СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА К СУХОЙ ГНИЛИ КОРЗИНКИ Российский патент 2009 года по МПК A01H1/00 

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в селекции подсолнечника, в частности в выведении форм подсолнечника, устойчивых к сухой гнили корзинок.

Известно около 40 видов грибов рода Rhizopus Ehrenb. Они поражают многие сельскохозяйственные культуры - початки кукурузы, клубни картофеля, плоды томатов, ягоды земляники, малины, клубники, волокно хлопчатника, вызывают гниль кожицы плодов, кагатную гниль сахарной свеклы (Ячевский А.А., 1929; Пересыпкин В.Ф., 1974; Билай В.И. и др., 1988). У сои вызывают потерю жизнеспособности семян и разрушение белка (Лобик А.И., 1930; Катаева О.Е., 1931; Заянчковская М.С., 1938; Жуковская С.А., 1980). На клещевине грибы рода Rhizopus Ehrenb. вызывают черную гниль соцветий (Пересыпкин В.Ф., 1974, 1986).

Большой вред этот патоген наносит и подсолнечнику. В Краснодарском крае подсолнечник поражают три вида грибов из рода Rhizopus Ehrenb.: Rh. oryzae Went et Pringle, Rh. stolonifer Ehrenb., Fr. Vuill, Rh. microsporus V. Tiegh, вызывая сухую гниль корзинок. Поражение подсолнечника грибами рода Rhizopus Ehrenb. приводит к снижению качества и количества семенного материала. Существуют разные способы защиты подсолнечника от сухой гнили: агротехнические, химические. Наиболее эффективным способом защиты подсолнечника от сухой гнили является селекция подсолнечника на устойчивость к этому патогену. Способов определения устойчивости подсолнечника к сухой гнили нет.

Настоящим изобретением решается задача расширения арсенала методов и средств для осуществления селекции подсолнечника на устойчивость к гнилям, в частности к сухой гнили корзинки за счет простого, удобного и достоверного выявления устойчивых к сухой гнили форм подсолнечника при заражении ею корзинок подсолнечника.

Цель изобретения - обеспечить оптимальные условия и надежность заражения корзинок подсолнечника сухой гнилью и приблизить эти условия и оценку иммунитета растений к естественным, обеспечить одновременное проведение визуальной оценки устойчивости растений, дифференциацию устойчивости и уборку подсолнечника, использовать простой метод заражения в фазу развития растений, наиболее восприимчивую к этом патогену.

Технический результат достигается тем, что выращивают 7-дневную культуру гриба Rhizopus Ehrenb. в чашках Петри, из нее приготовляют водную суспензию инокулюма с концентрацией 4500-5000 спор/мл, инокулируют корзинку в фазу «конец цветения» путем опрыскивания ее поверхности водной суспензией инокулюма в количестве 4-5 мл на одну корзинку, надевают на обработанные корзинки изоляторы, через трое суток изоляторы снимают, в фазу созревания корзинки осуществляют визуальную оценку иммунологической реакции растения по распространению поражения на тыльной поверхности корзинки, а также проводят дифференциацию устойчивости по площади поражения этой поверхности, относя к устойчивым те, у которых площадь поражения 0-25%, к среднеустойчивым - 26-50%, к восприимчивым - 51-75%, к сильно восприимчивым - 76-100% от всей площади тыльной поверхности корзинки, при этом, в частности, опрыскивают водной суспензией инокулюма лицевую сторону корзинки, опрыскивание осуществляют с помощью пульверизатора, изоляторы надевают на обработанные инокулюмом корзинки пергаментные, а после снятия их с зараженных корзинок из опыта сразу же удаляют растения с полностью сгнившими корзинками.

Предлагаемое техническое решение является новым, поскольку из общедоступных сведений не известен способ определения устойчивости растений подсолнечника к сухой гнили корзинки, т.е. оно соответствует критерию патентоспособности «НОВИЗНА».

