СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ПРОГРЕССИИ ОПУХОЛЕЙ ТОЛСТОЙ КИШКИ Российский патент 2003 года по МПК C12Q1/68 G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при диагностике злокачественной прогрессии (способности инвазивного роста и метастазирования) опухолей толстой кишки.

Известны способы ранней молекулярной диагностики злокачественной прогрессии опухолей толстой кишки путем выявления наследственных или спонтанных изменений нуклеотидной последовательности (мутации) в генах ДНК человека, например в таких как: ген DDC (Huerta S. с соавт., Dig.Dis.Sci. 2001. Vol. 46. 9. Р. 1884-1891), ген АРС (Gavert N. С с соавт. Hum Mutat 2002. Vol.19. 6. P.664), ген Р53 (Liu M.C., Gelmann E.P. Semin. Oncol. 2002 Vol.29. 3. P. 246-257) и другие.

Наличие мутантных генов в опухолевых клетках подтверждается с помощью стандартных генетических методов, позволяющих исследовать изменение молекулярной массы мутантного гена в случае его частичной или полной делеции (полимеразная цепная реакция) либо установить нуклеотидные замены последовательностей (секвенирование). Такие методы требуют использования дорогостоящего оборудования и расходных материалов.

Мутации в генах приводят к изменению нормальной аминокислотной последовательности в синтезируемых белках и таким образом могут модулировать функции клеток в сторону трансформации или злокачественной прогрессии, то есть опухолевые клетки могут приобретать способность к инвазии в окружающие ткани, к метастазированию в регионарные лимфатические узлы, органы и ткани. Наличие или отсутствие мутантных белков в биологических тканях онкологических пациентов выявляется в основном иммунологическими методами, основанными на детекции специфическими антителами наличия или отсутствия искомой аминокислотной последовательности в целой молекуле белка в исследуемом материале, что в свою очередь является важным клиническим маркером прогрессии опухолей толстой кишки (Guiarnieri E. с соавт. Anticancer Res. 2000, Vol.20. 5 C. P.3829-3831).

К недостаткам этого способа относится невозможность точной характеристики уровня повреждения белковой структуры. В случае использования диагностических антител к аминокислотной последовательности исследуемого белка на уровне ниже, чем локализация мутации, результат детекции путем иммунологической реакции будет отрицательным и свидетельствовать об отсутствии белка, хотя сам мутированный белок, но с другими функциональными свойствами может присутствовать в исследуемом биологическом материале.

Задачей изобретения является создание способа, позволяющего достоверно выявить начальные признаки злокачественной прогрессии и инвазивного профиля опухолей толстой кишки.

Поставленная задача решается тем, что в способе диагностики злокачественной прогрессии опухолей толстой кишки, включающем иммуногистохимическое исследование опухолевых клеток, согласно изобретению исследуют коннексин-43 (SEQ ID 1) (см. приложение) опухолевых клеток, в котором определяют аминокислотные последовательности в позициях 119-142 и 363-382 и при выявлении аминокислотной последовательности в позициях 119-142 и отсутствии аминокислотной последовательности в позициях 363-382 диагностируют злокачественную прогрессию опухоли толстой кишки.

Исследования, проведенные авторами, были направлены на выявление мутационных повреждений белков, являющихся маркером злокачественной прогрессии опухолей толстой кишки.

Были исследованы образцы опухолей, полученных во время хирургических операций у 45 пациентов с клиническими диагнозами: аденома, бластома, рак различных отделов толстой и прямой кишки, и образцы регионарных лимфатических узлов, взятых у 4-х пациентов с диагнозом умереннодифференцированные аденокарциономы. В 11 образцах опухолей, гистологически верифицированных как высокодифференцированные и умереннодифференцированные аденокарциономы, а также аденокарциномы разной степени дифференцировки, наблюдали отсутствие детекции аминокислотной последовательности 363-382 в гистологически выявляемых очагах опухолевых клеток при одномоментном выявлении в тех же клетках аминокислотной последовательности 119-142 коннексина-43. В 2-х образцах регионарных лимфатических узлов также было выявлено отсутствие детекции аминокислотной последовательности 363-382 при одномоментном выявлении в тех же клетках аминокислотной последовательности 119-142 коннексина-43.

Не все известные виды коннексинов, выявляемые в кишечном эпителии человека, изменялись в исследованных образцах опухолей толстой кишки, что подтверждалось методом секвенирования генов коннексина-32 и коннексина-43. В частности, достоверно установлены генетические нарушения только для коннексина-43, хотя в тех же образцах опухолей не было обнаружено изменений молекулы коннексина-32.

Мутированный коннексин-43 был выявлен только в злокачественных клетках, что свидетельствует об опухолевой специфичности показанных изменений.

