СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЛИЦ, ОТНОСЯЩИХСЯ К ГРУППЕ РИСКА ПО РАЗВИТИЮ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/50 G01N33/74 

Изобретение относится к медицине, а именно к области аллергологии и иммунологии, и может быть использовано для выявления лиц, относящихся к группе риска по развитию аллергических заболеваний, среди практически здоровых людей.

Проблема своевременной диагностики аллергических заболеваний, особенно ранних форм аллергопатологии, является одной из важнейших проблем современной медицины. Особенно важно выявление среди практически здоровых людей групп риска по развитию аллергопатологии, так как оно позволяет своевременно проводить необходимые профилактические меры и более эффективно осуществлять лечение аллергических заболеваний. В настоящее время ранняя аллергологическая диагностика осуществляется различными методами. Известен, например, способ прогнозирования развития аллергического заболевания у ребенка (патент РФ 2108582 по кл. G 01 N 33/53, бюл. 10 от 10.04.98) путем выявления клинической формы аллергии, при котором определяют факторы риска: загрязненность окружающего воздуха, наличие конкретной профессиональной вредности у родителей, наличие врожденной наследственной патологии, а также патологии беременности матери или у ребенка при рождении, наличие потенциальных аллергенов в доме, учитывают возраст, пол ребенка, группу крови, его жилищные условия, вскармливание, затем по конкретным данным проводят расчет прогностических коэффициентов с помощью ЭВМ и при пороговом значении сумм прогностических коэффициентов более 13 прогнозируют вероятность развития конкретной формы аллергии у ребенка.

Недостатком данного способа является его сложность и трудоемкость, так как требуется учесть более 100 различных показателей.

Известны также способы диагностики аллергических заболеваний с использованием различных биохимических исследований крови. Например, способ диагностики аллергических заболеваний (патент РФ 2098826 по кл. G 01 N 33/53, бюл. 34 от 10.12.97) путем постановки нагрузочного теста с теофиллином предусматривает одновременное проведение реакции спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана и при количестве розеткообразующих нейтрофилов, равном 1067 в 1 мл крови и ниже, а теофиллинрезистентных Т-лимфоцитов - 27% и ниже - диагностируют аллергическое заболевание.

Недостатком данного способа является ограниченность его применения (только для работников микробиологической промышленности) и невозможность выявления среди практически здоровых людей лиц, относящихся к группе риска по развитию аллергических заболеваний.

Наиболее близкими к предлагаемому изобретению являются недозированная по глубине и длительности неспецифическая нагрузочная гипервентиляционная проба (Малкин В.Б., Гора Е.Л. Гипервентиляция. - М.: Haукa, 1990, с. 184) и способ определения функциональной активности клеток крови доноров (по авт. св. СССР 1686361 по кл. G 01 N 33/50, бюл. 39 от 23.10.91) путем исследования больших гранулярных лимфоцитов, при котором лимфоциты инкубируют параллельно в средах, содержащих адреналин, серотонин, гистамин и не содержащих их, в течение 40 минут при 37^oС, далее пробы центрифугируют, из каждого осадка готовят мазок, обрабатывают по методу Севки, определяют в каждом количество больших гранулярных лимфоцитов, содержащих адреналин, серотонин и гистамин, вычисляют процент клеток, содержащих моноамины во всех исследованных мазках, рассчитывают суммарный коэффициент аминосодержания и при его значении от 2,1 до 3,6 определяют клетки функционально активными.

Недостатком известных способов являются ограниченные диагностические возможности, в частности, в аллергологии и иммунологии - только для выявления уже существующей патологии (неспецифическая нагрузочная гипервентиляционная проба - для диагностики преимущественно бронхиальной астмы при ухудшении показателей функции внешнего дыхания более чем на 20%, а способ по АС 1686361 - для определения функциональной активности клеток крови при переливании). Выявить среди практически здоровых людей лиц, относящихся к группе риска по развитию аллергических заболеваний, описанные методы не позволяют.

Задачей изобретения является создание относительно простого и надежного способа выявления лиц, относящихся к группе риска по развитию аллергических заболеваний, среди практически здоровых людей.

