СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТИВНОЙ ФОРМЫ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ НЕМАТОД СЕМЕЙСТВ STEINERNEMATIDAE И HETERORHABDITIDAE Российский патент 2003 года по МПК A01K67/33 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам хранения энтомопатогенных нематод, применяемых в качестве биологических препаратов в борьбе с насекомыми-вредителями.

Известен способ получения препаративной формы энтомопатогенных нематод в водно-растворимых гидрогелеевых гранулах на основе альгинатов, состоящих из следующих компонентов - альгинат натрия, вода и хлористый кальций (СаС₂•2Н₂О). Альгинат (2 г) растворяют в 100 мл воды путем активного перемешивания в течение 5 мин. Инвазионных личинок нематод смешивают с раствором альгината в соотношении приблизительно 4000 нематод на 1 мл воды. Полученный раствор, содержащий нематоды, по каплям подают в раствор хлористого кальция (100 мМ CaCl₂•2H₂O). В растворе из альгинатных капель образуются гранулы, которые после затвердевания спустя 20-30 мин разделяют по размерам и ополаскивают деионизированной водой. Капсулы хранят в полиэтиленовых мешках при +4^oС. Спустя 9 месяцев гибель нематод в капсулах достигает 70-90%. Капсулы вносят в почву для борьбы с насекомыми, при этом полное высвобождение нематод из капсул происходит в течение недели (1).

Недостатки препаративной формы нематод на основе гидрогелиевых гранул определяются: 1) трудоемкостью процесса изготовления гранулированной формы препаратов на основе нематод; 2) малой численностью нематод в единице массы препаративной формы (в 1 г альгинатных гранул может содержаться от 5 до 15 тыс. нематод) и, как следствие, большой массой препаратов, которая, например, для обработки 1 гектара пашни будет составлять от 200 до 500 кг; недлительным сохранением жизнеспособности нематод в гранулах и медленным высвобождением из них нематод в почве, что позволяет применять такую препаративную форму в качестве профилактического, а не активного средства защиты растений от насекомых.

Наиболее близким из известных, принятым за прототип, является способ получения водно-диспергируемой псевдосухой препаративной формы, состоящей из следующих компонентов: альгинат натрия, Твин-80, аэросил марки А-380 (гидрофильный порошок двуокиси кремния) и дистиллированная вода. В препаративной форме нематоды сохраняют жизнеспособность при 18-22^oС в течение 7 дней и 3 месяца - при 2-8^oС (2).

Недостатки прототипа определяются: 1) трудоемкостью и необходимостью строгого соблюдения техники при изготовлении препаративной формы, так как аэросил представляет собой чрезвычайно легкие частицы, в сухом виде легко образующие стойкий аэрозоль, который может вызвать у персонала хроническую пневмонию, напоминающую силикоз легких; 2) высокой стоимостью аэросила (до 8000 $ за тонну); 3) плохой диспергируемостью препаративной формы в воде и образованием осадка, затрудняющего применение препарата опрыскивающей техникой; 4) коротким периодом сохранения жизнеспособности нематод в процессе хранения.

Задача, решаемая изобретением, - увеличение срока сохранения жизнеспособности энтомопатогенных нематод в период хранения, транспортировки и улучшение технологии применения нематодных препаратов.

Предлагаемый способ получения препаративной формы для хранения энтомопатогенных нематод заключается в том, что осадок водной суспензии нематод после центрифугирования вначале диспергируют в защитном водном растворе, содержащем 1% альгината натрия и 0,5% Твина-80 (Полиоксиэтилен сорбитан моноолеат, n=20, квалификация "ч").

Отдельно готовят вспененный раствор полимеров или смеси полимеров. Суспензия нематод в защитном растворе соединяется с полимерной пеной путем ее перемешивания до получения гомогенной массы.

Готовую препаративную форму помещают в полиэтиленовые пакеты, которые герметично закрывают и хранят при 2-22^oС.

Пример 1. Приготовление препаративной формы начинают с центрифугирования водной суспензии инвазионных личинок нематод (2000 об./мин), предварительно определив количество жизнеспособных нематод в водной суспензии. Например, в расчете на 1 л исходной водной суспензии численность нематод составила 52 млн особей, тогда в отобранных 5 л суспензии нематод оказалось 260 млн особей (В). После центрифугирования масса осадка с нематодами составила 156 г (О_с).

