СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТИВНОЙ ФОРМЫ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ НЕМАТОД СЕМЕЙСТВ Steinernematidae И Heterorhabditidae Российский патент 2004 года по МПК A01K67/33 A01N63/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам хранения энтомопатогенных нематод, применяемых в качестве биологических препаратов в борьбе с насекомыми-вредителями.

Известен способ получения препаративной формы энтомопатогенных нематод в воднорастворимых гидрогелеевых гранулах на основе альгинатов, состоящих из следующих компонентов: альгинат натрия, вода и хлористый кальций (СаCl₂2H₂O). Альгинат (2 г) растворяют в 100 мл воды путем активного перемешивания в течение 5 мин. Инвазионных личинок нематод смешивают с раствором альгината в соотношении приблизительно 4000 нематод на 1 мл воды. Полученный раствор, содержащий нематод, по каплям подают в раствор хлористого кальция (100 мМ СаСl₂2Н₂О). В растворе из альгинатных капель образуются гранулы, которые после затвердевания спустя 20-30 мин разделяют по размерам и ополаскивают деионизированной водой. Капсулы хранят в полиэтиленовых мешках при температуре +4^oС. Спустя 9 месяцев гибель нематод в капсулах достигает 70-90%. Капсулы вносят в почву для борьбы с насекомыми, при этом полное высвобождение нематод из капсул происходит в течение недели (1).

В качестве недостатков препаративной формы нематод на основе гидрогелеевых гранул следует отметить следующие: 1) трудоемкость процесса изготовления гранулированной формы препаратов на основе нематод; 2) малая численность нематод в единице массы препаративной формы (в 1 г альгинатных гранул может содержаться от 5 до 15 тыс. нематод) и как следствие большая масса препаратов, которая, например, для обработки 1 га пашни будет составлять от 200 до 500 кг; недлительное сохранение жизнеспособности нематод в гранулах и медленное высвобождением из них нематод в почве, что позволяет применять такую препаративную форму в качестве профилактического, а не активного средства защиты растений от насекомых.

Наиболее близким из известных, принятым за прототип, является способ получения воднодиспергируемой псевдосухой препаративной формы, состоящей из следующих компонентов: альгинат натрия, Твин-80, аэросил марки А-380 (гидрофильный порошок двуокиси кремния) и дистиллированная вода. В препаративной форме нематоды сохраняют жизнеспособность при температуре 18-22^oС в течение 7 дней и 3 месяца - при температуре 2-8^oС (2).

Недостатки прототипа определяются: 1) трудоемкостью и необходимостью строгого соблюдения техники при изготовлении препаративной формы, так как аэросил представляет собой чрезвычайно легкие частицы в сухом виде, легко образующие стойкий аэрозоль, который может вызвать у персонала хроническую пневмонию, напоминающую силикоз легких; 2) высокой стоимостью аэросила (до 8000$ за тонну); 3) плохой диcпергируемостью препаративной формы в воде и образованием осадка, затрудняющего применение препарата опрыскивающей техникой; 4) коротким периодом сохранения жизнеспособности нематод в процессе хранения.

Задача, решаемая изобретением, - увеличение срока сохранения жизнеспособности энтомопатогенных нематод в период хранения, транспортировки и улучшение технологии применения нематодных препаратов.

Предлагаемый способ получения препаративной формы для хранения энтомопатогенных нематод заключается в том, что осадок водной суспензии нематод после центрифугирования вначале диспергируют в защитном водном растворе, содержащем 1% альгината натрия и 0,5% Твина-80 (Полиоксиэтилен сорбитан моноолеат, n=20, квалификация "ч").

В защитный раствор с нематодами при перемешивании дополнительно вносится перфторуглерод-этиловый эфир 2-трифторметил-3-оксоперфторгексановой кислоты в концентрации 0,1-2%. Добавление перфторуглерода, являющегося действующим веществом заменителей крови, способствует повышению концентрации растворенного кислорода в защитном водном растворе и таким образом способствует улучшению условий для жизнедеятельности нематод.

К полученному концентрату нематод добавляется при постоянном перемешивании белая сажа марки БС-100 (нелетучий гидрофильный порошок двуокиси кремния с площадью поверхности 100 м² на 1 г вещества) в соотношении: масса концентрата нематод к массе белой сажи от 2,8 до 2,9.

Критерием окончания процесса перемешивания является насыпная плотность препаративной формы, которая должна составить ≤0,5 г/мл, что выражается в получении рыхлого гомогенного псевдосухого порошка серого цвета.

Готовую препаративную форму помещают в полиэтиленовые пакеты, которые герметично закрывают и хранят при температуре 2-22^oС.

Пример 1. Приготовление препаративной формы начинают с центрифугирования водной суспензии инвазионных личинок нематод (2 тыс. об/мин), предварительно определив в ней количество жизнеспособных нематод. Например, в расчете на 1 л исходной водной суспензии численность нематод составила 50 млн. особей, тогда в отобранных 15 л суспензии нематод оказалось 750 млн. особей (B). После центрифугирования масса осадка с нематодами составила 480 г (О_с).

Далее рассчитывают необходимое количество защитного раствора по формуле
0,74•М - О_с,
где М - предполагаемый конечный вес препарата,
М = В: 250 (предполагаемое количество нематод в 1 г препарата), тогда М= 750 млн.: 250 тыс. = 3000 г.

Общая масса защитного раствора (1%-ный альгинат + 0,5% Твин-80) составит 0,74•3000 - 480 = 1740 г.

