен при 75°С, однако, реакцию лучше проводить при более низких температурах, чтобы избежать дезактивации ферментов. В предпочтительном варианте выполнения превращение проводят между примерно 35°С и примерно 45°С.
Предпочтительно, ферментативную реакцию проводят при той же температуре, что и первую стадию, таким образом, отсутствует необходимость менять температуру сыворотки после первой стадии. Наиболее предпочтительно, чтобы и первая и вторая стадии проводились при 35°С.
Также желательно, чтобы при превращении изофлавонглюкозидов в аглюконизофлавоны поддерживалась бы постоянная температура. Тем не менее, в некоторых случаях может быть желательным поднять, опустить или другим образом варьировать температуру по ходу реакции.
Время, необходимое для проведения второй стадии, зависит от связанных с ферментами факторов, в особенности, концентрации, температуры и pH сыворотки. В большинстве случаев достижение полной степени превращения возможно за 24 часа, тем не менее, предпочтительно введение добавочных ферментов, что значительно увеличивает скорость реакции. Выбранный добавочный фермент, концентрация ферментов, pH и температура предпочтительно приводят к тому, что практически полное превращение достигается за 2 часа, и наиболее предпочтительно за 1 час.
Степень превращения изофлавонглюкозидов в аглюконизофлавоны на второй стадии является поразительной и составляет, как правило, от, по крайней мере, 80% до 100%. Обычно достигается степень превращения изофлавонглюкозидов в аглюконизофлавоны, по крайней мере, 95%.
После превращения изофлавонглюкозидов в аглюконизофлавоны, сыворотка, обогащенная аглюконизофлавоном, может быть использована по назначению без предварительного процесса высушивания или удаления белка, или, альтернативно, аглюконизофлавоновый сывороточный белковый материал может быть выделен для концентрирования аглюконизофлавонов в белковом материале. Аглюконизофлавоновый сывороточный белковый материал является материалом, содержащим белок, аглюконизофлавоны и остаточные растительные соединения, которые можно осадить и отделить от растительной белковой сыворотки. Белковый материал, обогащенный аглюконизофлавонами, может быть выделен с помощью обычных методов, таких как ультрафильтрация, коагуляция под воздействием тепла и обезвоживание. Полученный в результате аглюконизофлавоновый сывороточный белковый материал может быть обезвожен и высушен обычными методами.
Аглюконизофлавоновый сывороточный белковый материал также может быть получен из сыворотки путем ее охлаждения. Аглюконизофлавоновый сывороточный белковый материал нерастворим в охлажденной сыворотке и может быть отделен от нее в виде осадка с помощью центрифугирования. Предпочтительно для осаждения белкового материала сыворотку охлаждают до 4°С.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения сыворотку концентрируют для увеличения выхода аглюконизофлавонового сывороточного белкового материала. Было обнаружено, что увеличение отношения количества твердой фазы к жидкой, достигаемое концентрированием сыворотки, увеличивает извлечение аглюконизофлавонового сывороточного белкового материала. Сыворотка может быть сконцентрирована путем нагревания, выдерживания при пониженном давлении или обоими методами. Предпочтительно, сыворотку концентрируют таким образом, чтобы отношение количества твердой фазы к жидкой составляло примерно от 1:3 до 1:6, наиболее предпочтительно 1:3.
Материалы с высоким содержанием генистеина и даидзеина могут быть получены из выделенного аглюконизофлавонового сывороточного белкового материала. Материал с высоким содержанием генистеина представляет собой материал, содержащий, по крайней мере, 40% генистеина, наиболее предпочтительно, по крайней мере, 90% генистеина, остаток составляет растительный материал (остаточный соевый материал, если материал с высоким содержанием генистеина получается из соевой сыворотки). Материал с высоким содержанием даидзеина содержит, по крайней мере, 40% даидзеина и остаточный растительный материал.
