СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСПЛАНТАТОВ ДЛЯ ЗАПОЛНЕНИЯ КОСТНЫХ ДЕФЕКТОВ ПРИ ХИРУРГИЧЕСКОМ ЛЕЧЕНИИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПАРОДОНТА Российский патент 2003 года по МПК A61F2/28 A61K6/00 A61K35/42 A61K33/42 A61K38/39 C12N5/08 

Изобретение относится к способам изготовления трансплантатов с использованием культуры фибробластов человека и может быть использовано в стоматологии для заполнения дефектов при хирургическом лечении воспалительных заболеваний пародонта.

Проблема заболеваний пародонта в настоящее время приобрела особое значение, так как по данным ВОЗ пародонтитом страдает более 95% населения старше 40 лет. Новое направление в хирургической пародонтологии связано с использованием культур клеток гомологического костного мозга, аутологичной тромбоцитарной массы и искусственно синтезированных факторов роста, влияющих на пролиферацию и дифференцировку клеток пародонта.

К числу наиболее эффективных тканевых трансплантатов, используемых при хирургическом лечении заболеваний пародонта, относятся препараты фирмы "Geistlich" (Bio-Oss, Bio-Gide, Resor Pin).

Перед применением гранулы Bio-Oss смачивают физиологическим раствором, либо кровью из раневой поверхности, либо взвесью фибробластов человека (ж. "Новое в стоматологии", 8, 2001, с.72-77).

Известно применение культуры аллофибробластов в комплексном лечении заболеваний пародонта.

Культура аллофибробластов заселяется на твердую мозговую оболочку.

На первом этапе получают культуру фибробластов человека путем фрагментации и ферментной обработки дермы плодов человека. После получения первичной культуры фибробластов изготавливают трансплантаты путем культивирования клеток фибробластов на подсадочных материалах ("Наука практике". Материалы научной сессии ЦНИИС. М., 1998, с.164-166) прототип.

Исследована активность фибробластов, культивируемых in vitro с различными видами подсадочных материалов (ж. "Цитология"), 9, т.43. 2001 г., с. 854). Подсадочный материал (рассмотрены такие материалы: Гапкол, Гапкол Л, Гапкол ЛМ, Колапол КП-2, Колапол КП-2Л, Гидрокиапол ГАП-85д, Коллапан АН-Г, Коллапан Ан-Д, Коллапан Ан-К, Коллапан Ан-Л, Коллапан Ан). Материал помещают в стерильный пенициллиновый флакон, туда же вносят суспензию культивируемых фибробластов человека М-22 в концентрации 140•10³-180•10³ клеток в 1 мл. На материалах начинает формироваться клеточный монослой, причем клетки культивируют в среде ИГЛА-МЕМ с добавлением сыворотки крупного рогатого скота.

Трансплантаты, полученные известными способами с использованием культуры фибробластов человека при хирургическом лечении пародонтитов, эффективны, так как клеточная культура стимулирует раннее заживление, снижает выраженность постоперационной ретракции десны и обуславливает увеличение периода ремиссии.

Однако формирование монослоя клеток не во всех случаях происходит однозначно, что по-видимому, связано с качеством используемых фибробластов и субстратов. Вместе с тем выбор оптимальных сочетаний фибробласты - субстрат необходим для обеспечения стандартных условий получения клеточных трансплантатов для эффективного лечения пародонтитов.

Технической задачей изобретения является повышение лечебного эффекта и устранение побочных эффектов при хирургическом лечении воспалительных заболеваний пародонта путем заполнения костных дефектов клеточным трансплантатом.

Для решения поставленной задачи предлагается способ получения трансплантатов для лечения воспалительных заболеваний пародонта, включающий субкультивирование фибробластов на подсадочных материалах, отличающийся тем, что остеопластический подсадочный материал замачивают на 24 часа в растворе антисептика, после чего раствор антисептика сливают, остеопластический материал замачивают в среде ИГЛА на 5 часов, а затем отмывают свежими порциями среды ИГЛА три раза по 10 минут каждый раз, отмытый остеопластический материал помещают в стерильный культуральный сосуд, подготавливают взвесь клеток фибробластов из расчета 60000-80000 клеток на 1 мл среды роста, в качестве среды роста используют среду ИГЛА-MEM с добавлением 10% сыворотки крови плодов крупного рогатого скота, рН среды роста 7,2-7,4; подготовленную взвесь клеток фибробластов помещают в стерильный сосуд с остеопластическим материалом, сосуд помещают в термостат при температуре 35-37^oС на 48-72 часа, подготовленный трансплантат хранят при температуре 4-6^oС и используют для заполнения костных дефектов при хирургических операциях в течение 3-4 суток.

В качестве остеопластического материала используют Гапкол или Коллапан.

В качестве антисептического средства используют 0,05%-ный раствор хлоргексидина глюконата или раствор метронидазола из расчета 500 мг на 100 мл раствора.

