СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГИПЕРТРОФИЧЕСКОЙ КАРДИОМИОПАТИИ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, кардиохирургии, и может быть использовано как метод скрининга при постановке диагноза гипертрофической кардиомиопатии (ГКМП).

Известен способ диагностики гипертрофической кардиомиопатии путем генетического анализа мутаций генов белков саркомера (Development and application of linkage analysis in genetic diagnosis of familial hypertrophic cardiomyopa-thy//J. Med. Genet. 2001, 38:193-198). Способ проведения генетического анализа (секвенирование) является малодоступным, так как требует дорогостоящего специального оборудования и реактивов.

Известен способ диагностики гипертрофической кардиомиопатии, включающий эхокардиографическое исследование (Н. Шиллер, М.А. Осипов. Клиническая эхокардиография // М.: МИР. - 1993. - С. 92-99). В соответствии с этим способом количественно оценивают толщину межжелудочковой перегородки, свободных стенок левого желудочка и размеры полости левого желудочка. При увеличении градиента давления в выходном отделе левого желудочка, толщине межжелудочковой перегородки более 13 мм, увеличении толщины стенок ЛЖ, уменьшении размеров полости левого желудочка и передне-систолическом движении митрального клапана диагностируют ГКМП. Данный способ принят за прототип.

Основным недостатком этого способа является его неспецифичность, что практически исключает дифференциальную диагностику между ГКМП, ГБ и артериальной гипертензией почечного генеза и требует осуществления дополнительных исследований.

Задачей изобретения является создание способа диагностики гипертрофической кардиомиопатии, обладающего высокой специфичностью и не требующего использования сложных и дорогостоящих технических средств.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе диагностики гипертрофической кардиомиопатии согласно изобретению исследуют биоптаты миокарда межжелудочковой перегородки, препараты окрашивают азотно-кислым серебром в присутствии коллоидного раствора, в ядрах кардиомиоцитов и фибробластов определяют количество Аg-гранул и при количестве ядер кардиомиоцитов, содержащих более 30 Аg-гранул на ядро, не менее 20%, и ядер фибробластов, содержащих более 10 Аg-гранул на ядро, не менее 10%, диагностируют гипертрофическую кардиомиопатию.

Авторами были проведены исследования, в которых избирательная импрегнация ядрышек солями серебра изучалась в кардиомиоцитах (КМЦ) и стромальных клетках миокарда больных гипертрофической кардиомиопатией, артериальной гипертензией различного генеза и практически здоровых лиц.

Всего было обследовано 46 пациентов: 7 - практически здоровых лиц, масса миокарда 303±24.0; 10 больных ГБ II стадией, масса миокарда 501.0±67.0; 11 - ГБ III, масса миокарда 436.0±47.1; 11 больных артериальной гипертензией почечного генеза, масса миокарда 433.0±72.0; 7 больных ГКМП, масса миокарда 521.0±68.15.

В миокарде практически здоровых лиц (группа контроля) в обобщенной гистограмме распределения ядер кардиомиоцитов в зависимости от числа Аg-гранул ядра с количеством Аg-гранул более 30 отсутствуют. В миокарде больных артериальной гипертензией почечного генеза и гипертонической болезнью II и III стадией заболевания в обобщенной гистограмме распределения ядер кардиомиоцитов в зависимости от количества Аg-гранул доля ядер, содержащих более 30 Аg-гранул, колеблется от 1 до 5%.

Что касается доли ядер фибробластоподобных клеток, содержащих более 10 Аg-гранул, то в миокарде здоровых лиц и больных ГБ II стадией, по нашим данным, они отсутствуют. При гипертонической болезни III, осложненной ХПН (I ст.), присутствовали единичные ядра (1%) и у больных артериальной гипертензией почечного генеза в условиях ХПН (I-III ст.) их доля варьирует от 1 до 6.4%. При этом важно отметить отсутствие достоверных различий по массе миокарда между больными ГКМП и пациентами ГБ и артериальной гипертензией почечного генеза.

У больных гипертрофической кардиомиопатией в гистологическом препарате доля ядер кардиомиоцитов, которые содержат более 30 Аg-гранул, составляла не менее 20%, а доля ядер фибробластов, содержащих более 10 Аg-гранул на ядро, составляла не менее 10%.

Таким образом, проведенные исследования показали высокую специфичность предложенного способа диагностики ГКМП.

Способ осуществляют, например, следующим образом.