Для получения материалов с высоким содержанием генистеина и даидзеина, аглюконизофлавоновый сывороточный белковый материал сначала промывают для удаления нежелательных солей и сахаров, затем высушивают. Для осуществления промывки аглюконизофлавоновый сывороточный белковый материал разбавляют водой до содержания сухих веществ примерно от 1% до 6%, наиболее предпочтительно, до 2%. Промывная вода может иметь любую температуру, однако, предпочтительно, чтобы температура была от 25°С до 75°С, лучше всего около 60°С. После промывки аглюконизофлавоновый сывороточный белковый материал отделяют от промывных вод и высушивают. В предпочтительном варианте выполнения, материал выделяется методом центрифугирования и декантации супернатанта.
Для извлечения аглюконизофлавонов из сывороточного белка и получения экстракта, обогащенного аглюконизофлавоном, аглюконизофлавоновый сывороточный белковый материал может быть затем подвергнут экстракции водно-спиртовым экстрагентом. В качестве спиртового компонента экстрагента предпочтительнее использовать низкомолекулярные спирты, такие как метанол, и, в особенности, этанол. Оказалось, что аглюконизофлавоны растворимы при практически любых концентрациях спирта в экстрагенте. Аглюконизофлавоны особенно хорошо растворимы, если экстрагент содержит примерно от 30 до 90% спирта, наиболее предпочтительно от примерно 60 до примерно 80% спирта. Хотя водный раствор спирта является предпочтительным растворителем, для экстракции аглюконизофлавонов из сывороточного белкового материала могут быть использованы и другие растворители, включая воду, ацетонитрил, метиленхлорид, ацетон, этилацетат и их смеси.
Экстракция проводится с использованием минимального количества экстрагента. Предпочтительнее, чтобы отношение по весу экстрагента к аглюконизофлавоновому сывороточному белковому материалу не превышало 11:1. В одном варианте выполнения изобретения, материал может быть выделен методом противоточной экстракции, в которой отношение по весу экстрагента к материалу составляет примерно от 6:1 до 8:1. В другом варианте выполнения, материал может быть экстрагирован двумя порциями экстрагента, причем общее отношение экстрагента к материалу не превышает 11:1 по весу.
Хотя экстракцию возможно проводить при любых значениях pH, предпочтительнее, чтобы экстрагент имел pH близкое к изоэлектрической точке белка в аглюконизофлавоновом сывороточном белковом материале, с тем, чтобы минимизировать растворимость белка в экстрагенте. Предпочтительно, чтобы экстрагент имел pH примерно от 3 до 6, для соевого сывороточного белка лучше всего порядка 4.5.
Экстракцию можно проводить при любой температуре вплоть до точки кипения экстрагента, лучше всего между примерно 25°С и 70°С. Для уменьшения времени, требуемого для экстракции аглюконизофлавонов из аглюконизофлавонового сывороточного белкового материала, экстракцию лучше проводить при температуре выше комнатной, наиболее предпочтительно примерно при 60°С.
После экстракции, материалы с высокими содержаниями генистеина и даидзеина могут быть отделены от экстракта, обогащенного аглюконизофлавоном, посредством контакта экстракта с адсорбентом в течение времени, достаточного для отделения материалов с высокими содержаниями генистеина и даидзеина от экстракта. В предпочитаемом варианте выполнения изобретения материалы с высокими содержаниями генистеина и даидзеина отделяются от экстракта с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной фазой (HPLC, ВЖХ). Генистеин и даидзеин отделяются от других изофлавонов и загрязнений, находящихся в экстракте, путем элюирования экстракта через частицы материала адсорбента, который обратимо связывает генистеин, даидзеин, другие изофлавоны и загрязнения в специфические соединения, позволяя, таким образом, отделить каждый из компонентов.
Сначала экстракт, обогащенный аглюконизофлавоном, фильтруют для удаления нерастворимых частиц, которые могут забить хроматографическую колонку. Колонка для ВЖХ готовится следующим образом: стандартная колонка для ВЖХ заполняется частицами материала адсорбента, который может обратимо связывать генистеин, даидзеин, другие изофлавоны и загрязнения в специфические соединения. Адсорбентом может служит любой материал для ВЖХ, однако предпочтительный материал выбирают, учитывая критерии емкости, эффективности разделения и цену. Одним из предпочтительных материалов является Кромасил С 18 16 мкм, 100 Å, производства Ека Нобел, Нобел Индастрис, Швеция.
