СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АДРЕНАЛИНА, НОРАДРЕНАЛИНА, ДОФАМИНА И ДИОКСИФЕНИЛАЛАНИНА В ОДНОЙ ПОРЦИИ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА Российский патент 2001 года по МПК G01N33/52 G01N33/483 G01N33/74 

Изобретение относится к области медицины и биохимии, а именно к способам определения концентрации адреналина, норадреналина, дофамина и диоксифенилаланина (ДОФА) в биологическом материале: в крови и в моче.

Определение концентрации катехоламинов и диоксифенилаланина в моче, крови и тканях используется при диагностике ряда заболеваний.

Известен способ определения концентрации катехоламинов из мочи, доведенной до pH 8,2 - 8,5, путем колоночной хроматографии с применением в качестве адсорбента окиси алюминия, элюируются 0,25 н. раствором уксусной кислоты, дифференцируются окислением иодом при разных значениях pH (4,6 и 7,2). Интенсивность флюоресценции регистрируют на флюориметре (Колб В.Г., Камышников B.C. Справочник по клинической химии. Минск: Беларусь, 1982, с. 316-321).

В этом способе определения катехоламинов после консервации мочи в объем 25 мл мочи добавляют 0,5 г этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА) и доводят pH до 8,2 - 8,5 с помощью 1 н. раствора гидроксида натрия.

В способе нейтрализацию проводят гидроксидом натрия, в случае возможной случайной его передозировки произойдет сильное ощелачевание среды и, как следствие этого, произойдет окисление катехоламинов, что приведет к невозможности их определения. Этот способ окажется неэффективным при определении катехоламинов из мочи новорожденных детей, забор мочи для исследования у которых очень мал.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ определения адреналина, норадреналина, дофамина и диоксифенилаланина (ДОФА) в одной порции мочи (Колб В.Г., Камышников B.C. Справочник по клинической химии. Минск: Беларусь, 1982, с.321-326).

Известный способ является наиболее чувствительным и специфическим методом определения этих веществ.

Катехоламины и ДОФА в этом способе выделяют из мочи колоночной хроматографией на окиси алюминия, элюируют с адсорбента 10 мл и окисляют для превращения в флюоресцирующие соединения. Элюат в известном способе разливают по 2 мл в 3 пробирки, а для дофамина - еще в 2 пробирки.

Недостатком известного способа является его трудоемкость, т.к. для каждого из исследуемых веществ реакция ставится отдельно: окисление и дальнейшее превращение во флюоресцирующие соединения, а также невозможность выполнения анализа, если в распоряжении исследователя имеется малое количество биологического материала: мочи или крови.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является повышение чувствительности, снижение трудоемкости осуществления способа за счет выполнения всего анализа в одной пробирке с биологическим материалом с малым объемом пробы, путем одновременного элюирования адреналина, норадреналина, дофамина и ДОФА и одновременного их окисления.