Это позволило сделать вывод о том, что избирательное отсутствие детекции аминокислотной последовательности 363-382 коннексина-43 в гистологически выявляемых очагах опухолевых клеток на срезах опухолей толстой кишки при одномоментном выявлении в тех же клетках аминокислотной последовательности 119-142 этого же белка свидетельствует об опухольспецифическом мутационном повреждении коннексина-43, что в свою очередь придает опухолевым клеткам инвазивные и метастатические свойства и, таким образом, требует соответствующей тактики послеоперационного лечения, направленного на химиотерапевтическое предотвращение отдаленных метастазов, даже при отсутствии метастатических клеток в регионарных лимфатических узлах, других органах и тканях.

Наоборот, детекция обоих аминокислотных последовательностей в опухолевых клетках, выявленная на срезах опухолевой ткани, свидетельствует о доброкачественном течении опухолевого процесса, что является более благоприятным прогностическим фактором в отношении метастазирования у таких пациентов.

Способ осуществляют, например, следующим образом.

Образцы опухолевой ткани толщиной 5 мм, взятые у больного в период проведения резекции опухоли, замораживают в жидком азоте и режут серийно на гистокриотоме при температуре -22^oС. Серийные срезы ткани толщиной 5-6 мкм наклеивают на предметные стекла. Срезы при комнатной температуре экспонируют в 10% растворе формалина в 0,9% NaCl в течение 10-15 мин, затем отмывают 3 раза по 20 мин в 0,9% NaCl и в течение 1 ч экспонируют в 5% растворе обезжиренного молока "Blocking Reagent" (Boehringer-Mannheim, Швейцария) в 0,9% NaCl.

Иммуногистохимическое исследование срезов опухолевых тканей с двойной окраской проводят последовательно: сначала выявляют аминокислотную последовательность 119-142 коннексина-43 человека, затем в тех же срезах выявляют аминокислотную последовательность 363-382. Для детекции аминокислотной последовательности 119-142 применяют высокоспецифичные поликлональные кроличьи антитела к пептидному фрагменту цитоплазматической петли молекулы коннексина-43, полученные в лаборатории Многостадийного Канцерогенеза МАИР путем иммунизации кроликов синтеническим пептидом, при разведении 1:2500, а для выявления кроличьих антител используют меченные цианином 3 антитела мыши (клон СХ-1В1 Zymed Laboratories, Inc. San Francisco, CA, USA) при разведении 1: 500. К кроличьим антителам срезы экспонируют при температуре 4^oС в течение 16 часов и отмывают 3 раза по 20 мин в 0,9% NaCl, затем экспонируют к мышиным антителам также при температуре 4^oС в течение 16 часов и отмывают 3 раза по 20 мин в 0,9% NaCl. Для детекции аминокислотной последовательности 363-382 используют коммерческие кроличьи антитела к С-терминальному фрагменту цитоплазматической части молекулы коннексина-43 ( С6219 Sigma-Aldrich Co. США при разведении 1:2500, а для выявления кроличьих антител используют меченные флюоресцеином антитела мыши к кроличьим антигенам (клон СХ-1В1 Zymed Laboratories, Inc. San Francisco, CA, USA) при разведении 1:500.

Детекцию флюоресцентного сигнала, свидетельствующего о наличии исследуемых аминокислотных последовательностей, проводят лазерным сканирующим конфокальным микроскопом Pascal 510 Zeiss производства Carl Zeiss Jena GmbH (Германия) с использованием соответствующих светофильтров.

Избирательное отсутствие детекции аминокислотной последовательности 363-382 коннексина-43 в гистологически выявляемых очагах опухолевых клеток на срезах опухолей толстой кишки при одномоментном выявлении в тех же клетках аминокислотной последовательности 119-142 этого же белка свидетельствует о злокачественной прогрессии опухоли толстой кишки.

Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1. Больной Л., 68 лет, находился на стационарном лечении в колопроктологическом отделении с клиническим диагнозом: Полипы прямой и ободочной кишки. После соответствующей предоперационной подготовки в плане оказания хирургической помощи произведена эндоскопическая электроэксцизия полипов. Гистологическое заключение: Тубулярно-папиллярная аденома толстой кишки с бурной пролиферацией эпителия. При иммуногистохимическом исследовании образцов ткани полипов, выполненном по описанной выше методике, все клетки на срезе были положительными на реакцию с поликлональными кроличьими антителами к пептидному фрагменту цитоплазматической петли молекулы (аминокислотные последовательности 119-142) коннексина-43 и была выявлена аминокислотная последовательность 363-382 коннексина-43.

