ИММОБИЛИЗОВАННЫЙ И СТАБИЛИЗИРОВАННЫЙ КОМПЛЕКС АНТАГОНИСТА, ЛЮТЕИНИЗИРУЮЩИЙ ГОРМОН ВЫСВОБОЖДАЮЩЕГО ГОРМОНА, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2003 года по МПК A61K47/48 A61K38/24 

Изобретение относится к стабилизированному активному комплексу пролонгированного действия антагонистов ЛГ-ВГ, таких как антид, антареликс, азалин, А-75998, ганиреликс, антагонист Nal-Glu, с полиаминокислотой, особенно с полиглутаминовой кислотой или полиаспарагиновой кислотой, а также к способу получения таких комплексов и содержащему такие комплексы лекарственному средству.

Представленный в описании комплекс пептидный гормон-полиаминокислота может найти применение в медицине, например в терапии гормонзависимых опухолей, таких как карцинома молочной железы и предстательной железы, доброкачественная гипертрофия предстательной железы, а также в гинекологии для лечения эндометриоза, гистероскопии и нарушения фертильности.

Уровень техники.

В патентах Германии DD 257197, DD 269785, DD 299265 описаны способы получения модифицированных, а именно иммобилизованных и стабилизированных активных пептидных препаратов, их фармакологические свойства на примерах инсулина и других биологически активных протеогормонов. Отличительным признаком этих препаратов является образование комплексов активных пептидов с полиаминокислотами. В цитированных патентах описан способ, согласно которому комплекс получают в присутствии муравьиной кислоты, а также органического растворителя, такого как хлороформ, в довольно жестких условиях. При этом возможна частичная инактивация и снижение стабильности пептидных гормонов.

В 1981 г. в патентной литературе (ЕР 0042753 и ЕР 0049628) впервые была описана плохо растворимая соль или комплекс аналога ЛГ-ВГ. Получение этого комплекса было предпринято с целью создания фармацевтического препарата для применения в различных областях медицины.

В 1989 г. в патенте DE 3822459 Орсолини описал способ получения нерастворимого в воде полипептида за счет комплексообразования аналога ЛГ-ВГ с эмбоновой кислотой, таннином и стеариновой кислотой. Полученный плохо растворимый комплекс, кроме того, был включен в полимерный матрикс, представляющий собой сополимер молочная кислота-гликолевая кислота.

Другие способы получения комплексов цетрореликса, включенных в сополимер молочная кислота-гликолевая кислота, описаны Орсолини и Геймгартнером в патентах DE 4223282 и 4223284. В этих патентах рассмотрены плохо растворимые цетрореликссодержащие комплексы с эмбоновой кислотой, таннином, стеариновой кислотой и пальмитиновой кислотой.

Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является получение препаратов пролонгированного действия, содержащих антагонисты ЛГ-ВГ с улучшенными и регулируемыми свойствами и повышенной устойчивостью в отношении преждевременного расщепления протеазами для терапии в известных областях медицины, таких как лечение гормонзависимых опухолей, например карциномы молочной железы и предстательной железы, доброкачественной гипертрофии предстательной железы, а также в гинекологии для лечения эндометриоза, гистероскопии и нарушения фертильности, и разработка простых и экологически безопасных способов получения таких препаратов.

Целью изобретения является также создание нового препарата пролонгированного действия с улучшенными и регулируемыми свойствами, содержащего антагонисты ЛГ-ВГ, такие как антид, антареликс, азалин, А-75998, ганиреликс, антагонист Nal-Glu, предпочтительно цетрореликс, и биологически деградируемые полимеры, и разработка способа его получения.

Поставленная цель изобретения достигается тем, что иммобилизованный и стабилизированный активный препарат пептидного гормона для парентерального введения получают из комплекса антагониста ЛГ-ВГ с полиаминокислотой, предпочтительно полиглутаминовой и полиаспарагиновой кислотами, причем комплекс полиаминокислота-гормон получают в водном растворе в отсутствие органического растворителя, а затем высушивают лиофильно. В результате получают комплекс с регулируемыми свойствами. Регулирование скорости высвобождения активных соединений достигается путем изменения типа и молекулярной массы полиаминокислоты с помощью введения в полимерную цепь гидрофобных аминокислот или с помощью частичной этерификации (фиг.2 и фиг.3).

Комплекс согласно изобретению может быть использован в медицине для терапии гормонзависимых опухолей, таких как карцинома молочной железы и предстательной железы, доброкачественная гипертрофия предстательной железы, а также в гинекологии для стимуляции овуляции, оплодотворения in vitro, лечения эндометриоза и в связи с гистероскопией.

В описании изобретения термин комплекс означает объединение двух или более компонентов с образованием плохо растворимой системы нестехиометрического состава. При этом происходит несколько типов взаимодействия, среди которых главную роль играют нековалентные связи.