Предлагаемое техническое решение имеет ИЗОБРЕТАТЕЛЬСКИЙ УРОВЕНЬ, поскольку из опубликованных научных данных и известных технических решений для специалиста в области селекции подсолнечника явным образом не следует заявленная совокупность признаков. Отдельные признаки заявляемого изобретения или их части, например «выращивание культуры гриба», «приготовление инокулюма», «визуальная оценка иммунологической реакции растения по распространению поражения на тыльной поверхности корзинки», «дифференциация устойчивости по степени поражения этой поверхности» сами по себе известны, но они (эти операции, приемы) используются в известных технических решениях в сочетании в другими (нежели в заявляемом изобретении) признаками и для определения устойчивости растений подсолнечника к другим (нежели в заявляемом изобретении) патогенам. Нашими опытами и исследованиями были выявлены: возраст чистой культуры гриба сухой гнили, в котором он обладает максимальной патогенной силой, необходимой для эффективного заражения корзинок подсолнечника; фазу растений подсолнечника для эффективного проведения визуальной оценки иммунологической реакции растений на заражение грибом сухой гнили, а также дифференцированные показатели устойчивости растений к указанной гнили.

Предлагаемое техническое решение ПРОМЫШЛЕННО ПРИМЕНИМО, т.к. для его реализации могут быть использованы стандартное лабораторное оборудование, приспособления, в том числе чашки Петри и другое, а также патогенный материал (пораженные сухой гнилью корзинки подсолнечника) и оно может быть применимо в сельском хозяйстве, в частности в области селекции.

Способ осуществляют следующим образом, начинают с того, что за семь дней до конца цветения подсолнечника (фаза «конец цветения» наступает на 53-59-й день от начала всходов для сортов различных групп спелости) начинают выращивание гриба сухой гнили в чашках Петри по общеизвестной методике для приготовления инокулюма. Из выращенной 7-дневной культуры патогена готовят водную суспензию инокулюма с концентрацией 4500-5000 спор/мл. Инокулируют корзинку подсолнечника (в фазу «конец цветения») путем опрыскивания ее поверхности приготовленной водной суспензией в количестве 4-5 мл на одну корзинку, после чего на обработанные корзинки надевают изоляторы. Через трое суток изоляторы снимают. В фазу созревания корзинок осуществляют визуальную оценку иммунологической реакции растения по распространению поражения на тыльной поверхности корзинки, дифференцируя устойчивость по площади поражения этой поверхности: относят к устойчивым те, у которых площадь поражения 0-25%, к среднеустойчивым - 26-50%, к восприимчивым - 51-75%, к сильно восприимчивым - 76-100% от всей площади тыльной поверхности корзинки. При этом, в частности, опрыскивают водной суспензией инокулюма лицевую сторону корзинки с помощью пульверизатора, изоляторы надевают на обработанные корзинки пергаментные, а после снятия их с зараженных корзинок из опыта сразу же удаляют растения с полностью сгнившими корзинками.

ПРИМЕР осуществления способа.

Опыт проводили в условиях Краснодарского края.

В Краснодарском крае подсолнечник поражают три вида грибов из рода Rhizopus Ehrenb. Видовой состав и их морфологические признаки представлены в Таблице 1, из показателей которой видно, что наиболее встречаемым на подсолнечнике является вид Rhizopus oryzae Went et Pringle. Опыт проводили так. Осенью года, предшествующего году проведения опыта, на посевах подсолнечника отбирали пораженные сухой гнилью корзинки, которые затем высушивали и хранили в эксикаторе. Весной семена испытуемых сортов подсолнечника высевали в поле в оптимальные для развития растений сроки. Так как известно, что фаза «конец цветения» наступает на 53-59-й день от начала всходов (в зависимости от скороспелости сорта), то фиксировали срок всходов и за 7 дней до фазы «конец цветения» корзинок подсолнечника начинали выращивание чистой культуры гриба Rh. oryzae Went et Pringle по общепринятой методике.

Таблица 1. Морфологические признаки грибов рода Rhizopus Ehrenb. и их видовой состав Краснодар, ВНИИМК, 2006-2007 гг Вид Частота встречаемости, % Температурный режим, °С Кол-во спорангиеносцев в одном пучке, шт. Высота спорангиеносцев, мм Средний диаметр спорангия, мк Средний диаметр спор, мк Rhizopus oryzae Went et Pringle. 71,2 37 3-7 3 156,2 6,8 Rh. stolonifer Ehrenb., Fr. Vuill, 28,0 25 2-3 4 225,7 9,7 Rh. microsporus V. Tiegh 0,3 45 1 0,6 83,7 4,1

