СПОСОБ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ НЕМАТОД Российский патент 2012 года по МПК A01N63/00 A01K67/33 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам и линиям для производства биологических препаратов на основе энтомопатогенных нематод, применяемых в качестве биологических препаратов в борьбе с насекомыми-вредителями.

Известен способ получения биомассы энтомопатогенных нематод, который заключается в том, что компоненты питательной среды - куриные потроха, свиной жир и воду гомогенизируют, пропитывают гомогенатом инертный носитель, засыпают питательную среду в полипропиленовые мешки и стерилизуют. В охлажденную питательную среду инокулируют жидкую культуру симбиотических бактерий. После 48-часового выращивания бактерий в питательную среду инокулируют инвазионных личинок нематод. В процессе развития нематод и бактерий в мешки с питательной средой осуществляется подача стерильного воздуха. Отделение зрелой культуры нематод от инертного носителя проводится путем распределения поролоновой крошки на сита, помещенные в корыта с водой. Осадок нематод на дне емкости спустя 2 часа концентрируют для хранения и дальнейшего использования [1].

В качестве недостатков такого способа культивирования нематод следует отметить следующие: низкий выход зрелой культуры нематод с 1 г питательной среды, трудоемкость процессов инокуляции микроорганизмов в полипропиленовые мешки с питательной средой и не технологичность процесса, связанного с необходимостью принудительной аэрации среды для обеспечения развития бактерий и нематод.

Наиболее близким из известных, принятым за прототип, является способ, включающий получение биомассы нематод с использованием полужидких питательных сред, состоящих из следующего компонентного состава: соевая мука, кукурузное масло, куриное яйцо, пивные дрожжи, поролоновая крошка и вода. После пропитки поролоновой крошки гомогенатом компонентов питательной среды ее переносят в полипропиленовые мешки, снабженные воздушными фильтрами, и автоклавируют. После охлаждения в питательную смесь инокулируют жидкую культуру симбиотических бактерий. После 48-часовой экспозиции содержимое мешков в стерильных условиях пересыпают в другую емкость, выполненную в виде прямоугольного пластмассового корыта и снабженного съемной крышкой из фольги с отверстиями для аэрации питательной среды, куда затем инокулируют и моноксенную культуру нематод. Стерилизация пластмассовых корыт осуществляется в специальном блоке с использованием открытого огня (2).

Прототипом устройства для культивирования нематод являются полипропиленовые мешки для предварительного выращивания симбиотических бактерий, размером 600×300 мм и снабженные воздушным фильтром из фторопластовой мембраны диаметром 50 мм и с размером отверстий 4 мкм. Для выращивания нематодно-бактериального комплекса используются пластмассовые корыта прямоугольной формы размером 500×500×100 мм с бортиками по наружной стороне шириной 10 мм, снабженные съемной крышкой из фольги, края которой подгибаются за внешний бортик корыта. В центре крышки на площади 40000 мм имеются отверстия диаметром 0,5 мм, в количестве - пять отверстий на каждом сантиметре квадратном.

Недостатки прототипа определяются наличием двух устройств сложной конструкции и не обеспечивающих оптимальных условий для развития бактерий и нематод, нестабильным выходом зрелой культуры нематод из-за несовершенной системы аэрации внутренней полости пластмассовых корыт с питательной средой, а так же появления посторонней микрофлоры в питательной среде, на которой развиваются бактерии и нематоды из-за сложности процессов соблюдения стерильности условий инокуляции нематод в корыта и стерилизации самих корыт,

Задача, решаемая изобретением, - повышение выхода биомассы энтомопатогенных нематод за счет сокращения операций и устройств, требующих соблюдения условий высокой стерильности с гарантией стабильности функционировании производства со снижением себестоимости конечного продукта.

Предлагаемый способ культивирования энтомопатогенных нематод заключается в том, что в процессе производства после пропитки поролоновой крошки гомогенатом компонентов питательной среды ее переносят в устройство и автоклавируют. После охлаждения в питательную смесь инокулируют жидкую культуру симбиотических бактерий. После 48-часовой экспозиции в устройство инокулируют жидкую культуру инвазионных личинок - нематод, предварительно очищенную от посторонней микрофлоры в растворе формалина.

Устройство состоит из одного полипропиленового мешка (Фиг.1) размером 700×400 мм. В верхней стороне мешка на расстоянии 190 мм от горловины на площади 1500 мм² (50×300 мм) имеется 186 сквозных отверстий диаметром 0,5 мм каждое на верхней и нижней стороне мешка. За счет поступления воздуха через отверстия обеспечивается аэрация питательной среды с развивающимися на ней микроорганизмами. Горловина мешка закрывается матерчатой тесьмой (Фото 2), второй тесьмой (Фото 3), расположенной ниже отверстий, перекрывается поступление воздуха от сквозных отверстий к питательной среде внутри мешка.