В литературе плохо растворимые пептидные комплексы иногда называют солями. Этот термин также во многих случаях неточен, поскольку, как уже упоминалось, речь не идет о соединениях с определенным составом. В пептидах и белках имеют место ионные взаимодействия, однако не только они ответственны за строение и агрегатное состояние. Для пептидов и белков термин "комплекс" или "соль" имеет более широкое значение из-за наличия множества функциональных групп, взаимодействия которых определяют структуру белка и пептида.

Перечень чертежей.

На фиг.1 представлены кривые, демонстрирующие высвобождение цетрореликса из комплекса с полиаминокислотами.

На фиг.2 представлены кривые, демонстрирующие высвобождение цетрореликса из комплекса с частично этерифицированными полиаминокислотами.

На фиг.3 представлены кривые, демонстрирующие высвобождение цетрореликса из комплекса с полиаминокислотами, модифицированными гидрофобными аминокислотами.

На фиг.4 представлены кривые, демонстрирующие подавление тестостерона у самцов крыс при введении им комплекса цетрореликса с полиаминокислотами в дозе 1,5 мг/кг.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Согласно изобретению используют полиаминокислоты, которые пригодны в качестве биосовместимых носителей пептидов при условии, что активное соединение не образует с полимером химическую связь, а фиксируется на нем исключительно за счет нековалентных связей и гидрофобных взаимодействий.

Неожиданным образом установлено, что антагонист ЛГ-ВГ цетрореликс обладает высоким сродством к полиаминокислотам, в особенности к полиаминоглутаминовой и полиаспарагиновой кислотам. Такое высокое сродство цетрореликса нельзя было предвидеть на основании литературных данных или структуры пептида. Самопроизвольно выпадающий в осадок комплекс характеризуется определенным содержанием гормона. Для изменения в комплексе содержания гормона и для получения точно определенного содержания гормона наиболее подходящим методом является лиофилизация. Условия получения комплекса согласно изобретению являются существенно более мягкими по сравнению с известными из патентов, благодаря чему снижается возможная инактивация гормонов. Межмолекулярные взаимодействия, происходящие при смешивании растворов, позволяют получить стабильные комплексы, которые характеризуются регулируемой скоростью высвобождения действующего соединения и высокой устойчивостью к протеолизу.

Полиаминокислоты определяют не только пролонгирующие свойства комплекса, но и одновременно обеспечивают защиту активных соединений от нежелательного преждевременного протеолиза. В связи с этим очевидно, что преимуществом таких препаратов является их пролонгированное действие.

Пролонгированные свойства комплексов в основном достигаются путем варьирования типа и молекулярной массы полиаминокислот, включения в полимерную цепь аминокислот с гидрофобными боковыми группами и путем частичной этерификации имеющихся в наличии карбоксильных групп.

Далее для иллюстрации сущности изобретения приводятся следующие примеры, которые не ограничивают объем притязаний согласно изобретению.

Получение комлексов полиаминокислота-пептид путем осаждения
Пример 1
50 мг полиаминокислоты растворяют в 5 мл H₂O путем добавления к полиглутаминовой кислоте 1 н. NH₄OH при слабом нагревании до 40^oС и обработке ультразвуком. 50 мг цетрореликса (в виде ацетата) растворяют в 4 мл воды. Раствор полиаминокислоты перемешивают и добавляют раствор цетрореликса одной порцией, затем смесь выдерживают при 4^oС в течение 4 ч. Полученную смесь центрифугируют при 4000 об/мин в течение 5 мин, супернатант отбрасывают и осадок сушат в вакууме над Р₂О₅ в течение 24 ч.

Так как стехиометрических комплексов не образуется, выход рассчитывают относительно суммарного количества исходных веществ. На фиг.1 приведены различные кривые зависимости высвобождения цетрореликса в статичных условиях от молекулярной массы (среда высвобождения: 0,01 М ацетат аммония, рН 7,0).

Выход 50-65% от теоретически возможного.

Содержание цетрореликса в комплексе приведено в таблице.

Получение комплексов полиаминокислота-пептид с определенным содержанием пептида путем лиофилизации.

Пример 2
Комплекс цетрореликса с 50% содержанием пептида.

50 мг полиаминокислоты растворяют в 5 мл H₂O путем добавления к полиглутаминовой кислоте 1 н. NH₄OH при слабом нагревании до 40^oС и обработке ультразвуком. 50 мг цетрореликса (в виде ацетата) растворяют в 4 мл воды. Раствор полиаминокислоты перемешивают, добавляют раствор цетрореликса одной порцией и перемешивают еще 2 мин. Образующийся комплекс замораживают при -20^oС и лиофилизируют. Так как стехиометричный комплекс не образуется, выход рассчитывают относительно суммарного количества исходных веществ.