Пример 2. Больная Ф. , 59 лет, находилась на стационарном лечении с клиническим диагнозом: Рак среднеампулярного отдела прямой кишки. После соответствующей предоперационной подготовки в плановом порядке произведена передняя резекция прямой кишки, трансверзэктомия. Гистологическое заключение: Умереннодифференцированная аденокарцинома толстой кишки с обширными участками некроза и лейкоцитарной инфильтрации в поверхностных отделах, прорастающая все слои стенки. В двух лимфатических узлах из параректальной клетчатки метастазов рака не выявлено. При иммуногистохимическом исследовании образцов опухолевой ткани аминокислотная последовательность 363-382 коннексина-43 в опухолевых клетках выявлена не была. Все клетки на срезе были положительными на реакцию с поликлональными кроличьими антителами к пептидному фрагменту цитоплазматической петли молекулы коннексина-43. При иммуногистохимическом исследовании в лимфатических узлах выявлена реакция, свидетельствующая о наличии клеток без аминокислотной последовательности 363-382 коннексина-43 с положительной реакцией на поликлональные кроличьи антитела к последовательности 119-142 коннексина-43. Это позволило сделать вывод о злокачественной прогрессии опухоли и подтвердилось наличием единичных опухолевых клеток в центре лимфоцитарных фолликулов.

Пример 3. Больная Г., 63 года, находилась на стационарном лечении в колопроктологическом отделении с клиническим диагнозом: Бластома ректосигмоидного отдела прямой кишки IV ст. После соответствующей предоперационной подготовки в плановом порядке произведена передняя резекция прямой кишки, краевая резекция левой доли печени. Гистологическое заключение: Высокодифференцированная аденокарцинома толстой кишки с прорастанием всех слоев стенки, с метастазами в регионарные лимфатические узлы. В краях кишки - отек и неравномерное полнокровие подслизистого слоя. В печени - метастаз плоскоклеточного рака с криброзными структурами и обширными некрозами. Диагноз заключительный клинический (основной): Рак ректосигмоидного отдела прямой кишки IV ст. (T₄N₁M₁). Mts в печень и регинарные лимфатические узлы. При иммуногистохимическом исследовании образцов опухолевой ткани аминокислотная последовательность 363-382 коннексина-43 в опухолевых клетках выявлена не была. Все клетки на срезе были положительными на реакцию с поликлональными кроличьими антителами к пептидному фрагменту цитоплазматической петли молекулы коннексина-43.

Пример 4. Больной С., 59 лет, находился на стационарном лечении с клиническим диагнозом: Рак поперечно-ободочной кишки. После соответствующей предоперационной подготовки в плановом порядке произведена расширенная правосторонняя гемиколэктомия с резекцией поперечно-ободочной кишки. Гистологическое заключение: Умереннодифференцированная аденокарцинома толстой кишки, прорастающая все слои ее стенки. Края резекции, червеобразный отросток, шестнадцать регионарных лимфатических узлов без онкологической патологии. При иммуногистохимическом исследовании образцов опухолевой ткани все опухолевые клетки на срезе были положительными на реакцию с поликлональными кроличьими антителами к пептидному фрагменту цитоплазматической петли молекулы коннексина-43 и была выявлена аминокислотная последовательность 363-382 коннексина-43. При иммуногистохимическом исследовании в лимфатических узлах выявлены аминокислотные последовательности 119-142 и 363-382. Проведенные исследования позволили сделать вывод о благоприятном прогнозе в отношении метастазирования опухоли у пациента.

Предложенный способ ранней молекулярной диагностики злокачественной прогрессии опухолей толстой кишки позволяет выявить приобретение опухолевыми клетками новообразований без очевидных морфологических признаков злокачественности способности инвазивного роста и метастазирования, что может способствовать прогнозированию течения онкологического заболевания, выявлению наличия скрытых метастазов и определять тактику дельнейшего лечения индивидуального пациента.

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии. Способ позволяет достоверно выявлять начальные признаки злокачественной прогрессии и инвазивного профиля опухолей толстой кишки. Проводят иммуногистохимическое исследование опухолевых клеток, при этом исследуют коннексин-43 опухолевых клеток, в котором определяют аминокислотные последовательности в позициях 119-142 и 363-382 и при выявлении аминокислотной последовательности в позициях 119-142 и невыявлении аминокислотной последовательности в позициях 363-382 диагностируют злокачественную прогрессию опухоли толстой кишки.

Способ диагностики злокачественной прогрессии опухолей толстой кишки, включающий иммуногистохимическое исследование опухолевых клеток, отличающийся тем, что исследуют коннексин-43 опухолевых клеток, в котором определяют аминокислотные последовательности в позициях 119-142 и 363-382 и при выявлении аминокислотной последовательности в позициях 119-142 и невыявлении аминокислотной последовательности в позициях 363-382 диагностируют злокачественную прогрессию опухоли толстой кишки.