Профильтрованный экстракт пропускают через наполненную колонку ВЖХ, пока связывающий материал колонки не будет полностью насыщен изофлавонами, что проявляется в появлении изофлавонов в элюате, выходящем из колонки. Затем колонку промывают полярным элюентом для осуществления разделения. В предпочитаемом варианте выполнения, элюентом является водный раствор спирта. Водно-спиртовой элюент может содержать примерно от 30 до 90% спирта, лучше всего использовать элюент с содержанием спирта порядка 50% для обеспечения как хорошего разделения, так и хорошей растворимости изофлавонов. В качестве спирта преимущественно применяются метанол и этанол, этанол лучше применять в том случае, если материалы с высокими содержаниями генистеина и даидзеина будут применяться для приготовления пищевых продуктов или лекарств.
Материалы с высоким содержанием генистеина и даидзеина собирают в составе элюата, выходящего из колонки. Первым из колонки выходит даидзеин, затем фракция глицитеина, после нее выходит более полярная фракция генистеина. По мере выхода из колонки, фракции даидзеина и генистеина собирают, фракция глицитеина также, если необходимо, может быть собрана.
Спирт из фракций может быть удален выпариванием, после чего материалы с высоким содержанием генистеина и даидзеина, а также глицитеина, можно выделить обычными методами, такими как центрифугирование или фильтрация. Полученный материал с высоким содержанием генистеина содержит, по крайней мере, 40% генистеина, предпочтительнее, по крайней мере, 90% генистеина, и оставшиеся растительные материалы (остаточные соевые материалы, если генистеин получают из соевой сыворотки). Полученный материал с высоким содержанием даидзеина содержит, по крайней мере, 40% генистеина и оставшиеся растительные материалы, которые обычно включают в себя значительное количество глицитеина.
В другом варианте исполнения изобретения аглюконизофлавоновый материал получают из экстракта, обогащенного аглюконизофлавоном. Аглюконизофлавоновый материал представляет собой материал, содержащий, по крайней мере, 10% генистеина и, по крайней мере, 5% даидзеина, а также другие изофлавоны и оставшиеся растительные соединения.
После экстракции аглюконизофлавонового сывороточного белкового материала, экстракт, обогащенный аглюконизофлавоном, может быть сконцентрирован для облегчения осаждения аглюконизофлавонов из экстракта. Экстракт может быть сконцентрирован путем нагревания, выдерживания при пониженном давлении или обоими методами. В предпочтительном варианте исполнения экстракт концентрируют примерно до 15-30% от первоначального объема.
Аглюконизофлавоновый материал осаждается из экстракта при добавлении воды к экстракту. В предпочтительном варианте выполнения, к одной части концентрированного экстракта добавляют примерно от 6 до 8 частей воды. При добавлении воды к экстракту осаждается некоторое количество аглюконизофлавонового материала.
Для получения максимального выхода аглюконизофлавонового материала из экстракта, экстракт и воду тщательно перемешивают и затем охлаждают. Экстракт и вода смешивают в течение некоторого времени, предпочтительно примерно от 0,5 до 1 часа. В предпочтительном варианте выполнения, экстракт и воду смешивают при температуре примерно от 50°С до 75°С, наиболее предпочтительно примерно при 70°С. После того как вода и экстракт тщательно перемешаны, смесь охлаждают для осаждения аглюконизофлавонового материала. Предпочтительно, смесь охлаждают до примерно 5°С-20°С, наиболее предпочтительно примерно до 10°С, в течение времени, достаточного для практически полного осаждения аглюконизофлавонового материала. Осажденный аглюконизофлавоновый материал затем можно отделить от смеси экстракт - вода обычными методами, такими как центрифугирование и фильтрация.