Поставленная задача решается в предлагаемом способе выявления лиц, относящихся к группе риска по развитию аллергичесих заболеваний, включающем гипервентиляционную пробу, а также биохимическое исследование крови на содержание адреналина и серотонина и гистохимические исследования больших гранулярных лимфоцитов (БГЛ) в нагрузочном тесте с биогенными аминами с расчетом суммарного коэффициента аминосодержания (СКА), за счет того, что указанные биохимическое и гистохимическое исследования крови проводят до и после дозированной по времени и объему гипервентиляционной пробы, и при наличии совокупности следующих признаков:
- после гипервентиляции уровень адреналина крови остается стабильным,
- до и (или) после гипервентиляции суммарный коэффициент содержания биогенных аминов (СКА) у больших гранулярных лимфоцитов (БГЛ) крови находится в интервале значений от 2,1 до 3,6,
- после гипервентиляции процентное содержание больших гранулярных лимфоцитов, несущих гранулы серотонина, возрастает,
- после гипервентиляции уровень серотонина крови снижается
относят клинически здорового человека к группе риска по развитию аллергических заболеваний. Дозированная гипервентиляционная проба при этом проводится в течение 20 минут объемами 40 л/мин.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. В исходном состоянии (состояние покоя) у обследуемого пациента производится забор 10-12 мл венозной крови из локтевой вены для необходимых биохимических и гистохимических исследований. Затем проводится дозированная гипервентиляционная проба в течение 20 минут объемами 40 л/мин. Дыхание осуществляется обычным комнатным (атмосферным) воздухом. Гипервентиляция достигается благодаря волевому (произвольному) увеличению глубины дыхания с использованием газовых часов, фиксирующих глубину дыхания в литрах и минутную вентиляцию в литрах в минуту. Частоту дыхания задают метрономом.

После гипервентиляционной пробы производят повторный забор венозной крови. Биохимические исследования крови включают определение в крови концентрации адреналина и серотонина (см., например, Лабораторные методы исследования в клинике, справочник под ред. Меньшикова В.В. - М.: Медицина, 1987, с. 368). Гистохимический (хромафинный) метод Севки используется для обнаружения адреналина, гистамина, серотонина в гранулах больших гранулярных лимфоцитов (БГЛ) - естественных киллеров: в исходной тест-системе и после инкубирования с 10^-4 М каждого из указанных аминов.

Из крови, взятой из локтевой вены, получают центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина фракцию лимфоцитов/макрофагов. Количество клеток доводили до концентрации 2х10⁶ клеток в 1 мл среды 199. Лимфоидно-макрофагальную взвесь разливали по 0,2 мл в 4 пробирки. В первую пробирку добавляли 0,2 мл среды 199 - это исходная тест-система (контроль), во вторую - 0,2 мл 10^-4 М раствора гидрохлорида адреналина, в третью - 0,2 мл 10^-4 М раствора креатин-сульфата серотонина, в четвертую - 0,2 мл 10^-4 М раствора гидрохлорида гистамина. Пробы инкубировали 40 минут при температуре 37^oС. После инкубирования все пробы подвергали центрифугированию при 1500 об/мин в течение 5 минут. Из осадка пробирок готовили мазки по Севке. Для этого препараты фиксировались в реактиве Севки (40%-ный формальдегид - 12 мл, 5%-ный раствор бихромата калия - 50 мл, 1 М раствор ацетата натрия - 20 мл, дистиллированная вода - до 100 мл) в течение 6-8 часов. Фиксирующая смесь готовилась непосредственно перед использованием. После фиксации препараты в течение 1 часа промывались в дистиллированной воде, а затем окрашивались раствором Гимза 1 час. В готовых препаратах раздельно подсчитывали количество клеток, несущих в гранулах серотонин, адреналин, гистамин не менее чем в 10 полях зрения и определяли относительное (%) количество аминонесущих БГЛ. Затем рассчитывали суммарный коэффициент содержания биогенных аминов (СКА) по формуле
СКА=Кадр+Kсep+Кгист (1),
где К - коэффициент, характеризующий количественное соотношение БГЛ для каждого способа инкубирования в присутствии тестируемого биогенного амина.

