СПОСОБ И ЛИНИЯ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ НЕМАТОД Российский патент 2004 года по МПК A01K67/33 C12M1/04 C12M1/22 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам и линиям для производства биологических препаратов на основе энтомопатогенных нематод, применяемых в качестве биологических препаратов в борьбе с насекомыми-вредителями.

Известен способ получения биомассы энтомопатогенных нематод, который заключается в том, что компоненты питательной среды - куриные потроха, свиной жир и воду гомогенизируют, пропитывают гомогенатом инертный носитель, засыпают питательную среду в полипропиленовые мешки и стерилизуют. В охлажденную питательную среду инокулируют жидкую культуру симбиотических бактерий. После 48-часового выращивания бактерий в питательную среду инокулируют инвазионных личинок нематод. В процессе развития нематод и бактерий в мешки с питательной средой осуществляется подача стерильного воздуха. Отделение зрелой культуры нематод от инертного носителя проводится путем распределения поролоновой крошки на сита, помещенные в корыта с водой. Осадок нематод на дне емкости спустя 2 часа концентрируют для хранения и дальнейшего использования [1].

В качестве недостатков такого способа культивирования нематод следует отметить следующие: низкий выход зрелой культуры нематод с 1 г питательной среды, трудоемкость процессов инокуляции микроорганизмов в полипропиленовые мешки с питательной средой и нетехнологичность процесса, связанного с необходимостью принудительной аэрации среды для обеспечения развития бактерий и нематод.

Наиболее близким из известных, принятым за прототип является способ, включающий получение биомассы нематод с использованием полужидких питательных сред, состоящих из следующих компонентного состава: соевая мука, кукурузное масло, куриное яйцо, пивные дрожжи, поролоновая крошка и вода. Поролоновую крошку, пропитанную гомогенатом питательной среды, помещают в металлические емкости (ящики), изготовленные из нержавеющей стали, которые стерилизуют и после охлаждения в питательную смесь инокулируют жидкую культуру симбиотических бактерий. После 48-часового выращивания бактерий в питательную среду инокулируют инвазионных личинок нематод [2].

Недостатки прототипа определяются нестабильным выходом зрелой культуры нематод из-за несовершенной системы аэрации внутренней полости ящиков с питательной средой, на которой развиваются бактерии и нематоды, и использованием в процессе производства дорогостоящих материалов и оборудования.

Задача, решаемая изобретением, - повышение выхода биомассы энтомопатогенных нематод и снижение себестоимости конечного продукта.

Предлагаемый способ культивирования энтомопатогенных нематод заключается в том, что в процессе производства после пропитки поролоновой крошки гомогенатом компонентов питательной среды ее переносят в емкость и автоклавируют. После охлаждения в питательную среду инокулируют симбиотические бактерии. После 48-часовой экспозиции содержимое мешков в стерильных условиях пересыпают в другую емкость.

Процесс культивирования начинают с приготовления чистой культуры первичных форм симбиотических бактерий и моноксенной культуры (т.е. культуры инвазионных личинок нематод с одним видом бактерий - симбиотических) нематод. Чистые культуры симбиотических бактерий получают по методу Г. Пойнара [3] путем заражения нематодами гусениц Galeria mellonella с последующим отбором бактериальных клеток из гемолимфы насекомых и посевом их на питательный YS агар (NH₄H₂PO₄ - 0,5 г; K₂HPO₄ - 0,5 г; MgSO₄·7Н₂O - 0,2 г; NaCl - 5 г; дрожжевой экстракт - 5 г; агар - 12 г; вода – 1 л) [4], содержащий трифенилтетразолиум хлорид (0,004%) и бромтимоловый голубой (0,025%), после чего проводят идентификацию первичных форм симбиотических бактерий [5].

Моноксенизацию нематод осуществляют путем стерилизации инвазионных личинок нематод в 0.1%-ном растворе мертиолата (C₂H₅HgSC₆H₄COONa) с последующим помещением их на питательный агар с чистой культурой симбиотических бактерий. Спустя пять дней на агаре развиваются половозрелые самки, которые подвергаются стерилизации путем проводки через мертиолат и набор антибиотиков [6]. Полученных от самок аксенных личинок нематод первого возраста переносят на липидный агар [7] с симбиотическими бактериями. После завершения цикла развития нематод проводят сбор моноксенной культуры инвазионных личинок нематод и инокулируют их в конические колбы (500 см³) с поролоновую губкой, пропитанной питательной средой с предварительно размноженными на ней симбиотическими бактериями Xenorhabdus nematophilus [8].