Приготовление защитного раствора: навеску (0,5%) 10 г Твина-80 растворяют при перемешивании в 2000 мл воды, затем сюда же при нагревании (80-90^oС) и постоянном перемешивании (1000-2000 об/мин) добавляют навеску альгината (1%) - 20 г до полного растворения альгината. В охлажденный раствор до комнатной температуры (1740 г) диспергируют при постоянном перемешивании осадок нематод (480 г) до получения гомогенной массы.

Полученную гомогенную массу нематод в защитном растворе делят на три части, в каждую из которых дополнительно при перемешивании вносится этиловый эфир 2-трифторметил-3-оксо-перфторгексановой кислоты соответственно в концентрациях 0,05, 0,1 и 0,2% (т.е. 0,37, 0,74, 1,48 г). Далее к полученным концентратам нематод добавляют при постоянном перемешивании (60 об/мин в начале процесса и до 180 об/мин в конце его) белую сажу (БС-100), количество которой рассчитывается по формуле
БС=М•О,26,
тогда БС=3000•0,26=780 г (т.е. по 260 г в каждый концентрат).

Приготовленные препаративные формы расфасовывают на весах в полиэтиленовые пакеты (по 25 млн. нематод в 1 пакете). Пакеты запаивают и хранят 5 пакетов при комнатной температуре (18-22^oС) и 5 пакетов в холодильнике при температуре 2-8^oС. Через определенные промежутки времени из пакетов отбирают микропробы препарата и оценивают жизнеспособность инвазионных личинок нематод. Пробу помещают в мерный стакан с водой и стеклянной палочкой диспергируют пробу в воде, после чего под бинокуляром МБС-10 проводят подсчет и оценку состояния жизнеспособности нематод в пробе. Пробы отбирают в 5-кратной повторности.

Результаты оценки сохраняемости энтомопатогенных нематод Steinernema carpocapsae штамм "agriotos" в изготовленных препаративных формах приведены в таблице 1.

После завершения периода хранения определяют патогенность инвазионных личинок нематод по показателю LD₅₀ (количество инвазионных личинок нематод, вызывающих 50%-ную гибель насекомых - гусениц G. mellonella) для культур нематод перед заделкой их на хранение в препаративные формы и после хранения (табл. 2) (3).

Таким образом, приведенные в табл.1 и 2 данные свидетельствует об эффективности хранения энтомопатогенных нематод в предлагаемых препаративных формах, в которых достигается увеличение продолжительности сохранения жизнеспособности и инвазионной активности нематод по сравнению с прототипом.

Наилучшая сохраняемость инвазионных личинок достигается в препаративной форме, при изготовлении которой в защитный раствор с нематодами дополнительно вносится перфторуглерод в концентрации 0,1%. Продолжительность сохранения жизнеспособности инвазионных личинок в этой препаративной форме увеличилась до одного месяца при комнатной температуре и до 6 месяцев в условиях хранения при низких температурах (2-8^oС). При этом инвазионные личинки не теряют патогенность в отношении насекомых-хозяев.

С уменьшением концентрации перфторуглерода продолжительность сохранения жизнеспособности инвазионных личинок снижалась. Увеличение концентрации перфторуглерода до 0,2% практически не отражается на длительности сохранения жизнеспособности нематод. Дальнейшее повышение концентрации нецелесообразно из-за плохой растворимости этого вещества в защитном растворе с нематодами.

Себестоимость новой препаративной формы уменьшается в десятки раз по сравнению с прототипом и процесс ее приготовление не требует соблюдения специальной техники безопасности.

Источники информации
1. Kaya H.K., Nelsen C.E. Encapsulation of steinernematid and heterorhabditid nematodes with calcium alginate: a new approach for insect control and other applications. Environ. Entomol. - 1986. - Vol. 14. - P. 572.

2. Мевлюдов Р.Я., Данилов Л.Г., Айрапетян В.Г., Сычев А.Е. Способ подготовки биологического препарата нематод к хранению и последующему его использованию. Патент 2144289, - Бюл. 2. - 2000 г.

3. Веремчук Г.В., Данилов Л.Г. Методические указания по определению инвазионной активности нематодных культур рода Neoaplectana (Steinernematidae). Л., 1978, 7 стр.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения препаративной формы для хранения энтомопатогенных нематод Steinernematidae и Heterorhabditidae, применяемых в качестве биологических препаратов в борьбе с насекомыми-вредителями. Способ получения препаративной формы для хранения энтомопатогенных нематод семейств Steinernematidae и Heterorhabditidae включает получение осадка нематод, приготовление защитного раствора из альгината натрия и Твина-80, диспергирование осадка нематод в защитный раствор и отличается тем, что в защитный раствор с нематодами перед смешиванием с белой сажей дополнительно вносят этиловый эфир 2-трифторметил-3-оксо-перфторгексановой кислоты в концентрации 0,1-0,2%. Изобретение позволяет увеличить срок сохранения жизнеспособности энтомопатогенных нематод в период хранения, транспортировки и улучшить технологию применения нематодных препаратов. 2 табл.

Способ получения препаративной формы для хранения энтомопатогенных нематод семейств Steinernematidae и Heterorhabditidae, включающий получение осадка нематод, приготовление защитного раствора из альгината натрия и Твина-80, диспергирование осадка нематод в защитный раствор, соединение полученного концентрата нематод с белой сажей, отличающийся тем, что в защитный раствор с нематодами перед смешиванием с белой сажей дополнительно вносят этиловый эфир 2-трифторметил-3-оксоперфторгексановой кислоты в концентрации 0,1-0,2%.