Выделенный аглюконизофлавоновый материал затем можно промыть водой. В предпочтительном варианте выполнения аглюконизофлавоновый материал промывают водой при температуре порядка 70°С в течение примерно 5 минут, причем отношение по весу промывных вод и материала составляет примерно от 0.8:1 до 2:1. Аглюконизофлавоновый материал отделяют от промывных вод обычными способами, такими как фильтрации или центрифугирования, и высушивают. Получаемый аглюконизофлавоновый материал обычно содержит, по крайней мере, 20% генистеина и, по крайней мере, 10% даидзеина, остаток составляет материал, образовавшийся из остаточных растительных материалов, включая другие аглюконизофлавоны. Если аглюконизофлавоновый материал выделяется из соевой сыворотки, остающиеся растительные материалы являются материалами сои.
Полученный аглюконизофлавоновый материал может быть подвергнут дальнейшей очистке для получения материала с высоким содержанием генистеина, содержащего по крайней мере 40%, а предпочтительнее, по крайней мере, 90%, генистеина, и материала с высоким содержанием даидзеина, содержащий, по крайней мере, 40% даидзеина. Аглюконизофлавоновый материал может быть растворен в водно-спиртовом растворителе. В качестве спиртовой составляющей растворителя предпочтительно использовать низкомолекулярные спирты, особенно, этанол, его низкая токсичность дает возможность применять материал в пищевой и медицинской промышленности. Содержание спирта в растворителе преимущественно составляет примерно от 30 до 90%, причем наиболее предпочтительным является 80%, так как такое содержание обеспечивает хорошее растворение аглюконизофлавонового материала.
Водный спиртовой раствор, содержащий растворенный аглюконизофлавоновый материал, может быть подвергнут контакту с материалом адсорбента в течение промежутка времени, достаточного для выделения материалов с высокими содержаниями генистеина и даидзеина из водно-спиртового раствора. В предпочтительном варианте выполнения, материалы с высокими содержаниями генистеина и даидзеина выделяют из водно-спиртового раствора с помощью ВЖХ с обращенной фазой. Колонку для ВЖХ готовят, как описано выше, водно-спиртовой раствор, содержащий аглюконизофлавоноый материал, наносят на колонку, и материалы с высокими содержаниями генистеина и даидзеина элюируют из колонки, как это описано выше. Полученный материал с высоким содержанием генистеина содержит, по крайней мере, 40% генистеина, предпочтительнее, по крайней мере, 90% генистеина, и оставшиеся растительные материалы (остаточные соевые материалы, если генистеин получается из соевой сыворотки). Полученный материал с высоким содержанием даидзеина содержит, по крайней мере, 40% генистеина и оставшиеся растительные материалы.
Экспериментальная часть
Настоящее изобретение более подробно иллюстрируется с помощью приведенных далее примеров, в качестве растительной белковой сыворотки используется соевая сыворотка. Примеры носят иллюстративный характер, и не ограничивают каким-либо образом рамки изобретения.
Как показано выше, соевая сыворотка содержит «группы» изофлавонов: генистеина, диадзеина и глицитеина, имеющих соответствующие глюкозиды, конъюгаты и агликоны, при этом группа генистеина включает в себя конъюгаты 6''-OMal-генистин и 6''-ОАс-генистин, глюкозидгенистин и аглюконгенистеин. Группа даидзеина включает в себя конъюгаты 6''-OMal-даидзин и 6''-ОАс-даидзин, глюкозиддаидзин и аглюкондаидзеин. Группа глицитеина включает в себя конъюгат 6''-OMal-глицитин, глюкозидглицитин и аглюконглицитеин. В приведенных ниже таблицах относительные концентрации изофлавонов измеряются в процентном содержании в группе изофлавонов. Например, для группы генистеина: % генистина + % 6''-OMal-генистина + % 6''-ОАс-генистина + % генистеина = 100%. Увеличение степени превращения конъюгатов в глюкозиды и глюкозидов в аглюконы можно определить, сравнивая процентные содержания каждого вида соединений в группе изофлавонов.