Колбы содержат при температуре 25°С и после завершения цикла развития нематод полученных моноксенных личинок используют для дальнейшего размножения на искусственной питательной среде.

Чистые культуры симбиотических бактерий хранят на питательном агаре при температуре 12°С и проверяют на чистоту ежемесячно.

Пример 1

Получение биомассы нематод вида Steinernema carpocapsae штамм "agriotos" проводили в полипропиленовых мешках и пластмассовых корытах (биореакторы) (опыт) и в металлических ящиках (биореакторы) (контроль), заполненных питательной средой и содержащей: соевая мука - 16%, яичный порошок - 20%, кукурузное масло - 5%, пивные дрожжи - 1%, поролоновая крошка - 8%, вода - 50% и адаптоген - дибазол (2 бензил-бензимидазол) в концентрации 1·10^-9 г/мл питательной среды [9]).

В опытном варианте питательной средой сначала заполняли полипропиленовые мешки из расчета 1,4 кг среды на один мешок. Мешки с питательной средой автоклавировали (121°С в течение 30 мин) и после охлаждения в каждый мешок инокулировали симбиотических бактерий (Xenorhabdus nematophilus) в количестве 100 мл бактериальной суспензии с титром 3·10⁹ бактериальных клеток. Бактерий в питательную среду инокулировали в виде водной суспензии бактериальных клеток.

Содержимое мешков после инокуляции бактерий тщательно перемешивали и содержали при температуре 25-28°С. После 48-часовой экспозиции содержимое мешков в стерильных условиях пересыпали в пластмассовые корыта, предварительно простерилизованные над открытым пламенем газовой горелки в течение 10 секунд. Одновременно в питательную среду с выращенной культурой бактерий в стерильных условиях инокулировали моноксенную культуру инвазионных личинок нематод из расчета 60 млн. особей на одно корыто. Затем корыта накрывали крышкой из фольги и переносили их в термостатированное помещение с температурой 23-25°С для развития нематодно-бактериального комплекса.

В контрольном варианте питательной средой заполняли биореакторы, состоящие из металлической емкости (500×500×10 мм) с крышкой, снабженной биофильтром. После стерилизации и охлаждения среды в стерильных условиях в питательную среду инокулировали жидкую культуру симбиотических бактерий и спустя 48 часов дополнительно инокулировали инвазионных личинок нематод, как и в опытных вариантах. Все варианты опыта и контроля имели пятикратную повторность. Продуктивный выход биомассы нематод в опытном и контрольном вариантах определяли после завершения цикла развития нематод в питательной среде.

Зрелую культуру нематод выделяли из поролоновой крошки вымыванием с использованием стиральной машины в течение 10 минут в режиме стирки с последующим подсчетом количества нематод в полученной водной суспензии в опытных и контрольном вариантах. Одновременно определяли инвазионную (энтомопатогенную) активность нематод по показателю LD₅₀ для тест-насекомых [10].

Результаты оценки продуктивного выхода нематод в расчете на 1 г питательной среды приведены в таблице 1, а их инвазионная активность приведена в таблице 2.

Приведенный пример 1 свидетельствует о высокой эффективности получения биомассы энтомопатогенных нематод с предварительным выращиванием симбиотических бактерий в полипропиленовых мешках и с последующим культивированием нематодно-бактериального комплекса в пластмассовых корытах. При этом выход биомассы нематод в опытном варианте увеличивается на 37% по сравнению с контрольным вариантом.

Способ предварительного выращивания симбиотических бактерий в полипропиленовых мешках с питательной средой способствует лучшему и стабильному развитию нематодно-бактериального комплекса в пластмассовых корытах, что сопровождается значительным увеличением выхода готовой продукции нематод с единицы массы питательной среды и снижением себестоимости производства нематодных препаратов.

Прототипом линии для культивирования нематод является "Линия для производства биологического препарата из энтомопатогенных нематод", при этом каждый биореактор для выращивания нематодно-бактериального комплекса представляет собой емкость, имеющую в поперечном сечении форму прямоугольника и снабженную съемной крышкой и отверстием для поступления воздуха внутрь нее и расположенным под отверстием биофильтром [11].