Поставленный технический результат достигается тем, что в способе определения концентрации адреналина, норадреналина, дофамина и диоксифенилаланина в одной пробе биологического материала, основанном на выделении их из биологического материала путем адсорбции на окиси алюминия, элюировании и окислении с последующим определением концентрации этих веществ по интенсивностям флуоресценции, в способе количество биологического материала выбирают равным 0,4 мл и к его кислотному экстракту добавляют равный объем 5%-ного раствора этилендиаминтетраацетата натрия, доводят pH раствора до 8,2-8,5 0,1%-ным раствором аммиака, а отношение высоты h хроматографической колонки, куда помещают полученный раствор, к ее диаметру d выбирают равным 1, затем исследуемые вещества элюируют с адсорбента 1 мл 0,25 н. раствора уксусной кислоты, этот объем делят на две равные части, опытную 0,5 мл пробу и контрольную 0,5 мл пробу; при этом к 0,5 мл элюата добавляют 0,15 мл 5% этилендиаминтетраацетата натрия и 0,12 мл фосфата натрия трехзамещенного 0,33 М до pH 6,0 - 6,5, окисление адреналина, норадреналина, дофамина и диоксифенилаланина производят 0,1 мл 0,1 н. раствором йода в течение 10 мин, далее нейтрализацию раствора осуществляют приливанием 0,1 мл щелочного сульфита с последующим добавлением 0,05 мл 5 н. уксусной кислоты, после этого помещают раствор в кипящую водяную баню на 5 минут, затем охлаждают и после помещения раствора в кювету флюориметра измеряют интенсивности флюоресценции контрольной и опытной проб при длинах волн возбуждения λ, равных 313 нм, 313 нм, 365 нм, 436 нм, и длинах волн флюоресценции , равных соответственно 365 нм, 405 нм, 510 нм, 510 нм, после чего сравнивают интенсивности E флюоресценции контрольной пробы стандартного раствора исследуемых веществ при вышеуказанных длинах волн возбуждения и флюоресценции с интенсивностями флюоресценции опытной пробы стандартного раствора этих веществ, а определяя количество в исследуемом количестве крови (в мкг) адреналина С_А, норадреналина С_Н, дофамина С_ДА и диоксифенилаланина С_Д по формулам

где ΔE₁ - разность интенсивностей флюоресценции опытной пробы и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 313 нм и λ_Ф= 365 нм;
Δ E_Д1 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора диоксифенилаланина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 313 нм и λ_Ф= 365 нм;

где Δ E₂ - разность интенсивностей флюоресценции опытной пробы и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 313 нм и λ_Ф= 405 нм;
Δ E_Д2 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора диоксифенилаланина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 313 нм и λ_Ф= 405 нм;
Δ E_ДА2 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора дофамина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 313 нм и λ_Ф= 405 нм;

где Δ E₃ - разность интенсивностей флюоресценции опытной пробы и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 365 нм и λ_Ф=510 нм;
Δ E₄ - разность интенсивностей флюоресценции опытной и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 436 нм и λ_Ф=510 нм;
Δ E_ДА3 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора дофамина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 365 нм и λ_Ф=510 нм;
Δ E_ДА4 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора дофамина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 436 нм и λ_Ф=510 нм;
Δ E_Н3 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора норадреналина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 365 нм и λ_Ф=510 нм;
ΔЕ_Н4 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора норадреналина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 436 нм и λ_Ф=510 нм;

где Δ E_Д4 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора адреналина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 436 нм и λ_Ф=510 нм.
Способ осуществляют следующим образом.

К 0,5 мл крови, находящимся в пробирке или мерном цилиндре, добавляют 1 мл 10% трихлоруксусной кислоты, а в случае исследования мочи (в количестве 0,5 мл), добавляют в пробирку 0,5 мл 10%-ной серной кислоты.

Для крови: в пробирке смесь перемешивают тщательно, оставляют на 30 минут для экстракции и центрифугируют.

К исследуемому экстракту биологического материала: мочи или крови для выделения адреналина, норадреналина, дофамина и ДОФА добавляют в пробирку равный объем 5% раствора этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА), далее доводят pH раствора до 8,2-8,5 0,1%-ным раствором аммиака.

Затем раствор помещают в хроматографическую колонку, содержащую окись алюминия.

При этом отношение высоты h хроматографической колонки к ее диаметру d выбирают равным 1 (в нашем случае h=5 мм, d=5 мм).

Такой выбор параметров хроматографической колонки h/d=1 обеспечивает возможность элюирования всех 4-х исследуемых веществ: адреналина, норадреналина, дофамина и ДОФА малым объемом, а также отпадает необходимость в использовании вакуума, что существенно ускоряет проведение способа.

Затем исследуемые вещества элюируют с адсорбента 1 мл 0,25 н. раствора уксусной кислоты. Этот объем делят на две равные части: 0,5 - опытная проба, 0,5 - контрольная проба.