В свою очередь

где А - % БГЛ, несущих гранулы адреналина,
С - % БГЛ, несущих гранулы серотонина,
Г - % БГЛ, несущих гранулы гистамина,
в числителе (с индексом "и") - результаты определения для лимфоцитов, инкубированных с моноамином, для которого рассчитывается коэффициент, в знаменателе (с индексом "к") - показатели для интактных лимфоцитов (контроль).

Таким образом определялись следующие показатели:
- концентрация адреналина крови,
- концентрация серотонина крови,
- общее количество БГЛ (в %%),
- процентное содержание БГЛ, несущих в гранулах адреналин, серотонин, гистамин,
- величина СКА.

В результате исследований выявлены следующие критерии риска развития аллергических заболеваний у клинически здоровых людей - это совокупность следующих признаков:
- после гипервентиляции уровень адреналина крови остается стабильным,
- до и (или) после гипервентиляции СКА у БГЛ крови находится в среднем интервале значений (2,1<СКА<3,6),
- после гипервентиляции процент БГЛ, несущих гранулы серотонина, возрастает,
- после гипервентиляции уровень серотонина крови снижается.

Наличие совокупности всех перечисленных признаков позволяет отнести клинически здорового человека к группе риска по развитию аллергических заболеваний.

Предлагаемый способ выявления лиц, относящихся к группе риска по развитию аллергических заболеваний, прошел клинико-лабораторные испытания в Самарском медицинском институте "Реавиз" на группе клинически здоровых студентов-добровольцев. Величина показателя СКА во всех случаях рассчитывалась по формулам (1) и (2).

Клинические примеры.

Пример 1. Студент К. , 1975 г.р., вес 76 кг, рост 177 см, спортсмен (плавание), практически здоров. Аллергопатологии не выявлено. Обследован в 1998 г. До гипервентиляционной пробы: адреналин - 1,13 нМ/л, серотонин - 32,5 мкг%, БГЛ, несущие серотонин, - 4%, СКА - 3,37. После гипервентиляционной пробы: адреналин - 1,13 нМ/л, серотонин - 27,6 мкг%, БГЛ, несущие в гранулах серотонин, - 6%, СКА - 3,37. Таким образом, у обследуемого выявлены все критерии, позволяющие отнести его к группе риска по развитию аллергических заболеваний. При контрольном обследовании в 2001 году обнаружена аллергическая реакция на лекарственные препараты (антибиотики широкого спектра действия) в виде крапивницы.

Пример 2.

Студент З. , 1980 г.р., вес 70 кг, рост 180 см, практически здоров, аллергических заболеваний нет. Обследован в 1998 году. До гипервентиляционной пробы: адреналин - 6,7 нМ/л, серотонин - 68 мкг%, БГЛ, несущие в гранулах серотонин, - 3%, СКА - 2,54. После гипервентиляционной пробы: адреналин -6,7 нМ/л, серотонин - 46 мкг%, БГЛ, несущие гранулы серотонина, - 4%, СКА - 4,56. Все критерии риска присутствуют. Отнесен к группе риска по развитию аллергических заболеваний. В 2000 году появились признаки сезонного ринита и конъюнктивита (поллиноз).

Пример 3.

Студент Ф. , 1976 г.р., вес 59 кг, рост 175 см, практически здоров. Аллергических заболеваний нет. Обследован в 1998 году. До гипервентиляционной пробы: адреналин - 3,38 нМ/л, серотонин - 23,0 мкг%, БГЛ, несущие в гранулах серотонин, - 4%, СКА - 4,08. После гипервентиляционной пробы: адреналин - 3,38 нМ/л, серотонин - 15,95 мкг%, БГЛ, несущие в гранулах серотонин, - 9%, СКА - 2,49. Все критерии риска присутствуют. Отнесен к группе риска по развитию аллергических заболеваний. В 2000 - 2001 годах наблюдалась крапивница на пенициллин и его аналоги.

Пример 4.

