СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГИПЕРГИСТАМИНЕМИИ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/53 G01N33/538 

Изобретение относится к области медицины, к биохимическим исследованиям и способам диагностики гипергистаминемии.

Определение гистамина находит широкое применение при диагностике различных патологических процессов.

Известно, что под влиянием гистамина - биогенного амина, участвующего в нейрогуморальной регуляции тонуса кровеносных сосудов и органов с гладкой мускулатурой, резко повышается проницаемость стенки сосудов, активизируется секреция пищеварительных и деятельность экскреторных желез, происходит спазм гладкомышечных клеток, разрастание соединительной ткани в паренхиматозных органах - фиброз легких, печени и т.д. Наступает аллергизация организма человека.

К высвобождению большого количества гистамина в крови ведут такие факторы, как гипоксия, травма, эмоциональное напряжение, рентгеновское и др. излучения.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является метод определения содержания гистамина в цельной крови (модификация Мещеряковой С. А.) (Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. - Минск: Изд-во "Беларусь", 2000, том 2, с. 442-444).

Принцип известного метода основан на экстрагировании гистамина из крови хлорной кислотой, очищении от примесей путем экстракции смесью бутанола и хлороформа, переведении в водную фазу, с которой осуществляют реакцию орто-фтальальдегидным реактивом.

Конденсат стабилизируют фосфорной кислотой и флюориметрируют, по интенсивности люминесценции количественно оценивают концентрацию гистамина.

Недостатком известного способа определения содержания гистамина является то, что в качестве биологического материала, который берется у людей при определении гистамина, используют кровь, забор которой из вены является травматичным для человека, имеет место повреждение кровеносного сосуда, иногда с последующими нарушениями кровообращения, занесением инфекции в кровь. Эти обстоятельства, а также болевые ощущения и отрицательные эмоции часто служат причиной отказа больных от обследования, тем более в тех случаях, когда необходимо проведение серии анализов с короткими интервалами времени.

Кроме того, при заборе крови человека из вены требуется специально подготовленное помещение с обученным медицинским персоналом, стерильные инструменты и одноразовые шприцы, а также такое дорогостоящее оборудование, как флюориметры, для определения концентрации гистамина.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является повышение эффективности способа диагностики за счет упрощения и удешевления процесса обнаружения гистамина, и как следствие, диагностирование гипергистаминемии.

Поставленный технический результат достигается тем, что в способе диагностики гипергистаминемии, основанном на заборе биологического материала и определении в нем концентрации гистамина, - в качестве биологического материала для забора используют слюну человека, в которой изменение концентрации гистамина имеет положительную корреляционную связь с изменением концентрации гистамина в крови, в центрифужные пробирки, содержащие 4 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, вносят 1 мл слюны, экстрагируют, к 4 мл экстракта добавляют 0,1 мл 57%-ной хлорной кислоты, 5 мл эфира, производят трехкратные отсасывание эфира, приливание эфира и встряхивание, далее к пробам прибавляют 2 г карбоната калия и 5 мл бутанола, после центрифугирования производят отсасывание 4 мл органической фазы и пропускание через хроматографическую колонку с диаметром 3 мм и высотой 10 мм и с помещенной в нее ионообменной смолой, далее к элюату приливают 0,5 мл 4%-ного нитрита натрия, а после нагрева и последующего охлаждения элюата добавляют 0,5 мл диазореактива, 1 мл карбоната натрия и 0,15 мл 5 н. гидроксида натрия, затем колориметрическим методом измеряют оптическую плотность и по калибровочной кривой определяют концентрацию гистамина, повышенная концентрация которого свидетельствует о гипергистаминемии.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве биологического материала используют слюну человека, перед забором пробы которой обследуемый промывает ротовую полость кипяченой водой.

В центрифужные пробирки, содержащие 4 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, вносят 1 мл слюны, тщательно перемешивают, оставляют на 30 мин для экстракции, а при необходимости можно оставить в холодильнике на 1-2 суток. Затем перемешивают и центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. При необходимости материал можно хранить в замороженном состоянии. При этом потери исследуемого вещества при хранении в течение одного месяца не превышают 3-5%.