Далее рассчитывают необходимое количество защитного раствора по формуле
0,5 • М - О_с,
где М - предполагаемый конечный вес препарата;
М=В: 320 (предполагаемое количество нематод в 1 г препарата),
тогда М=260 млн: 320 тыс. = 812 г.

Общая масса защитного раствора (1%-ный альгинат + 0,5% Твин-80) составит
0,5 • 812-156 = 250 г
Приготовление защитного раствора: навеску (0,5%) 2,5 г Твина-80 растворяют при перемешивании в 500 мл воды, затем сюда же при нагревании (80-90^oС) и постоянном перемешивании (1000 - 2000 об./мин) добавляют навеску альгината (1%) - 5 г до полного растворения альгината. В охлажденный раствор до комнатной температуры диспергируют при постоянном перемешивании осадок нематод (156 г) до получения гомогенной массы. Таким образом общая масса защитного раствора с осадком нематод составит 406 г (250+156).

Отдельно готовят 2% водный раствор метилцеллюлозы (ТУ 6-01-717-72 ), степень замещения 150÷200 с 0,4% NaCl. Для этого 20 г метилцеллюлозы заливают 200 мл горячей воды (80-85^oС) до полного смачивания всех частиц полимера, затем при перемешивании (1000 об./мин) сюда добавляют 800 мл раствора NaCl (3,2 г) комнатной температуры. В образовавшуюся полимерную пену в соотношении 1: 2 вливают при постоянном перемешивании (100 об./мин) защитный раствор с нематодами до получения гомогенной массы. Конечная масса препаративной формы составит 1218 г, при этом в 1 г препаративной формы будет содержаться в среднем 213,5 тыс. нематод.

Пример 2. Приготовление препаративной формы для хранения энтомопатогенных нематод начинают с центрифугирования водной суспензии инвазионных личинок и далее как в примере 1. После диспергирования осадка с нематодами в защитный раствор общая масса полученной смеси составила 406 г.

Отдельно готовят 1% водный раствор агара микробиологического. Для этого 5 г агара помещают в 500 мл воды и при перемешивании доводят до кипения. После охлаждения до 50^oС в раствор добавляют в качестве стабилизатора пен 1 г (0,2%) сапонина (фирма Calbiochem в Каталоге 558255). Раствор перемешивают лопастной мешалкой (1000 - 2000 об./мин) до тех пор, пока температура раствора не станет равной комнатной. В образовавшуюся пену в соотношении 1:1 вливают при постоянном перемешивании (100 об./мин) защитный раствор с нематодами до получения гомогенной массы. К полученной массе для связывания свободной воды и стабилизации пористой структуры препаративной формы добавляют при перемешивании (100 об./мин) 28,4 г (3,5%) белой сажи (марка БС-100 - нелетучий гидрофильный порошок двуокиси кремния). Конечная масса препаративной формы составит 840,4 г, при этом в 1 г препаративной формы будет содержатся в среднем 309,4 тыс. нематод.

Пример 3. Приготовление препаративной формы для хранения энтомопатогенных нематод начинают с центрифугирования водной суспензии инвазионных личинок и далее как в примере 1. После диспергирования осадка с нематодами в защитный раствор общая масса полученной смеси составила 406 г.

Отдельно готовят вспененный раствор полимеров следующего состава: 1% поливиниловый спирт (молекулярный вес ~20 тыс., фирма Fluka), 0,3% Na-карбоксиметилцеллюлоза, 0,2% солодовый экстракт и 0,5% борная кислота. Для этого 1,5 г Na-карбоксиметилцеллюлозы помещают в 500 мл горячей воды (80-85^oС), при перемешивании (1000 об./мин) доводят до полного ее растворения. Далее в этот раствор (80-85^oС) при перемешивании добавляется 5 г поливинилового спирта и 1 г солодового экстракта. После вспенивания к полученной смеси прикапывают при перемешивании (1000 об./мин) предварительно приготовленный (0,5 г в 100 мл воды) раствор борной кислоты в соотношении 1:10 (т.е. 1 часть борной кислоты к 10 частям пены).

