Штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4(81),используемый для диагностики вирусных инфекций Советский патент 1985 года по МПК C12N7/00 

4

sl

-U

ЭО Изобретение относится к медицинской, вирусологии, в частности к диаг ностике вирусных инфекций. Известен штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека wi-38 Dj Однако известный штамм получен в США и является труднодоступным для работы,. Цель изобретения - получение отечественного штамма диплоидных клеток легкого эмбриона человека. Цель достигается с помощью штамма ЛЭЧ-4(81). Штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4(81) получен слеяуущам образом. В качестве исходной ткани используют легкое 12-недельного эмбриона человека от здоровой женащны, не име ющей в генеалогии злокачественных И наследственных болезней. Используе мую легочную ткань тщательно отмывают солевым раствором Хенкса с антибиотиками (пенициллин и стрептомицин по 300 мкг/мл) от слизи и сгустков крови, затем измельчают, тем же раст вором Хенкса промывают полученные кусочки и помещают их в колбу для трипсинизации. Щадящую трипсинизацш кусочков проводят 0,25%-ньы раствором трипсина при температуре 18-20 С 6-кратно по 5 мин. Полученную взвесь клеток центрифугируют при 1000 об/ /мин в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в среде роста и вносят из расчета 300-350 тыс/мя при посадке на посевные матрасы и 500-550 тыс/ /МП - на пробирки. Среда роста клеток состоит из смеси равных количес сред 1.99 и Игла с двойной концентра цией аминокислот и витаминов с добав Л«Ш1ем 10%-ной сухой сыворотки молодняка крупного рогатого скота. После формирования монослоя на 45-ё бутки роста клетки снимают со стекла 0,р2%-ш а« раствором версена, подогретого до 35-37 С, и пересеваю в соотношении 1:2. Плотньй монослой фибробластоподобных клеток был сфор мирован на 4-ё сутки. Дпя дгшьнейше го культивирования были отобраны ма расы, содержащие плотный монослой 1слеток, имехицих четкую структуру, светлую цитоплазму клеток. Последую щие пассажи проводят подобным способом. Штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4(81) депонирован под № 88-82 в Банке-музее Свердловского-НИНвирусных инфекций и характеризуется следующими признаками. Штамм легкого.эмбриона человека ЛЭЧ-4(81) имеет ограниченный срок жизни, равный 45 генерациям. Культура клеток до 4-го пассажа состоит из фибробластоподобных клеток с примесью эпителиоподобных, а, начиная с 4-го пассажа, культура представляет собой монослой однородных фибробластоподобных клеток, обладающих ориентированным ростом. Цитоплазма клеток светлая, с легкой зернистостью. Ядра клеток содержат 1-4 ядрышка. Прирост клеток первой фазы роста бьш 1,5-2-кратным, а, начиная с 4-5-го пассажа, - 2,02,5-кратным на 4-5-е сутки роста. Митотиче ;кая активность клеток первьк пассажей составляет 8-10 о/оо, а в последующем (в активной фазе роста) - 20-23 о/оо. По мере пассирования с 25-35-го пассажа увеличивается число клеток с патологическими формами митоза. Кариологический анализ клетой диплоидного штамма ЛЭЧ-4(81) на разных пассажных уровнях показьгоает, что 87% клеток в фазе активного роста сохраняют диплоидный набор хромосом. По мере старения культуры, к 45-му пассажу, увеличивается число клеток с гиподиплоидным набором хромосом, что соответствует естественной изменчивости клеток в третьей фазе роста. Число клеток с аберрациями хромосом в первых двух фазах роста было незначительным и составляло 1- ; 2%; по мере старения клеток число их увеличилось до 4%. Основные хромосомные аберрации .