К 0,5 мл элюата добавляют 0,15 мл 5% ЭДТА и 0,12 мл фосфата натрия трехзамещенного 0,33 М до pH 6- 6,5, окисление катехоламинов производят 0,1 мл 0,1 н. раствора йода в течение 10 минут.

Через 10 мин йод нейтрализуют приливанием 0,1 мл щелочного сульфита (500 мл сульфита натрия безводного, 2 мл воды и 18 мл 5 н. NaOH) и далее добавляют 0,05 мл 5 н. уксусной кислоты.

Раствор помещают в кипящую водяную баню на 5 минут, затем охлаждают в воде, после чего раствор помещают в кювету флюориметра (например, типа БИАН - 130), где измеряют интенсивности флюоресценции контрольной и опытной проб, далее определяют:
1. Разность интенсивности Δ E₁ флюоресценции контрольной пробы и опытной пробы при длине волны возбуждения λ_В= 313 нм и при длине волны флюоресценции λ_Ф= 365 нм;
2. Разность интенсивностей Δ E₂ флюоресценции опытной и контрольной пробы при длине волны возбуждения λ_В= 313 нм и при длине волны флюоресценции
3. Разность интенсивностей Δ E₃ флюоресценции опытной и контрольной пробы при длине волны возбуждение λ_В= 365 нм и при длине волны флюоресценции λ_Ф= 510 нм;
4. Разность интенсивностей Δ E₄ флюоресценции опытной и контрольной пробы при длине волны возбуждения λ_В= 436 нм и при длине волны флюоресценции λ_ф= 510 нм.
После этого определяют количество в опытном количестве крови (в мкг) адреналина С_А, норадреналина С_Н, дофамина С_ДА и диоксифенилаланина С_Д по формулам

где Δ E₁ - разность интенсивностей флюоресценции опытной пробы и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 313 нм и λ_Ф= 365 нм;
Δ E_Д1 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора диоксифенилаланина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 313 нм и λ_ф= 365 нм;

где Δ E₂ - разность интенсивностей флюоресценции опытной пробы и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 313 нм и λ_ф= 405 нм;
Δ E_Д2 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора диоксифенилаланина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 313 нм и λ_ф= 405 нм;
Δ E_ДА2 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора дофамина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 313 нм и λ_ф= 405 нм;

где Δ E₃ - разность интенсивностей флюоресценции опытной пробы и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 365 нм и λ_ф= 510 нм;
Δ E₄ - разность интенсивностей флюоресценции опытной пробы и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 436 нм и λ_ф= 510 нм;
Δ E_ДА3 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора дофамина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 365 нм и λ_ф= 510 нм;
Δ E_ДА4 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора дофамина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 436 нм и λ_ф= 510 нм;
Δ E_Н3 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора норадреналина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 365 нм и λ_ф= 510 нм;
Δ E_Н4 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора норадреналина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 436 нм и λ_ф= 510 нм;

где Δ E_Д4 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора адреналина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_в= 436 нм и λ_ф= 510 нм.
Предлагаемый способ имеет существенные преимущества по сравнению с прототипом:
Производят элюирование одновременно всех 4 веществ: адреналина, норадреналина, дофамина и диоксифенилаланина (ДОФА) в одной пробе биологического вещества (мочи или крови);
Производят одновременное окисление вышеуказанных веществ:
выбирают отношение высоты h хроматографической колонки к ее диаметру d, т.е. h/d, равным 1, что приводит к использованию меньшего объема элюата, увеличению соотношения флюоресценции опытной пробы исследуемого биологического материала к стандартной, контрольной пробе.

Как следствие этого, повышается чувствительность предлагаемого способа.

А меньший в количественном отношении забор крови или мочи позволяет расширить возрастной диапазон пациентов от новорожденных детей до взрослых людей.