Недостатки прототипа определяются: 1) наличием биорактора - устройства сложной конструкции, не обеспечивающего оптимальных условий аэрации для развития бактерий и нематод; 2) дорогостоящим материалом - нержавеющая сталь, из которого изготавливаются биореакторы для культивирования симбиотических бактерий и нематод; 3) потребностью в автоклавах с большим объемом камер для стерилизации биореакторов.

Схема предлагаемой линии (фиг.3) включает два новых устройства, выполняющих функции биореактора. Для предварительного выращивания симбиотических бактерий используются полипропиленовые мешки (фиг.1) размером 600×300 мм и, снабженные воздушным фильтром из фторопластовой мембраны диаметром 50 мм и с размером отверстий 4 мкм. Для выращивания нематодно-бактериального комплекса используются пластмассовые корыта прямоугольной формы размером 500х500х100 мм с бортиками по наружной стороне шириной 10 мм (фиг.2, поз.2), снабженные съемной крышкой из фольги, края которой подгибаются за внешний бортик корыта. В центре крышки на площади 40000 мм² имеются отверстия диаметром 0,5 мм, в количестве пять отверстий на каждом сантиметре квадратном (фиг.2, поз.1).

Линия для производства биологических препаратов на основе энтомо-патогенных нематод (фиг.3) функционирует следующим образом.

Производство нематод начинают с приготовления гомогенета питательной среды и пропитки ею поролоновой крошки (1), которой затем заполняют полипропиленовые мешки (2). Отверстие мешка закрывают путем заклеивания скотчем и мешки с питательной средой стерилизуют автоклавированием (3). После охлаждения питательной среды в мешки инокулируют симбиотических бактерий в стерильном боксе (4), которых предварительно выращивают в течение двух суток на жидкой питательной среде на качалке либо в ферментере (5). Содержимое мешков после инокуляции бактерий тщательно перемешивают и после 48-часовой экспозиции в стерильных условиях (4) пересыпают в пластмассовые корыта (6), предварительно простерилизованные над открытым пламенем газовой горелки в блоке стерилизации (7). Одновременно в питательную среду с выращенной культурой бактерий в стерильных условиях (4) инокулируют моноксенную культуру инвазионных личинок нематод из корыт, взятых из блока выращивания (8), простерилизованных снаружи в блоке их стерилизации (7). Затем корыта накрывают крышкой и помещают в блок выращивания нематодно-бактериального комплекса (8). Спустя 20-25 дней зрелую культуру нематод выделяют вымыванием в воде с использованием типовых стиральных машин в блоке отделения инвазионных личинок от инертного носителя (9) с последующей концентрацией в блоке сгущения биомассы нематод для получения их концентрата (10), на основе которого получают препаративную форму нематодных препаратов (11). Освобождающиеся в процессе производства мешки и корыта после их мойки (12) и стерилизации (3, 7) включаются в процесс производства. Вода, используемая в процессе производства, проходит замкнутый цикл, включающий ее очистку от остатков питательной среды и продуктов жизнедеятельности нематод и бактерий (13).

Таким образом, предлагаемая линия для производства биологических препаратов на основе энтомопатогенных нематод исключает использование в процессе производства дорогостоящих материалов (нержавеющая сталь) и автоклавов с большим объемом камер для стерилизации пустых емкостей и емкостей с питательной средой. Введение новых блоков существенно повышает производительность линии за счет снижения операций, требующих больших затрат ручного труда, и уменышет площади, занятые под производство, что в целом отражается на снижении себестоимости конечного продукта.

Источники информации

1. Bedding R.A. Large scale production, storage and transport of the insect-parasite nematodes Neoaplectana spp. and Heterorhabditis spp.//Ann. Appl. Biol. 1984. Vol. 104, №1. P.117 - 120.

2. Bedding R.A., Stanfeld M.S., and Cropton G.W. Apparatus and Method for Rearing Nematodes, Fungi, Tissue Cultures and The Like, and For Harvesting Nematodes. International Patent Application No PCT/AU91/00136. 1991, 48 pp.

3. Данилов Л.Г., Айрапетян В.Г., Салятов Л.Ю. Способ получения биомассы энтомопатогенных нематод. Патент №2168863. Бюл. 17, 2001.