бьши представлены хроматидными разрывами. Клетки свободны от контаминир стцих агентов, не обладают туморогеннвй актив{{остью и на протяжении первых двух фаз стабильно сохраняют свои биологические свойства, присущие штаммам диплоидных клеток. Диплоидный штамм ЛЭЧ-4(81) накоплен в результате пассирования и заложен на хранение в периоде от 4 до 11-го пассажа при температуре жидкого аЗота -19бс в количестве 150 ампул с использованием оптимального режима охлаждения: после выдержки запаянных при +4-6 С в рефрижераторе в тече-ние 1-2 ч клетки охлаадали со ско-ростью 0,5 град./мин от О до 4 град./мин от -20 до -40 С; 10 град./мин от -40 до -80°С. При восстановлении ампулы с клет ками извлекают из сосуда и погружаю в водяную баню при . Содержимое одной ампулы засевают на матрасы об емом 0,25 л, добавляя 30 мп среды роста. Через 24 ч производят смену среды} монослой формировался на 45-е сутки роста. После восстановления.,культуру пассируют обычным спос бон. Штамм диплоидньгх клеток нашел пр менение в работе вирусных инфекций. Клетки штамма ЛЭЧ-4(81) обладают вы сокой чувствительностью к знтеровирусам. Вирусные антигены, приготовленны в культуре ЛЭЧ-4(81), используют в серологических реакциях с антисы воротками, полученными при использо для иммунизации антигена из других клеточных культур, что позво лило снизить неспецифические реакци обусловленных наличием общих ткане вых компонентов реагирукяцих систем При обследовании одной из вспышек максимальное чксло вирусных аге тов составило до 37% на первичнотрипсинизированной культуре ФЭЧ, а на культуре ЛЭЧ-4(81) - всего 18,3% так же как и на перевиваемой линии клеток Л-41. Однако при совпадении спектра выделенных агентов на клетках Л-41 и ФЭЧ было отмечено большее разнообразие агентов на клетках (81). В таблице дана характеристика уровня вьщеляемости вирусов из первичного материала от больных. Анализ данных по вьщеляемости энтеровирусов из материалов, взятых от больных во время ряда отдель ных крупных вспьшек, показывает, что при полном отсутствии цитопато- : генных агентов на перевиваемых клетках RH и НЕр-2, вьщеляемость вирусов на культуре первично-трипсинизированных клеток фибробластов эмбриона человека ФЭЧ составляет от 2,5 до 50%, а на клетках штамма ЛЭЧ-4(8|) - от 10 до 45% по отношению к числу проб, использованных для исследования. В связи с зтим использование диплоидного штамма бсшее целесообразно, так как исключает необходимость многократного получения дефицитного сырья (эмбрионы человека) для получения клеток ФЭЧ и обеспечивает возможность одномоментного массового анализа большого числа проб. Штамм диплоидных клеток отличается вьфаженной чувствительностью к вирусам респираторной группы аденовирусу типа 7 и респираторносинцитиальному вирусу (РСВ) штамма Лонг. Максимальный титр накопления аденовируса в культуре составлял 6,06,5 Lg ТЦД через 96 ч после заражения, а РСВ - 5,0-5,5 Lg ТЦЦ о/цдл этот же срок. Эти данные показывают, что штамм клеток ЛЭЧ-4 (81) с успехом можно использовать для получения вирусных антигенов и соответствукяцих диагностических препаратов. Была испытана также чувствительность клеточного штамма ЛЭЧ-4{8) к вирусу простого герпеса (БОГ) в сравнении с другими культурами/ Для этого проведен ряд последовательных пассажей ВПГ на различных культурах клеток с изучением накопления ВПГ методом иммунофлюоресценции как в прямом,так .и непрямом варианте в течение 3 пассажей. Критериями дпя оценки чувствительности клеток к ВПГ служили: время появления свечения после инфицирования культуры; интенсивность флюоресценции и ее распространенность, которую отмечали + наличие флюоресценции в отдельных клетках; ++ - флюоресценция в группе клеток; +++ - тотальная флюоресценция монослоя. При учете результатов оценивали с стояние контрольных неинфицированных культур. в Через 12 ч с момента заражения вирусный антиген обнаруживается в клетках ПО, а через 24 ч в ФЭЧ и штамме ЛЭЧ-4(81). В остальных клеточных культурах йммунофлюорес1147748ценция отсутствует и ЦПД не наблюдается. Использование штамма позволит упростить приготовление вирусных 5 диагностических препаратов.

Штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4