В настоящее время у существующих способов определения концентрации адреналина, норадреналина, дофамина и диоксифенилаланина объем забора крови производится у пациента в 5- 10 раз больше, чем у предлагаемого изобретения.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявляемого изобретения, позволили установить, что заявители не обнаружили аналог, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам заявляемого изобретения.

Определение из перечня выявленных аналогов прототипа позволило выявить совокупность существенных по отношению к усматриваемому техническому результату отличительных признаков в заявляемом способе определения концентрации адреналина, норадреналина, дофамина и диоксифенилаланина в одной порции биологического материала, изложенных в формуле изобретения.

Следовательно, заявление соответствует критерию "новизна".

Для проверки соответствия заявляемого изобретения условию "изобретательский уровень" заявители провели дополнительный поиск известных решений, чтобы выявить признаки, совпадающие с отличительными от прототипа признаками заявляемого изобретения.

Результаты поиска показали, что заявляемое изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, определенного заявителями, не выявлено влияния предусматриваемых существенными признаками заявляемого изобретения преобразований на достижение технического результата.

Следовательно, заявляемое изобретение "Способ определения концентрации адреналина, норадреналина, дофамина и диоксифенилаланина в одной порции биологического материала" соответствует критерию "изобретательский уровень".

Критерий "промышленная применимость" подтверждается тем, что предлагаемое изобретение может быть успешно использовано в медицинских учреждениях, лабораториях при диагностике различных заболеваний у взрослых людей и детей.

Изобретение относится к области медицины и биохимии, а именно к способам определения концентрации адреналина, норадреналина, дофамина и диоксифенилаланина (ДОФА) в биологическом материале: в крови и в моче. Способ обеспечивает повышение чувствительности и снижение трудоемкости исследования. Выделяют адреналин, норадреналин, дофамин и диоксифенилаланин из биологического материала путем адсорбции на окиси алюминия, элюирования и окисления с последующим определением концентрации этих веществ по интенсивностям флюоресценции. Количество биологического материала выбирают равным 0,4 мл и к его кислотному экстракту добавляют равный объем 5%-ного раствора этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА), доводят pH раствора до 8,2 - 8,5 0,1%-ным раствором аммиака, далее раствор помещают в хроматографическую колонку с окисью алюминия, при этом отношение ее высоты h к ее диаметру d выбирают равным 1, элюируют с адсорбентом 1 мл 0,25 н. раствора уксусной кислоты, этот объем раствора делят опытную 0,5 мл и контрольную 0,5 мл пробы, далее к 0,5 мл элюанта добавляют 0,15 мл этилендиаминтетраацетата натрия и 0,12 мл фосфата натрия трехзамещенного 0,33 М до pH 6,0 - 6,5, окисление адреналина, норадреналина, дофамина и диоксифенилаланина производят 0,1 мл 0,1 н. раствора иода в течение 10 мин, далее раствор нейтрализуют 0,1 мл щелочного сульфита с последующим добавлением 0,05 мл 5 н. уксусной кислоты, после чего помещают раствор в кипящую водяную баню на 5 мин, затем охлаждают и измеряют интенсивности флюоресценции контрольной и опытной проб при длинах волн возбуждения λ_В, равных 313 нм, 313 нм, 365 нм, 436 нм, и длинах волн флюоресценции λ_Ф, 365 нм, 405 нм, 510 нм, 510 нм соответственно, затем сравнивают интенсивности флюоресценции контрольной пробы стандартного раствора исследуемых веществ при вышеуказанных длинах волн возбуждения и флюоресценции с интенсивностями флюоресценции опытной пробы стандартного раствора этих веществ. 4 з.п. ф-лы.