В образовавшуюся полимерную пену в соотношении 1:1 вливают при постоянном перемешивании (100 об./мин) защитный раствор с нематодами до получения гомогенной массы. Конечная масса препаративной формы составит 812 г, при этом в 1 г препаративной формы будет содержаться в среднем 320,2 тыс. инвазионных личинок нематод.

Приготовленные препаративные формы (примеры 1, 2, 3) расфасовывают на весах в полиэтиленовые пакеты (по 25 млн нематод в 1 пакете). Пакеты запаивают и хранят 5 пакетов при комнатной температуре и 5 пакетов в холодильнике при 2-8^oС. Через определенные промежутки времени из пакетов отбирают микропробы препарата и оценивают жизнеспособность инвазионных личинок нематод. Пробу помещают в мерный стакан с водой и стеклянной палочкой размешивают гидрогель до полного его растворения в воде, после чего под бинокуляром МБС-10 проводят подсчет и оценку состояния жизнеспособности нематод в пробе. Пробы отбирают в 5-кратной повторности.

Результаты оценки сохраняемости энтомопатогенных нематод Steinernema carpocapsae штамм "agriotos" в изготовленных препаративных формах приведены в табл.1, 3 и 5.

После завершения периода хранения определяют патогенность инвазионных личинок нематод по показателю LD₅₀ (количество инвазионных личинок нематод, вызывающих 50%-ную гибель насекомых - гусениц G. mellonella) для культур нематод перед заделкой их на хранение в препаративные формы и после хранения (табл.2, 4 и 6) (3).

Таким образом, приведенные примеры 1, 2 и 3 свидетельствуют об эффективности хранения энтомопатогенных нематод в предлагаемых препаративных формах, в которых достигается увеличение продолжительности сохранения жизнеспособности и инвазионной активности нематод по сравнению с прототипом.

Наилучшая сохраняемость инвазионных личинок достигается в препаративной форме, изготовленной на основе агара микробиологического, сапонина и белой сажи (пример 2). Продолжительность сохранения жизнеспособности инвазионных личинок в этой препаративной форме увеличилась до одного месяца при комнатной температуре и до одного года - в условиях хранения при низких температурах (2-8^oС). При этом инвазионные личинки не теряют патогенность в отношении насекомых-хозяев. Препаративная форма технологична в применении, так как в воде растворяется без осадка. В 1 г препаративной формы можно хранить до 350 тыс. нематод, что в расчете на гектарную норму их применения составит 15 кг.

Источники информации
1. Kaya U.K., Nelsen C.E. Encapsulation of steinernematid and heterorhabditid nematodes with calcium alginate: a new approach for insect control and other applications. Environ. Entomol. - 1986. - Vol. 14. - P. 572.

2. Мевлюдов Р. Я, Данилов Л.Г., Айрапетян В.Г., Сычев А.Е. Способ подготовки биологического препарата нематод к хранению и последующему его использованию. Патент 2144289. - Бюл.2. - 2000.

3. Веремчук Г.В., Данилов Л.Г. Методические указания по определению инвазионной активности нематодных культур рода Neoaplectana (Steinernematidae). Л., 1978, 7 стр.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам хранения энтомопатогенных нематод, применяемых в качестве биологических препаратов в борьбе с насекомыми-вредителями. Способ включает получение осадка нематод, приготовление защитного раствора из альгината натрия и Твина-80, диспергирование осадка нематод в защитный раствор. Далее полученную суспензию нематод смешивают со вспененным полимером или смесью полимеров. Изобретение позволяет увеличить срок сохранения жизнеспособности энтомопатогенных нематод в период хранения, транспортировки и улучшить технологию применения нематодных препаратов. 6 табл.

Способ получения препаративной формы для хранения энтомопатогенных нематод семейств Steinernematidae и Heterorhabditidae, включающий получение осадка нематод, приготовление защитного раствора из альгината натрия и Твина-80, диспергирование осадка нематод в защитный раствор, отличающийся тем, что полученную суспензию нематод смешивают со вспененным полимером или смесью полимеров.