Далее к 4 мл экстракта добавляют 0,1 мл 57%-ной хлорной кислоты, 5 мл эфира и встряхивают 1 мин. Эфир отсасывают, приливают еще 5 мл эфира, снова встряхивают. Такое промывание повторяют 3 раза. Затем к пробам прибавляют 2 г карбоната калия и 5 мл бутанола, встряхивают 3 мин. После этого пробы центрифугируют 3 мин при 3000 об/мин, отсасывают 4 мл органической фазы и прпускают через хроматографическую колонку с диаметром 3 мм и высотой 10 мм и с помещенной в нее ионообменной смолой. Колонку промывают 1 мл этилового спирта, 3 мл воды и элюируют гистамин 2 мл 0,2 н. соляной кислоты. Для восстановления работоспособности колонку промывают 10 мл 1 н. соляной кислоты, затем 10 мл воды. Хранить ионообменную смолу следует в воде.

К экстракту приливают 0,5 мл 4%-ного нитрита натрия, перемешивают и помещают в кипящую водяную баню на 2 минуты. Затем охлаждают в воде со льдом и добавляют 0,5 мл диазореактива, получаемого при смешивании 10 мл 0,1%-ного раствора пара-нитроанилина в 0,1 н. соляной кислоте с 1 мл 4%-ного нитрита натрия, 1 мл карбоната натрия и 0,15 мл гидроксида натрия, перемешивая после прибавления каждого реактива.

Измерение оптической плотности производят на фотоколориметре при длине волны 540 нм в кюветах шириной 10 мм.

По определенной оптической плотности и калибровочной кривой определяют концентрацию гистамина, повышенная концентрация которого свидетельствует о гипергистаминемии.

Колориметрический метод определения концентрации гистамина в предлагаемом способе не требует дорогостоящей аппаратуры, но он недостаточно специфичен (Климкина Н.В., Плитман С.И. Колориметрический метод определения гистамина в крови и органах лабораторных животных. В сб.: Биохимические исследования в гигиене. - М., 1973, с. 68-72).

Для повышения специфичности часто применяют различные варианты экстракции органическими растворителями. Но и в этом случае колориметрический метод по специфичности уступает флуоресцентному. Для повышения специфичности заявителями использована колоночная ионообменная хроматография в сочетании с экстракцией бутанолом в щелочной среде при высокой концентрации солей в растворе.

Известно применение хроматографических методов при определении гистамина. При этом изготовление янтарнокислой целлюлозы по известному методу трудоемко (Мещерякова С.А., Герасимова Ц.И. Флуориметрический метод определения гистамина и серотонина в одной пробе. Лабораторное дело, 1974, 11, с.670-672).

Заявителями предложено использование выпускаемой промышленностью ионообменной смолы. В результате проведенных заявителями исследований было установлено, что наиболее оптимальными характеристиками для выделения гистамина из слюны обладают слабые катиониты - ионообменные смолы КБ-4 и КБ-4П-2, Bio Rex-70.

При экстракции предложенная авторами в прототипе смесь солей со щелочью заявителями заменена на безводный карбонат калия. Как показали исследования, проведенные нами, именно эта соль способствует максимальной экстракции гистамина и минимальной экстракции мешающих его определению примесей при предложенном нами способе экстракции и хроматографии с учетом специфики используемого биологического материала - слюны.

Заявителями подобраны диаметр хроматографической колонки 3 мм, высота 10 мм, скорость движения элюирующего раствора 0,5 мл в минуту. В качестве элюирующего раствора предложена 0,2 н. соляная кислота.

Из всех известных способов осаждения белков в слюне оказался наиболее эффективным способ с помощью 10%-ой трихлоруксусной кислоты. При этом заявителями установлено, что соли трихлоруксусной кислоты частично экстрагируются в бутанол и препятствуют адсорбции гистамина на ионообменной смоле.