Для этого брали ткани заготовленных с осени и хранимых в эксикаторе пораженных ризопусом (сухой гнилью) корзинок с включенными в них пораженными семенами, закладывали во влажную камеру и держали там до появления мицелия, который пересевали затем на питательную среду (картофельно-глюкозный агар) в чашки Петри. Затем готовили инокулюм из 7-дневных чистых культур этого гриба в виде водной суспензии по общепринятой методике: путем смыва дистиллированной водой спорангиеносцев гриба. Подсчет спор осуществляли в камере Горяева так же по общепринятой методике. Для этого к утолщенному предметному стеклу камеры с нанесенной на него сеткой осторожно притирали специальное покровное стекло так, чтобы по его краям появились цветные полосы интерференции, свидетельствующие о плотном прилегании покровного стекла к камере. Затем каплю приготовленной суспензии пипеткой вносили в желобок камеры, следя чтобы покровное стекло при этом не всплыло. После чего под микроскопом подсчитывали количество спор в пяти больших квадратах и определяли среднее. Плотность спор в исходной суспензии вычисляли по формуле N=a·250000, где а - среднее количество спор в одном большом квадрате. Концентрацию приготовленной суспензии доводили стерильной водой до 5×10³ спор/мл (достаточное количество инфекционного материала для заражения). Инокуляцию корзинки проводили в фазу «конец цветения», т.к. эта фаза развития растения подсолнечника является наиболее восприимчивой к заражению корзинки ризопусом (См. табл.2). Инокулировали корзинки подсолнечника в утренние часы путем опрыскивания лицевой поверхности корзинки водной суспензией инокулюма. Опрыскивание патогенной суспензией осуществляли при помощи пульверизатора в количестве 4,5 мл инокулюма на лицевую сторону корзинки. В качестве контроля брали корзинки подсолнечника, которые «инокулировали» тем же способом (опрыскивали), но при этом вместо патогена использовали дистиллированную воду. На обработанное растение надевали пергаментный изолятор на трехдневный период. Через трое суток пергаментные изоляторы снимали с корзинок. Растения с полностью сгнившими корзинками удаляли из опыта.

Определение устойчивости растений подсолнечника к сухой гнили корзинок осуществляли в фазу созревания. Для этого визуально делили тыльную поверхность корзинки на 4 сектора и также визуально определяли площадь пораженной поверхности корзинки, относя к устойчивым те растения, у которых площадь поражения 0-25%, к среднеустойчивым - 26-50%, к восприимчивым - 51-75%, к сильно восприимчивым - 76-100% от всей площади тыльной поверхности корзинки.

Таблица 2. Способы заражения корзинки подсолнечника и распространенность болезни на ее поверхности Краснодар, ВНИИМК, 2006-2007 гг. Способы инокуляции корзинки подсолнечника Фаза заражения Распространенность болезни, % Размещение зерновок овса, пораженных возбудителем сухой гнили, под лист обертки корзинки подсолнечника бутонизация 16,0 начало цветения 30,0 конец цветения 60,0 Размещение семянок подсолнечника, пораженных возбудителем сухой гнили, под лист обертки корзинки подсолнечника бутонизация 16,7 начало цветения 48,0 конец цветения 72,7 Опрыскивание корзинки подсолнечника водной суспензией патогена «сухая гниль» с концентрацией 5×10³ спор/мл бутонизация 25,0 начало цветения 76,0 конец цветения 95,0

После уборки определяли хозяйственно ценные показатели семян, полученных от зараженных растений: массу 1000 семянок, масличность, энергию прорастания, всхожесть. Эти показатели сравнивали с показателями семян, полученных с контрольных (не заражаемых) растений. Показатели семян растений, отнесенных к устойчивым, совпадали с показателями семян контрольных растений. Показатели семян растений, отнесенных к среднеустойчивым, были несколько ниже, а показатели семян восприимчивых и сильно восприимчивых растений, были значительно ниже, чем у контрольных. Семена с отобранных устойчивых растений высевали на следующий год, получали от них здоровое потомство и вовлекали в последующий селекционный процесс по методу B.C.Пустовойта.

Семидневный возраст чистой культуры гриба сухой гнили обеспечивает ему максимальную патогенную силу, необходимую для эффективного искусственного заражения корзинок подсолнечника и выявления в дальнейшем устойчивых его форм.