В опытных вариантах в зависимости от количества отверстий создавались различные условия естественной аэрации внутри мешков, при этом в качестве отдельных вариантов опыта использовались мешки, имеющие 46, 93 и 186 отверстий на данной площади.

Устройство работает следующим образом, инертный носитель - поролоновую крошку - пропитывают гомогенатом компонентов питательной среды, которую переносят из расчета 0,5 кг в полипропиленовый мешок, после чего верхнюю открытую часть мешка над отверстиями (Фото 2) и нижнюю часть за отверстиями (Фото 3) закрывают с использованием матерчатых тесемок. Мешки с питательной средой автоклавируют (121°С в течение 30 мин). После охлаждения через открытую сторону мешка, после снятия матерчатых тесемок, над пламенем спиртовки инокулируют симбиотические бактерии (Xenorhabdus nematophilus) в виде водной суспензии бактериальных клеток с титром 3-10⁹ в 1 мл суспензии из расчета 100 мл суспензии на каждый мешок.

После инокуляции бактерий открытую часть мешка над отверстиями и нижнюю часть за отверстиями закрывают двумя тесемками, содержимое мешка перемешивают встряхиванием и после укладки мешка на стеллаж, для аэрации содержимого мешка, снимают тесьму, расположенную за аэрационными отверстиями перед питательной средой. После 48-часовой экспозиции при температуре 20-25°С в мешки с развившейся культурой симбиотических бактерий, предварительно сняв тесьму, через открытую сторону мешка над пламенем спиртовки инокулируют чистую культуру инвазионных личинок нематод из расчета 20 млн особей в 100 мл воды на один мешок. После инокуляции нематод открытую часть мешка над отверстиями и нижнюю часть за отверстиями закрывают двумя матерчатыми тесемками, содержимое мешка перемешивают встряхиванием и после укладки мешка на стеллаж для развития нематодно-бактериального комплекса, с целью обеспечения аэрации содержимого мешка, снимают тесьму, расположенную за аэрационными отверстиями.

Пример 1.

Получение биомассы нематод вида Steinemema carpocapsae штамм "agriotos" проводили в устройствах, заполненных питательной средой и содержащей: соевая мука - 16%, яичный порошок - 20%, кукурузное масло - 5%, пивные дрожжи - 1%, поролоновая крошка - 8%, вода - 50%. Повторность в опытах - пятикратная.

В опытном варианте питательной средой заполняли полипропиленовые мешки из расчета 0,5 кг на один мешок. В зависимости от количества отверстий в качестве отдельных вариантов создавались различные условия естественной аэрации внутри мешков, имеющих 46, 93 и 186 отверстий на данной площади.

Мешки с питательной средой автоклавировали (121°С в течение 30 мин). После охлаждения через открытую сторону мешка инокулировали, предварительно выращенные в течение двух суток в жидкой питательной среде на качалке, симбиотические бактерии (Xenorhabdus nematophilus) в виде водной суспензии бактериальных клеток с титром 3·10⁹ из расчета 100 мл суспензии на каждый мешок.

После 48-часовой экспозиции при температуре 20-25°С в мешки с развившейся культурой симбиотических бактерий инокулировали чистую культуру инвазионных личинок нематод из расчета 20 млн особей в 100 мл воды на один мешок. Содержимое мешков перемешивали встряхиванием и укладывали на стеллаж для развития нематодно-бактериального комплекса. Все операции по инокуляции бактерий и нематод в мешки проводили над пламенем горелки.

В контрольном варианте питательной средой сначала заполняли полипропиленовые мешки из расчета 0,7 кг среды на один мешок. Мешки с питательной средой автоклавировали (121°С в течение 30 мин) и после охлаждения в каждый мешок инокулировали симбиотические бактерии (Xenorhabdus nematophilus) в количестве 100 мл бактериальной суспензии с титром 3·10 бактериальных клеток. Бактерий в питательную среду инокулировали в виде водной суспензии бактериальных клеток.

Содержимое мешков после инокуляции бактерий тщательно перемешивали и содержали при температуре 20-25°С. После 48-часовой экспозиции содержимое мешков в стерильных условиях пересыпали в пластмассовые корыта, предварительно простерилизованные над открытым пламенем газовой горелки в течение 10 секунд. Одновременно в питательную среду с выращенной культурой бактерий в стерильных условиях инокулировали моноксенную культуру инвазионных личинок нематод из расчета 30 млн особей на одно корыто. Затем корыта накрывали крышкой из фольги и переносили их в термостатированное помещение с температурой 23-25°С для развития нематодно-бактериального комплекса.