Поэтому заявителями было предложено удалить трихлоруксусную кислоту путем экстракции с помощью диэтилового эфира из кислой среды, которая создается с помощью хлорной кислоты. Поскольку, как было установлено заявителями, хлорная кислота (точнее перхлорат-анион) также мешает адсорбции гистамина на ионообменной смоле, было предложено осадить ее добавлением карбоната калия. Эта соль выполняет две функции: создает высокую концентрацию солей и оптимальную величину рН для экстракции гистамина в бутанол и осаждает перхлорат калия.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявляемого изобретения, позволили установить, что заявитель не обнаружил аналог, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам заявляемого изобретения.

Определение из перечня аналогов наиболее близкого технического решения (прототипа) позволило выявить совокупность существенных по отношению к усматриваемому техническому результату отличительных признаков в заявляемом способе диагностики гипергистаминемии, изложенных в формуле изобретения.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию "новизна".

Для проверки соответствия заявляемого изобретения критерию "изобретательский уровень" заявителем проведен дополнительный поиск известных решений, чтобы выявить признаки, совпадающие с отличительными от прототипа признаками заявляемого способа диагностики гипергистаминемии.

Результаты поиска показали, что заявляемое изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, определенного заявителем.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию "изобретательский уровень".

Критерий изобретения "промышленная применимость" подтверждается тем, что предлагаемый способ диагностики гипергистаминемии может быть успешно, с большой эффективностью использован в медицинских учреждениях России и СНГ.

Изобретение относится к области медицины, а именно к биохимическим исследованиям, и может быть использовано для диагностики гипергистаминемии. Сущность способа состоит в том, что в качестве биологического материала используют слюну человека, в центрифужные пробирки, содержащие 4 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, вносят 1 мл слюны, экстрагируют, к 4 мл экстракта добавляют 0,1 мл 57%-ной хлорной кислоты, 5 мл эфира, трехкратно удаляют эфир, приливают эфир и встряхивают, далее к пробам прибавляют 2 г карбоната калия и 5 мл бутанола, после центрифугирования удаляют 4 мл органической фазы и пропускают через хроматографическую колонку с диаметром 3 мм и высотой 10 мм и с помещенной в нее ионообменной смолой, элюируют 2 мл 0,2 н. соляной кислоты, далее к элюату приливают 0,5 мл 4%-ного нитрита натрия, а после нагрева и последующего охлаждения элюата добавляют 0,5 мл диазореактива, 1 мл карбоната натрия и 0,15 мл 5 н. гидроксида натрия, затем колориметрическим методом измеряют оптическую плотность и по калибровочной кривой определяют концентрацию гистамина. Техническим результатом является повышение эффективности способа диагностики гипергистаминемии.

Способ диагностики гипергистаминемии, основанный на заборе биологического материала и определении в нем концентрации гистамина, отличающийся тем, что в качестве биологического материала для забора используют слюну человека, в которой изменение концентрации гистамина имеет положительную корреляционную связь с изменением концентрации гистамина в крови, в центрифужные пробирки, содержащие 4 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, вносят 1 мл слюны, экстрагируют, к 4 мл экстракта добавляют 0,1 мл 57%-ной хлорной кислоты, 5 мл эфира, производят трехкратные отсасывание эфира, приливание эфира и встряхивание, далее к пробам прибавляют 2 г карбоната калия и 5 мл бутанола, после центрифугирования производят отсасывание 4 мл органической фазы и пропускание через хроматографическую колонку с диаметром 3 мм и высотой 10 мм и с помещенной в нее ионообменной смолой, элюируют 2 мл 0,2 н. соляной кислоты, далее к элюату приливают 0,5 мл 4%-ного нитрита натрия, а после нагрева и последующего охлаждения элюата добавляют 0,5 мл диазореактива, 1 мл карбоната натрия и 0,15 мл 5 н. гидроксида натрия, затем колориметрическим методом измеряют оптическую плотность и по калибровочной кривой определяют концентрацию гистамина, повышенная концентрация которого свидетельствует о гипергистаминемии.