Использование инокулюма в виде «водной суспензии чистой культуры гриба» обеспечивает простоту и легкость нанесения патогена на корзинку и благоприятные условия для его развития, так как в суспензии присутствует вода - один из необходимых факторов для развития патогена, то есть обеспечивает надежность заражения корзинки, а следовательно, повышает точность определения устойчивости.

Используемая концентрация инокулюма 5×10³ спор/мл водной суспензии в количестве 4-5 мл на одну корзинку является оптимальной инфекционной нагрузкой и обеспечивает необходимое и достаточное количество спор гриба для достоверного заражения корзинки. Концентрация менее 5×10³ спор/мл может не обеспечить достоверного заражения, а концентрация более 5×10³ спор/мл не будет соответствовать количественному уровню действия патогена в естественных условиях и приведет к искажению оценки.

Инокуляция корзинок путем опрыскивания их водной суспензией чистой культуры гриба сухой гнили не требует больших трудозатрат, т.е. не делает способ сложным.

Операция надевания изоляторов на корзинки после их инокуляции обеспечивает надежные и одинаковые условия «работы» патогена для всех инокулированных корзинок подсолнечника, т.е. обеспечивает достоверность заявляемого способа.

Проведение инокуляции корзинки в фазу «конец цветения» и оценки иммунологической реакции растения в фазу «созревания корзинки» обеспечивает приближение заражения и оценки устойчивости к естественных условиям, что делает заявляемый способ точным и простым, так как дает возможность одновременно провести и оценку, и отбор, и уборку без дополнительных затрат.

Визуальная оценка иммунологической реакции растений на заражение сухой гнилью корзинки по распространению поражения на тыльной ее поверхности, а также дифференциация устойчивости по площади поражения тыльной поверхности корзинки относительно всей тыльной ее поверхности обеспечивает удобство, простоту и достоверность способа.

В целом вся совокупность существенных признаков заявляемого изобретения обеспечивает оптимальные условия и надежность заражения корзинок сухой гнилью, приближая их к естественным, и простое, удобное и достоверное выявление устойчивых к сухой гнили форм, т.е. обеспечивает достижение поставленной цели и решение поставленной задачи.

Приготовляют водную суспензию 7-дневной чистой культуры гриба Rhizopus Ehrenb. с концентрацией 4500-5000 спор/мл, которой опрыскивают корзинки подсолнечника в фазу «конец цветения» в количестве 4-5 мл на одну корзинку. На обработанную корзинку надевают изолятор, который снимают через 3 суток. Визуальную оценку иммунологической реакции растения проводят в фазу созревания корзинки по распространению поражения на тыльной ее поверхности. Дифференциацию устойчивости проводят по степени поражения этой поверхности, относя к устойчивым те, у которых площадь поражения 0-25%, к среднеустойчивым - 26-50%, к восприимчивым - 51-75%, к сильно восприимчивым - 76-100% от всей площади тыльной поверхности корзинки. Способ позволяет обеспечить близкие к естественным условия заражения корзинок подсолнечника и расширить арсенал методов для осуществления селекции подсолнечника на устойчивость к гнилям. 4 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ определения устойчивости растений подсолнечника к сухой гнили корзинки, заключающийся в том, что выращивают 7-дневную культуру гриба Rhizopus Ehrenb. в чашках Петри, из нее приготовляют водную суспензию инокулюма с концентрацией 4500-5000 спор/мл, инокулируют корзинку в фазу «конец цветения» путем опрыскивания ее поверхности водной суспензией инокулюма в количестве 4-5 мл на одну корзинку, надевают на обработанные корзинки изоляторы, через трое суток изоляторы снимают, в фазу созревания корзинок осуществляют визуальную оценку иммунологической реакции растения по распространению поражения на тыльной поверхности корзинки, а также проводят дифференциацию устойчивости по площади поражения этой поверхности, относя к устойчивым те, у которых площадь поражения 0-25%, к среднеустойчивым - 26-50%, к восприимчивым - 51-75%, к сильно восприимчивым - 76-100% от всей площади тыльной поверхности корзинки.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что опрыскивают водной суспензией инокулюма лицевую сторону корзинки.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что опрыскивание корзинки водной суспензией инокулюма осуществляют с помощью пульверизатора.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что изоляторы, надеваемые на обработанные инокуюмом корзинки, используют из пергаментной бумаги.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что сразу же после снятия изоляторов с зараженных корзинок из опыта удаляют растения с полностью сгнившими корзинками.