4. Poinar G.O. The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp.//Nematologica. 1966. Vol. 12, №1. P.31-35.

5. Dye D.W. A taxonomic study of the genus Eerwinia.The amylovora group //N.Z.J.Sci. 1968. Vol. 11, №4. Р. 590-607.

6. Akhurst R.J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp. bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes Neoaplectana and Heterorhabditis // J. Gen. Microbial. 1980. Vol. 121, №2. P.303-309.

7. Han R., Wouts W.M. Development of Heterorhabditis spp. strains as characteristics of possible Xenorhabdus luminescens subspecies // Rev. Nematol. 1990. Vol. 13. P. 411-415.

8..Bedding R. A. Low cost in vitro mass production of Neoaplectana and Het erorhabditis species (Nematode) for field control of insect pests // Nematologica. 1981. Vol. 27, №1. P.109 - 114.

9. Wouts W.M. Mass production of the entomogenous Heterorhabditis heliothidis (Nematoda: Heterorhabditidae) on artificial media // Nematol. 1981. Vol. 13, №4. P. 467-469.

10. Веремчук Г.В., Данилов Л.Г. Методические указания по определению инвазионной активности нематодных культур рода Neoaplectana (Steinernematidae). Л., 1978,7 стр.

11. Данилов Л.Г., Сычев А.Е., Айрапетян В.Г., Сычев В.А. Линия для производства препарата из энтомопатогенных нематод. Патент №2136745. Бюл. 25, 1999.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам и линиям для производства биологических препаратов на основе энтомопатогенных нематод, применяемых в качестве биологических препаратов в борьбе с насекомыми-вредителями. Способ заключается в том, что автоклавирование питательной среды проводят в отдельной емкости, в которую затем инокулируют симбиотические бактерии, а после их размножения питательную среду переносят в другую емкость с одновременной инокуляцией в эту же емкость моноксенной культуры нематод. Линия для производства биологических препаратов на основе энтомопатогенных нематод, отличается тем, что биореактор состоит из двух блоков: биореактор для предварительного размножения симбиотических бактерий, выполненный в виде полипропиленового мешка, и биореактор для выращивания нематодно-бактериального комплекса, выполненный в виде пластмассового корыта с крышкой из фольги с отверстиями; дополнительно введены блок стерилизации пластмассовых корыт, выполненный с использованием открытого огня, и блок отделения нематод от инертного носителя, выполненный с использованием типовой стиральной машины. Такое выполнение биореактора позволяет создавать оптимальные условия для проявления жизнедеятельности нематод и их симбиотических бактерий, что обеспечивает увеличение стабильного выхода биомассы нематод с единицы массы питательной среды. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл.

1. Способ для производства биологических препаратов на основе энтомопатогенных нематод, включающий пропитку инертного носителя гомогенатом компонентов питательной среды, автоклавирование, охлаждение и инокуляцию симбиотических бактерий и моноксенной культуры нематод в питательную среду, отличающийся тем, что автоклавирование питательной среды проводят в отдельной емкости, в которую затем инокулируют симбиотические бактерии, а после завершения их размножения питательную среду с бактериями пересыпают в другую емкость, куда инокулируют и моноксенную культуру нематод.2. Линия для производства биологических препаратов на основе энтомопатогенных нематод, включающая биореактор, мойку, сушилку, установку приготовления искусственной питательной среды на твердом носителе, загрузочное устройство питательной средой биореакторов, устройство стерилизации последних, стерильный блок для инокулирования симбиотических бактерий и нематод в питательную среду, блок их выращивания, отстойник для отделения биомассы нематод от твердого носителя в водной среде, осадительную центрифугу для сгущения суспензии биомассы с получением концентрата биологического препарата и устройство упаковки его в тару, отличающаяся тем, что биореактор выполнен из двух блоков: один - для предварительного размножения симбиотических бактерий, выполненный в виде полипропиленового мешка, снабженного воздушным фильтром, а другой - для выращивания нематодно-бактериального комплекса, выполненный в виде прямоугольного пластмассового корыта и снабженный съемной крышкой из фольги с отверстиями для аэрации питательной среды, для стерилизации пластмассовых корыт имеется блок с использованием открытого огня; в качестве блока для отделения нематод от инертного носителя использована типовая стиральная машина.