Пример 1.
В первом эксперименте определяли степень превращения конъюгатов изофлавона в изофлавонглюкозиды. Увеличение степени превращения определяется по количественному уменьшению процентного содержания малонового и уксусного эфиров в группе изофлавонов при соответствующем количественном увеличении процентного содержания глюкозидов этой же группы.
Влияние pH среды на первой стадии превращения конъюгатов изофлавона в изофлавонглюкозиды было измерено при двух различных температурах. Соевая сыворотка была высушена на распылительной сушке, затем растворена в воде для получения соевой сывороточной суспензии, содержащей 2% сухих веществ по весу. Сыворотка была разделена на две группы по четыре образца. Значение pH каждого из образцов было доведено до 6.0, 7.0, 9.0, и 11.0, соответственно. Группы образцов выдерживали в термостате 24 часа, одну при 45°С, другую - при 72.5°С. Анализ каждого образца для определения содержания изофлавона проводили периодически в 0, 2, 4, 6, 8 и 24 часа. В Таблице 1 показаны изменения состава и распределения изофлавонов по ходу реакции.
Первая стадия конверсии происходит наиболее быстро и полно при более высоком, щелочном значении pH и повышенных температурах, о чем свидетельствует относительное уменьшение концентраций 6''-OMal и 6''-ОАс -конъюгатов изофлавона и соответствующее увеличение концентраций глюкозидов генистина, даидзина и глицитина. Практически полное превращение конъюгатов изофлавона в изофлавонглюкозиды происходит при pH 9 и 11 при температуре как 45°С, так и 72.5°С. Превращение в образцах также происходит практически полностью при pH 6 и 7 при 72.5°С.
Пример 2.
Во втором эксперименте определяли степень превращения изофлавонглюкозидов в аглюконизофлавоны. Для изучения второй стадии использовали обогащенную изофлавонглюкозидами сыворотку, полученную на первой стадии. Степень превращения определяли по количественному уменьшению процентной концентрации глюкозидов группы изофлавонов, сопровождающуюся соответствующим увеличением процентной концентрации аглюконов той же самой группы изофлавонов.
Соевую сыворотку превращали в сыворотку, обогащенную изофлавонглюкозидами, путем доведения pH сыворотки до 11.0 и выдерживания в течение 30 минут при 35°С. Один из образцов сыворотки, обогащенной глюкозидами, выдерживали 24 часа при 45°С для определения степени превращения изофлавонглюкозидов в аглюконизофлавоны в помощью остаточных ферментов сыворотки. В другие образцы сыворотки, обогащенной глюкозидами, были введены следующие коммерческие добавочные ферменты: Биопектиназа 100L, Биопектиназа 300L, Биопектиназа OK70L, Лактаза F, Альфа-Гал 600L, G-Зим G990, Квест Биолактаза 30,000, Ново Лактозим 3000L, Максиласт L2000, Энсеко Фангал Лактаза, Квест Нейтральная Лактаза и Пфайзер Нейтральная Лактаза. pH образцов, в которые введены Альфа-Гал 600L, G-Зим G990, Биопектиназа 100L, Биопектиназа 300L, Биопектиназа OK70L, Лактаза F и Энсеко Фангал Лактаза, перед внесением фермента доводили до 4.5. pH образцов, в которые введены Ново Ново Лактозим 3000L, Максиласт L2000, Пфайзер Нейтральная Лактаза, Квест Биолактаза 30,000 и Квест Нейтральная Лактаза перед внесением фермента доводили до 4.5 и 7.0. Затем образцы с добавочными ферментами инкубировали при 50°С (кроме образца с Лактазой F, который выдерживали при 35°С, и образцов с Биопектиназой 300L и Биопектиназой OK70L, которые выдерживали при 40°С). Промежуточные образцы брали по истечении определенного времени и определяли содержание изофлавона. В Таблице 2 приведены распределения изофлавонов по ходу реакции.