1. Способ определения концентрации адреналина, норадреналина, дофамина и диоксифенилаланина в одной порции биологического материала, включающий выделение их из биологического материала путем адсорбции на окиси алюминия, элюировании и окислении с последующим определением концентрации этих веществ по интенсивности флюоресценции, отличающийся тем, что количество биологического материала выбирают равным 0,4 мл и к его кислотному экстракту добавляют равный объем 5 %-ного этилендиаминтетраацетата натрия, доводят pH раствора до 8,2 - 8,5 0,1 %-ным раствором аммиака, при адсорбции раствора в хроматографической колонке с окисью алюминия выбирают отношение ее высоты h к ее диаметру d равным единице, затем исследуемые вещества элюируют с адсорбента 1 мл 0,25 н раствора уксусной кислоты, делят этот объем раствора по 0,5 мл на опытную и контрольную пробы, далее к 0,5 мл элюата добавляют 0,15 мл 5% этилендиаминтетраацетата натрия и 0,12 мл фосфата натрия трехзамещенного 0,33 М до pH 6,0 - 6,5, окисление адреналина, норадреналина, дофамина и диоксифенилаланина производят 0,1 мл 0,1 н раствора иода в течение 10 мин, после чего раствор нейтрализуют 0,1 мл щелочного сульфита с последующим добавлением 0,05 мл 5 н уксусной кислоты и помещением его в кипящую водяную баню на 5 мин, охлаждают его, производят измерение интенсивностей флюоресценции контрольной и опытной проб при длинах волн возбуждения λ_В и флюоресценции λ_Ф, сравнивают интенсивности флюоресценции контрольной пробы стандартного раствора исследуемых веществ с интенсивностями флюоресценции соответственно опытной пробы стандартного раствора этих веществ в тех же условиях. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что определяют количество диоксифенилаланина C_Д при λ_В, равной 313 нм, и λ_Ф, равной 365 нм, по формуле C_Д = ΔE₁/ΔE_Д1, где ΔE₁ - разность интенсивностей флюоресценции опытной пробы и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_В = 313 нм и λ_Ф = 365 нм; ΔE_Д1 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора диоксифенилаланина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_В = 313 нм и λ_Ф = 365 нм.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что определяют количество дофамина C_ДА при λ_В, равной 313 нм, и λ_Ф, равной 405 нм, по формуле C_ДА = ΔE₂-ΔE_Д2×C_Д/ΔE_ДА2, где ΔE_Д2 - разность интенсивностей флюоресценции опытной пробы и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_В = 313 нм и λ_Ф = 405 нм; ΔE_Д2 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора диоксифенилаланина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_В = 313 нм и λ_Ф = 405 нм; ΔE_ДА2 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора дофамина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_В = 313 нм и λ_Ф = 405 нм.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что определяют количество норадреналина при λ_В, равной 365 нм, и λ_Ф, равной 510 нм, по формуле C_Н = ΔE₃-ΔE₄-C_ДА(ΔE_ДА3-ΔE_ДА4)/ΔE_Н3-ΔE_Н4, где ΔE₃ - разность интенсивностей флюоресценции опытной пробы и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_В = 365 нм и λ_Ф = 510 нм; ΔE₄ - разность интенсивностей флюоресценции опытной пробы и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_В = 436 нм и λ_Ф = 510 нм; ΔE_ДА3 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора дофамина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_В = 365 нм и λ_Ф = 510 нм; ΔE_ДА4 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора дофамина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_В = 436 нм и λ_Ф = 510 нм; ΔE_Н3 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора норадреналина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_В = 365 нм и λ_Ф = 510 нм.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что определяют количество адреналина C_А при λ_В, равной 436 нм, и λ_Ф, равной 510 нм, по формуле C_А = ΔE₄-ΔE_ДА4×C_ДА-ΔE_Н4×C_Н/ΔE_А4, где ΔE_ЕА4 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора адреналина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_В = 436 нм и λ_Ф = 510 нм дофамина; ΔE_Н4 - разность интенсивностей флюоресценции стандартного раствора норадреналина и соответствующей контрольной пробы при длинах волн λ_В - 436 нм и λ_Ф - 510 нм.