В качестве культуры фибробластов человека используют штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4(81), зарегистрированный за 88-82 Банк - музеем Свердловского НИИ вирусных инфекций (а.с. СССР 1147748 от 30.03.85).

Использование предлагаемого комбинированного клеточного трансплантата при хирургическом лечении воспалительных заболеваний пародонта позволяет повысить эффективность лечения за счет высокой стимулирующей активности используемого штамма диплоидных клеток ЛЭЧ-4(81), приводящей к быстрому заживлению раневой поверхности, сокращению сроков реабилитации и увеличению периода ремиссии заболевания.

Хлоргексидина биклюконат 0,05%-ный обладает антибактериальным действием; проявляет бактериостатическое и бактерицидное действие по отношению к грамположительным и грамотрицательным микроорганизмам.

Метронидазол представляет собой терапевтический препарат группы нитроимидазола, воздействует на грамотрицательные анаэробные микроорганизмы и спирохеты.

Лечение с использованием культуры аллофибробластов было проведено у 50 больных в возрасте от 35 до 55 лет, страдающих пародонтитом средней и тяжелой степени. Курс предоперационной подготовки включал обучение пациента гигиене полости рта и гигиенический контроль, общую и местную противовоспалительную терапию, лечение кариеса и его осложнений, удаление над- и поддесневых зубных отложений. При наличии супраконтактов и недостаточной стираемости эмалевых бугров проводили функциональное избирательное пришлифовывание по Дженкельсону. Зубы с подвижностью II-III степени (если не было показаний к их удалению) шинировали Составляли план дальнейшего ортопедического лечения. После проведения всего комплекса предварительного лечения и по достижении пациентами стабильно хорошей гигиены полости рта (индекс Грина-Вермильона меньше, либо равен 1) приступали непосредственно к операции. Состояние пародонта оценивали с помощью критериев: клинического (глубина пародонтального кармана и рецессия десны) и рентгенологического (сопоставление ортопантомограмм до и после лечения).

У всех больных, которым применяли хирургическое лечение с использованием комбинированного аллотрансплантата, в сроки до 30 дней уменьшались пародонтальные карманы, исчезал запах изо рта, прекращалась кровоточивость десен, слизистая оболочка приобретала бледно-розовый цвет, т.е. визуализировалась положительная динамика заболевания. При рентгенологическом контроле в сроки от 6 до 12 месяцев определялся прирост костной ткани, уменьшение глубины и ширины пародонтальных костных карманов, что свидетельствует о реминерализации костной ткани. Подвижность зубов II степени исчезала, при подвижности III степени достигала уровня I.

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии. Сущность способа: остеопластический материал Гапкол или Коллапан замачивают на 24 ч в растворе антисептика хлоргексидина глюконата или метронидазола, после чего раствор антисептика сливают, остеопластический материал замачивают на 5 ч в среде ИГЛА, отмывают стерильной средой ИГЛА три раза по 10 мин каждый раз, затем отмытый остеопластический материал помещают в стерильный сосуд, куда вносят взвесь клеток фибробластов из расчета 60 х 10³ - 80 х 10³ кл/мл среды роста. В качестве культуры фибробластов используют штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4(81), в качестве среды роста используют среду ИГЛА-МЕМ с добавлением 10% сыворотки крови плодов крупного рогатого скота из расчета 10% - сыворотка, 90% - ИГЛА-МЕМ, рН среды роста 7,2-7,4. Подготовленную взвесь клеток с остеопластическим материалом помещают в термостат и выдерживают при температуре 35-37^oС 48-72 ч. Трансплантат хранят при температуре 4-6^oС в течение 3-4 суток. Способ обеспечивает получение трансплантата, обладающего высокой эффективностью.

Способ получения трансплантатов для заполнения костных дефектов при хирургическом лечении воспалительных заболеваний пародонта, включающий субкультивирование фибробластов человека на остеопластическом подсадочном материале, отличающийся тем, что остеопластический материал Гапкол или Коллапан замачивают на 24 ч в растворе антисептика хлоргексидина глюконата или метронидазола, после чего раствор антисептика сливают, остеопластический материал замачивают на 5 ч в среде ИГЛА, отмывают стерильной средой ИГЛА три раза по 10 мин каждый раз, затем отмытый остеопластический материал помещают в стерильный сосуд, куда затем вносят взвесь клеток фибробластов из расчета 60 х 10³ - 80 х 10³ клеток на 1 мл среды роста, в качестве культуры фибробластов используют штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4(81), в качестве среды роста используют среду ИГЛА-МЕМ с добавлением 10% сыворотки крови плодов крупного рогатого скота из расчета 10% - сыворотка, 90% - ИГЛА-МЕМ, рН среды роста 7,2-7,4, подготовленную взвесь клеток с остеопластическим материалом помещают в термостат, где выдерживают при температуре 35-37^oС 48-72 ч, подготовленный трансплантат хранят при температуре 4-6^oС в течение 3-4 суток.