Концентрации на 100 г сыворотки, обогащенной глюкозидом: Биопектиназа 300L, Биопектиназа OK70L, Лактаза F, Альфа-Гал 600L, Энсеко Фангал Лактаза, G-Зим G990 - 0.1 г, Биопектиназа 100L - 0.04 г, Биопектиназа 100L - 0.04 г, Ново Лактозим 3000L, Максиласт L2000, Пфайзер Нейтральная Лактаза, Квест Биолактаза 30.000, Квест Нейтральная Лактаза - 0.2 г.
Как видно из данных по превращению генистина, даидзина и глицитина в генистеин, даидзеин и глицитеин соответственно, достигается практически полное превращение изофлавонглюкозидов в аглюконизофлавоны. Добавочные ферменты значительно увеличивают скорость реакции, обеспечивая, в случае определенных добавочных ферментов, практически полное превращение за 1 час. При pH 4.5 наиболее эффективными оказались: Биопектиназа 100L, Биопектиназа 300L, Лактаза F, Альфа-Гал 600L, G-Зим G990, Квест Биолактаза 30.000 и Энсеко Фангал Лактаза. При pH 7.0 наиболее эффективными оказались Квест Биолактаза 30.000 и Квест Нейтральная Лактаза.
Пример 3.
В другом эксперименте аглюконизофлавоновый сывороточный белковый материал получают из соевой сыворотки, обогащенной аглюконизофлавоном. Первый образец соевой сыворотки, обогащенной аглюконизофлавоном, весом 1000 г, содержащий 30 мг генистеина, 37 мг даидзеина и 7 мг глицитеина, был сконцентрирован упариванием при слабом нагревании до 163 г (отношение концентраций 1:6.1). Концентрированную сыворотку нагревали для коагуляции белкового материала и центрифугировали для дальнейшего концентрирования сывороточного белкового материала. 21 г сывороточного белкового материала, содержащего 25 мг генистеина, 32 мг даидзеина и 6 мг глицитеина, отделили от сыворотки. Полученный сывороточный белковый материал (смешанная сыворотка и сывороточный белковый материал) содержал 82% генистеина, 88% даидзеина и 77% глицитеина.
Второй образец соевой сыворотки, обогащенной аглюконизофлавоном, весом 400 г, содержащий 12 мг генистеина, 15 мг даидзеина, 3 мг глицитеина, подвергали нагреванию для коагуляции белкового материала без концентрирования сыворотки. Скоагулированный сывороточный белковый материал и сыворотку центрифугировали для дальнейшего концентрирования сывороточного белкового материала. Было получено 8.7 г сывороточного белкового материала, содержащего 5 мг генистеина, 7 мг даидзеина и 1 мг глицитеина. Полученный сывороточный белковый материал (смешанная сыворотка и сывороточный белковый материал) содержал 44% генистеина, 47% даидзеина и 34% глицитеина.
Сравнение сывороточного белкового материала первого и второго образцов показывает, что концентрирование сыворотки, обогащенной аглюконизофлавоном, перед разделением сывороточного белкового материала приводит к увеличению содержания аглюконизофлавонов в сывороточном белковом материале.
Пример 4.
В другом эксперименте аглюконизофлавоновый материал получают путем экстракции аглюконизофлавонового сывороточного белкового материала водно-спиртовым экстрагентом и осаждения из экстракта аглюконизофлавонового материала.
Посредством превращения содержащихся в сыворотке конъюгатов изофлавона и изофлавонглюкозидов в аглюконизофлавоны и получения аглюконизофлавонового сывороточного белкового материала из сыворотки было получено: 821 г аглюконизофлавонового сывороточного белкового материала, содержащего 86% белка в расчете на сухой вес, 4.7 г генистеина, 2.2 г даидзеина и 0.36 г глицитеина. Аглюконизофлавоновый сывороточный белковый материал экстрагировали раствором этиловый спирт/вода с соотношением 80/20 процентов по весу (соотношение раствор/аглюконизофлавоновый сывороточный белковый материал составляло 7.7/1) в течение 45 минут при 60°С. После экстракции получившийся раствор охлаждали до 25°С и фильтровали через фильтр No 4 из бумаги Ватман под вакуумом. Выделили 1584 г мокрого осадка, содержащего 798 г сухих веществ, 0.8 г генистеина, 0.4 г даидзеина и 0.02 г глицитеина, и 3397 г чистого экстракта, содержащего 23 г сухих веществ, 3.9 г генистеина, 1.8 г даидзеина и 0.34 г глицитеина.