Зрелую культуру нематод выделяли вымыванием из поролоновой крошки и подсчитывали количество нематод в полученной водной суспензии инвазионных личинок с одновременным определением их инвазионной (энтомопатогенной) активности по показателю LD₅₀ для тест-насекомых (3).

Продуктивный выход биомассы нематод в опытном и контрольном вариантах определяли после завершения цикла развития нематод в питательной среде. Результаты оценки продуктивного выхода нематод в расчете на 1 г питательной среды приведены в таблице 1.

Выход биомассы нематод из мешков, имеющих аэрируемую поверхность с 186 отверстиями на верхней и нижней стороне мешка, составил 622,2 тыс. инвазионных личинок с 1 г питательной среды, в контрольном опыте соответственно 430,6 тыс. нематод. С увеличением и уменьшением количества отверстий в опытных мешках выход биомассы нематод снижался (табл.1). При этом наилучший показатель инвазионной (энтомопатогенной) активности нематод (LD₅₀=23,3±1,9) - был в варианте с 186 отверстиями на верхней и нижней стороне мешка. С увеличением и уменьшением количества отверстий инвазионная активность нематод снижалась (табл.2).

Таким образом, наилучшие результаты по выходу биомассы нематод и их инвазионной (энтомопатогенной) активности получены при использовании естественной аэрации биоректоров. При этом достигается увеличение выхода биомассы нематод с 1 г питательной среды до 30,8% и значительное снижение себестоимости биомассы нематодных препаратов.

Источники информации

1. Bedding R.A. Large scale production, storage and transport of the insectpara-site nematodes Neoaplectana spp. and Heterorhabditis spp.// Ann. Appl. Biol. 1984. Vol.104, №1. P.117-120.

2. Данилов Л.Г., Айрапетян В.Г. Способ и линия для производства биологических препаратов на основе энтомопатогенных нематод. Патент №2239315, Бюл. №31, 2004.

3. Веремчук Г.В., Данилов Л.Г. Методические указания по определению инвазионной активности нематодных культур рода Neoaplectana (Stein-emematidae). Л., 1978, 7 стр.

Таблица 1 Продуктивный выход биомассы энтомопатогенных нематод в расчете на 1 г питательной среды при различных способах их культивирования Контроль - культивирование нематод с использованием полипропиленовых мешков и пластмассовых корыт Опыт - культивирование нематод с использованием одного полипропиленового мешка Количество отверстий на верхней и нижней стороне мешка для выращивания микроорганизмов 46 93 186 430,6 320,3 510,7 622,2 HCP_0,05-42,6

Таблица 2 2 Инвазионная (энтомопатогенная) активность нематод Steinemema carocapsae штамм "agriotos" в отношении тест-насекомых (Galleria mellonella) Показатель патогенности нематод Варианты опыта Культивирование нематод с использованием полипропиленовых мешков и пластмассовых корыт (контроль) Культивирование нематод с использованием одного полипропиленового мешка (опыт) Количество отверстий на верхней и нижней стороне мешка для выращивания микроорганизмов LD₅₀* 24,8±3,7 46 93 186 25,7±3,2 24,2±2,6 23,3±1,9 *LD₅₀ - количество инвазионных личинок нематод, вызывающих 50%-ную гибель насекомых

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Способ включает заполнение биореакторов питательной средой, в которую после стерилизации и охлаждения инокулируют жидкую культуру симбиотических бактерий и после 48-часовой экспозиции сюда же инокулируют нематод. Биореакторы помещают в термостатированные камеры для развития нематодно-бактериального комплекса. Биореактор выполнен в виде отдельного полипропиленового мешка размером 700×400 мм со 186 сквозными отверстиями диаметром 0,5 мм на каждой стороне мешка, на расстоянии 190 мм от верхней части мешка и на площади 1500 мм² из расчета 50 мм по высоте и 300 мм по ширине мешка. Способ позволяет увеличить выход биомассы и инвазивную активность нематод. 3 ил., 2 табл., 1 пр.

Способ для производства энтомопатогенных нематод, включающий заполнение биореакторов питательной средой, в которую после стерилизации и охлаждения инокулируют жидкую культуру симбиотических бактерий и после 48-часовой экспозиции сюда же инокулируют нематод, затем биореакторы помещают в термостатированные камеры для развития нематодно-бактериального комплекса, отличающийся тем, что биореактор выполнен в виде отдельного полипропиленового мешка размером 700×400 мм со 186 сквозными отверстиями диаметром 0,5 мм на каждой стороне мешка на расстоянии 190 мм от верхней части мешка и на площади 1500 мм² из расчета 50 мм по высоте и 300 мм по ширине мешка.