Студент М., 1980 г.р., вес 70 кг, рост 175 см, практически здоров. Аллергических заболеваний нет. Обследован в 1998 году. До гипервентиляционной пробы: адреналин - 1,02 нМ/л, серотонин - 50 мкг%, БГЛ, несущие в гранулах серотонин, - 2%, СКА - 3,88. После гипервентиляционной пробы: адреналин - 1,016 нМ/л, серотонин - 25 мкг%, БГЛ, несущие в гранулах серотонин, - 4%, СКА - 3,03. Все критерии риска присутствуют. Отнесен к группе риска по развитию аллергических заболеваний. В 2001 году выявлена аллергическая реакция на пищевые продукты (цитрусовые) в виде крапивницы.

Пример 5.

Студент Ф., 1979 г.р., вес 71 кг, рост 182 см, практически здоров. Аллергических заболеваний нет. Обследован в 1998 году. До гипервентиляционной пробы: адреналин - 1,13 нМ/л, серотонин - 24,4 мкг%, БГЛ, несущие серотонин, - 6%, СКА - 4,49. После гипервентиляционной пробы: адреналин - 5,64 нМ/л, серотонин - 27,63 мкг%, БГЛ, несущие серотонин, - 8%, СКА - 3,86. Совокупность критериев, позволяющих отнести его к группе риска по развитию аллергических заболеваний, отсутствует. В 2001 году прошел контрольное обследование. Диагноз: практически здоров.

Всего было обследовано 92 клинически здоровых добровольца. К группе риска по указанным критериям было отнесено 35 человек (38% от всех обследованных), из них через 3 года признаки аллергических заболеваний зафиксированы у 16 человек (45,7% от количества обследованных, выделенных в группу риска). У 57 пациентов, не отнесенных к группе риска, при повторных исследованиях аллергических заболеваний не выявлено. Контрольная группа включала 20 больных аллергическими заболеваниями, у которых как в период ремиссии, так и в момент обострения регистрировалась совокупность показателей, выбранных в качестве критериев риска аллергопатологии. Таким образом, наличие совокупности всех критериев риска позволяет отнести клинически здорового пациента к группе риска по развитию аллергических заболеваний. Отсутствие хотя бы одного из критериев означает, что данный пациент не относится к группе риска по развитию аллергических заболеваний.

Предлагаемое изобретение обеспечивает надежное выявление лиц, относящихся к группе риска по развитию аллергических заболеваний, среди клинически здоровых людей и за счет ранней диагностики и проведения курса профилактического лечения снижение заболеваемости различными формами аллергии, особенно такими опасными, как бронхиальная астма и анафилактический шок, а также повышение эффективности лечения аллергических заболеваний.

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии и иммунологии. Сущность способа: определяют содержание адреналина и серотонина в крови и суммарный коэффициент аминосодержания у больших гранулярных лимфоцитов в нагрузочном тесте с биогенными аминами до и после гипервентиляционной пробы, проводимой в течение 20 мин объемами 40 л/мин, и при наличии совокупности следующих признаков: после гипервентиляции уровень адреналина крови остается стабильным; до и/или после гипервентиляции суммарный коэффициент содержания аминосодержания у больших гранулярных лимфоцитов крови находится в интервале значений от 2,1 до 3,6; после гипервентиляции процентное содержание больших гранулярных лимфоцитов, несущих гранулы серотонина, возрастает; после гипервентиляции уровень серотонина крови снижается - относят клинически здорового человека к группе риска по развитию аллергических заболеваний. Способ обеспечивает высокую достоверность.

Способ выявления лиц, относящихся к группе риска по развитию аллергических заболеваний, отличающийся тем, что проводят биохимическое исследование крови на содержание адреналина и серотонина и гистохимическое исследование больших гранулярных лимфоцитов в нагрузочном тесте с биогенными аминами с расчетом суммарного коэффициента аминосодержания до и после гипервентиляционной пробы, проводимой в течение 20 мин объемами 40 л/мин, и при наличии совокупности следующих признаков: после гипервентиляции уровень адреналина крови остается стабильным, до и/или после гипервентиляции суммарный коэффициент аминосодержания у больших гранулярных лимфоцитов крови находится в интервале значений от 2,1 до 3,6, после гипервентиляции процентное содержание больших гранулярных лимфоцитов, несущих гранулы серотонина, возрастает, после гипервентиляции уровень серотонина крови снижается - относят клинически здорового человека к группе риска по развитию аллергических заболеваний.