Осадок повторно экстрагировали раствором этиловый спирт/вода с соотношением 80/20 процентов по весу (отношение раствор/исходный аглюконизофлавоновый сывороточный белковый материал 2.3/1) в течение 5 минут при 25°С. После повторной экстракции полученную суспензию снова фильтровали через фильтр No 4 из бумаги Ватман. Выделили 1542 г мокрого осадка, содержащего 794 г сухих веществ, 0.3 г генистеина, 0.1 г даидзеина и 0.01 г глицитеина, и 2042 г второго экстракта, содержащего 4.0 г сухих веществ, 0.5 г генистеина, 0.3 г даидзеина и 0.01 г глицитеина. Экстракты объединили, вместе они содержали 94% генистеина и 95% даидзеина, изначально содержащихся в аглюконизофлавоновом сывороточном белковом материале.
Затем экстракты концентрировали путем упаривания на выпаривателе Буши под вакуумом при 70°С до 1528 г (20% от объема совмещенного экстракта). К концентрированному экстракту добавили 6000 г деионизованной воды (соотношение вода/экстракт 4/1). При добавлении воды образуется белый осадок изофлавонов. Суспензию осадка нагревали в течение 45 минут при 70°С. Затем раствор выдерживали в холодильнике при 4°С в течение 24 часов для формирования и оседания осадка изофлавонов. 7300 г супернатанта декантировали с осадка, оставшийся раствор центрифугировали для отделения осадка. Полученный осадок снова промывали 600 г деионизованной воды при 70°С в течение 15 минут. Осадок отделяли центрифугированием и сушили под вакуумом при 50°С.
В результате получили сухой аглюконизофлавоновый материал весом 7.3 г, содержащий 49% генистеина, 19% даидзеина и 4% глицитеина.
Пример 5.
В другом эксперименте материал с высоким содержанием генистеина и материал с высоким содержанием даидзеина выделяют из аглюконизофлавонового материала с помощью ВЖХ с обращенной фазой. 2 г аглюконизофлавонового материала, содержащие 55% генистеина, 21% даидзеина и 4% глицитеина в расчете на сухой вес, добавляют к 1 литру раствора метанол/вода с соотношением 50/50 процентов по весу. Раствор фильтруют через фильтр No 5 из бумаги Ватмана, затем через фильтр 0.45 мкм.
Затем раствор помещают в колонку ВЖХ длиной 25 см и диаметром 2'', наполненную материалом Кромасил (Кромасил С18, 16 мкм, размер гранул 100Å). Подвижную фазу, состоящую из раствора метанол/вода с соотношением 50/50 процентов по весу, пропускают через колонку со скоростью 64 мл/мин. Появление даидзеина, глицитеина и генистеина в элюате определяют УФ-поглощением. Даидзеин собирают в первой фракции, генистеин - во второй. Фракции, содержащие даидзеин и генистеин, выпаривают для удаления спирта, что вызывает осаждение материалов с высоким содержанием генистеина и даидзеина в каждой из фракций. Осажденные материалы с высоким содержанием генистеина и даидзеина отделяют центрифугированием и сушат в вакуумном термостате. Полученный материал с высоким содержанием генистеина содержит около 95% генистеина, а полученный материал с высоким содержанием даидзеина содержит около 45% даидзеина.
В описанных экспериментах все значения процентов, приведенные для 6''-OMal-генистина, 6''-ОАс-генистина, 6''-OMal-даидзина, 6''-ОАсдаидзина, 6''-OMal-глицитина и глицитеина, представляют собой вычисленные значения. Проценты, показывающие концентрацию ферментов, вычисляют исходя из количества коммерческого фермента, приходящегося на 100 г сухих веществ сыворотки или 100 г сыворотки в каждом образце.