Выход: 90-95% от теоретически возможного.

Содержание цетрореликса в комплексе: 45-50%.

Пример 3
Комлекс с 70% содержанием цетрореликса получают аналогичным способом при соответствующем изменении количеств полиаминокислоты и цетрореликса.

Пример 4
Увеличение гидрофобности, связанное с увеличением содержания пролонгирующего компонента, в частности, достигается также с помощью частичной этерификации карбоксильных групп. На фиг.2 приведены кривые зависимости высвобождения цетрореликса из цетрореликссодержащих комплексов от степени этерификации метилового эфира полиглутаминовой кислоты. На фиг.3 - кривые зависимости высвобождения цетрореликса из цетрореликссодержащих комплексов сополимеров полиглутаминовой кислоты с лейцином и фенилаланином.

Пример 5
Для подтверждения результатов по высвобождению, полученных in vitro, действие цетрореликссодержащих комплексов исследуют на животных. Для проведения эксперимента используют цетрореликссодержащие комплексы со следующими полиаминокислотами:
- полиглутаминовая кислота, М 5000 г/моль
- полиглутаминовая кислота, М 16000 г/моль
- полиаспарагиновая кислота, М 7300 г/моль.

На фиг.4 приведены данные по супрессии тестостерона у самцов крыс после однократной подкожной инъекции в дозе 1,5 мг/кг. Для каждой группы исследуемых комплексов используют 5 животных.

На основании полученных результатов показано, что продолжительность действия исследованных комплексов при тестировании супрессии тестостерона составляет более 600 ч (фиг.4).

Благодаря своим основным свойствам и эффективности действия комплексы цетрореликс-полиаминокислота могут быть использованы в качестве препаратов пролонгированного действия.

Изобретение относится к области медицины и касается создания препарата пролонгированного действия, содержащего антагонисты ЛГ-ВГ, в особенности цетрореликса, на основе комплекса с подходящими биофильными носителями, обеспечивающего направленное высвобождение активного соединения в течение нескольких недель. Для образования комплекса с цетрореликсом используют кислые полиаминокислоты - полиглутаминовую и полиаспарагиновую, имеющую среднюю молекулярную массу 5000-20000 г/моль. Комплексы цетрореликса с полиаминокислотами образуются осаждением из водных растворов при объединении растворов компонентов, с последующим отделением осадка центрифугированием и высушиванием лиофилизацией. Опыты на животных показали принципиальную эффективность комплексов цетрореликса с полиаминокислотами в качестве препаратов пролонгированного действия. Благодаря связыванию центрореликса полиаминокислотами в комплексе продолжительность супрессии тестостерона у самцов мышей достигает более 600 ч. При этом высвобождение активного соединения можно регулировать в зависимости от типа полимера и его молекулярной массы. Преимущество изобретения заключается в создании нового препарата пролонгированного действия. 3 с. и 4 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.

1. Иммобилизованный и стабилизированный комплекс гидрофобного синтетического антагониста ЛГ-ВГ с полиаминокислотой, в частности, полиглутаминовой кислотой или полиаспарагиновой кислотой, имеющей среднюю молекулярную массу 5000-20000 г/моль, с регулируемым содержанием пептидного гормона. 2. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что в качестве антагониста ЛГ-ВГ он содержит антид, антареликс, азаин, А-75998, ганиреликс, Nal-Glu антагонист или предпочтительно цетрореликс. 3. Комплекс по п.1 или 2, отличающийся тем, что в качестве полиаминокислоты он содержит полиаминокислоту с гидрофобными аминокислотами в полимерной цепи или частично этерифицированную полиаминокислоту. 4. Способ получения иммобилизованного и стабилизированного активного препарата пептидного гормона для парентерального введения на основе комплекса антагониста ЛГ-ВГ с полиаминокислотой по любому из пп.1, 2 или 3, включающий осаждение указанного комплекса из водного раствора, отличающийся тем, что скорость высвобождения антагониста ЛГ-ВГ регулируют посредством включения гидрофобных аминокислот в полимерную цепь или посредством частичной этерификации полиаминокислоты. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что осаждение комплекса из водного раствора осуществляют лиофилизацией. 6. Лекарственное средство, содержащее по меньшей мере одно соединение по любому из пп.1-3, вспомогательные вещества, носители и стабилизаторы. 7. Лекарственное средство по п.6, отличающееся тем, что оно предназначено для применения при лечении гормонзависимых опухолей, предпочтительно карцином молочной железы, матки и предстательной железы, доброкачественной гипертрофии предстательной железы, нарушений фертильности, эндометриоза и при гистероскопии, а также для оплодотворения in vitro.