В качестве исследуемого материала могут быть использованы интраоперационный материал миокарда, кардиобиоптаты, экспресс-аутопсии миокарда межжелудочковой перегородки. Биоптат миокарда помещают в жидкий азот, готовят криостатные срезы толщиной 10 мкм, размещают их на предметных стеклах, высушивают на воздухе, фиксируют смесью метиловый спирт/ледяная уксусная кислота в отношении 3:1 в течение 10 минут и ополаскивают дистиллированной водой. После высушивания на воздухе препараты обрабатывают в 2N растворе муравьиной кислоты в течение 20 минут. По окончании инкубации стекла повторно ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и окрашивают 50% раствором нитрата серебра по стандартной методике (Howell W.M., Black D.A. Controlled silver staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a one step method. Experientia. 1980; 36:1014-15) в модификации, предложенной авторами (Мамаев Н.Н., Гудкова А.Я., Аминева Х.К., Ковалева В.А. и др. Метод оценки белок-синтезирующей функции кардиомиоцитов человека. Архив анатомии гистологии и эмбриологии 1989; 5: 69-72). Для этого на предметное стекло со срезами миокарда наносят 2 капли 2% водного раствора желатина, приготовленного на 1% водном растворе муравьиной кислоты и 4 капли 50% водного раствора нитрата серебра. Препарат накрывают покровным стеклом и оставляют при комнатной температуре на 1 мин. Затем его переносят в камеру с увлажненным и подогретым до 68±70 С^o воздухом и инкубируют 2.5±3 минуты. Препараты докрашивают 2% водным раствором краски Гимза, приготовленным на фосфатном буфере (рН 6.8). Количественный анализ проводят под микроскопом при увеличении х1000 (например, Карл-Цейс, Йена). В каждом случае анализируют не менее 100 ядер кардиомиоцитов и фибробластов, определяют количество Аg-гранул на ядро как КМЦ, так и стромальный клетки и при доле ядер кардиомиоцитов, содержащих более 30 Аg-гранул, не менее 20%, а доле ядер фибробластов содержащих более 10 Аg-гранул, не менее 10%, - диагностируют гипертрофическую кардиомиопатию.

Способ иллюстрируется следующим клиническим примером.

Больная Б., 16 лет. Диагноз: Семейная обструктивная гипертрофическая кардиомиопатия. Исследован интраоперационный образец миокарда межжелудочковой перегородки, полученный во время миотомии и миэктомии межжелудочковой перегородки и протезирования митрального клапана. Показанием к операции послужило прогрессирующее течение заболевания, нарастание градиента давления в выходном отделе левого желудочка (88 мм рт. ст.).

Подготовку препарата и его окрашивание проводили по описанной выше методике.

Количество Аg-гранул в ядрышках кардиомиоцитов больной варьировало от 9 до 61 (среднее 29.5±4.0). Доля ядер, содержащих 30 и более Аg-гранул на ядро, составила 38%. Число Аg-гранул в ядрах фибробластов колебалось от 1 до 16 (среднее 8.28±0.48). Доля ядер фибробластов с 11 и более гранулами серебра на ядро достигала 26%.

Таким образом, предлагаемый способ диагностики гипертрофической кардиомиопатии обладает высокой специфичностью и не требует использования сложных и дорогостоящих технических средств.

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии и кардиохирургии. Способ позволяет повысить специфичность диагностики гипертрофической кардиомиопатии и прост в исполнении. Исследуют биоптаты миокарда межжелудочковой перегородки, препараты окрашивают азотно-кислым серебром в присутствии коллоидного раствора, в ядрах кардиомиоцитов и фибробластов определяют количество Ag-гранул и при количестве ядер кардиомиоцитов, содержащих более 30 Ag-гранул на ядро, не менее 20%, и ядер фибробластов, содержащих более 10 Ag-гранул на ядро, не менее 10%, диагностируют гипертрофическую кардиомиопатию.

Способ диагностики гипертрофической кардиомиопатии, отличающийся тем, что исследуют биоптаты миокарда межжелудочковой перегородки, препараты окрашивают азотно-кислым серебром в присутствии коллоидного раствора, в ядрах кардиомиоцитов и фибробластов определяют количество Ag-гранул и при количестве ядер кардиомиоцитов, содержащих более 30 Ag-гранул на ядро, не менее 20%, и ядер фибробластов, содержащих более 10 Ag-гранул на ядро, не менее 10%, диагностируют гипертрофическую кардиомиопатию.