Далее приведено описание способа количественного определения изофлавонов в продуктах сои. Изофлавоны экстрагируют из продуктов сои путем смешения 0.75 г образца (высушенного на распылительной сушке или в виде мелко измельченного порошка) с 50 мл растворителя метанол/вода, соотношение 80/20. Смесь встряхивают в течение 2 часов при комнатной температуре на орбитальном встряхивающем устройстве (orbital shaker). Через два часа нерастворившиеся вещества удаляют фильтрацией через фильтр No 42 из бумаги Ватман. 5 мл фильтрата разбавляют 4 мл воды и 1 мл метанола.
Экстрагированные изофлавоны разделяют с помощью ВЖХ с использованием Хьюперсил С18 колонки с обращенной фазой фирмы Хьюлетт Паккард. Изофлавоны наносят на колонку и вымывают градиентом растворителя, начиная с 88% метанола, 10% воды и 2% ледяной уксусной кислоты. При скорости потока 0.4 мл/мин все изофлавоны - генистин, 6''-OMal-генистин, 6''-ОАс-генистин, генистеин, даидзин, 6''-OMal-даидзин, 6''-ОАс-даидзин, даидзеин, глицитин, 6''-OMal-глицитин, глицитеин - четко разделяются. Пики детектируют по УФ-поглощения при 260 нм. Идентификацию пиков производят с помощью ВЖХ масс-спектрометра.
Количественное определение производят по чистым стандартам (генистин, генистеин, даидзин и даидзеин) производства Индофайн Кемикал Кампани, Соммервиль, Нью Джерси. Характеристические параметры разрешения (площадь пика/концентрация) рассчитывают для каждого из вышеупомянутых веществ и используют для количественного определения в неизвестных образцах. Для конъюгатных форм, для которых не доступны чистые стандарты, характристические параметры принимаются такими же, как и для исходной молекулы, но вводится поправка на различие в молекулярных массах.
Данный метод позволяет количественно определять каждый отдельный изофлавон. Для удобства может быть рассчитано общее содержание генистеина, общее содержание даидзеина и общее содержание глицитеина, и представлен общий вес этих соединений, как если бы все конъюгированные формы были переведены в неконъюгированные. Общее содержание также может быть определено прямым методом с помощью кислотного гидролиза, переводящего соединения в неконъюгированную форму.
Все вышесказанное является только предпочтительными вариантами выполнения изобретения. Возможны различные изменения и дополнения в рамках изобретения, как это описано в пунктах формулы изобретения, которые следует рассматривать, учитывая Патентный закон и доктрину эквивалентов.
Изобретение относится к обогащенной аглюконизофлавоном растительной белковой сыворотке, сывороточному белковому материалу, материалу с высоким содержанием генистеина, материалу с высоким содержанием даидзеина, материалу на основе аглюконизофлавона и способам их получения из растительной белковой сыворотки. Конъюгаты изофлавона, содержащиеся в растительной белковой сыворотке, превращают в изофлавонглюкозиды посредством обработки сыворотки при температуре и рН и в течение времени, достаточного для превращения. Изофлавонглюкозиды превращают в аглюконизофлавоны с помощью ферментативной реакции, получая обогащенную аглюконизофлавоном растительную белковую сыворотку. Содержащий аглюконизофлавоны сывороточный белковый материал получают из обогащенной аглюконизофлавоном растительной белковой сыворотки. Материал с высоким содержанием генистеина, материал с высоким содержанием даидзеина, материал на основе аглюконизофлавона выделяют из спиртового экстракта, содержащего аглюконизофлавоны сывороточного белкового материала. 4 н. и 47 з.п. ф-лы, 2 табл.
| US 4889921 А, 26.12.1989 | |||
| US 4064277 А, 20.12.1977 | |||
| Способ получения растворимого белка из шрота семян подсолнечника | 1985 |
|
SU1285648A1 |
