НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЭНДОГЕННЫМ БИОРЕГУЛЯТОРАМ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЗАВИСИМОСТИ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/53 C12Q1/28 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано с целью выявления лиц с различными заболеваниям зависимости, в том числе: токсико-химической зависимости: алкоголизму, наркомании, токсикомании; пищевой зависимости, гэмблингу (игромания).

В настоящее время в мире отмечено увеличение числа людей с различной формой заболевания зависимости, с проявлением клиники патологического влечения к употреблению лекарственных препаратов, наркотиков, алкоголя, азартным играм, продуктам питания и т.д. Эти люди нуждаются в своевременной диагностике и оказании лечебно-реабилитационной помощи.

Болезни зависимости относят к нейроиммунохимическим патологиям. Их развитие сопровождается нарушением взаимодействия центральной нервной и иммунной системы.

Каждый психоактивный препарат имеет свой фармакологический спектр действия. Однако у всех веществ, способных вызвать синдром зависимости, имеется общее звено фармакологического действия - это характерное влияние на катехоламиновую (КА) нейромедиацию в лимбических структурах мозга, в частности в системе подкрепления.

Воздействие психоактивных веществ (ПАВ) приводит к интенсивному выбросу из этих отделах мозга нейромедиаторов из группы КА, в первую очередь дофамина (ДА), а следовательно - к значительно более сильному возбуждению системы подкрепления. Такое возбуждение нередко сопровождается положительно окрашенными эмоциональными переживаниями. Свободные КА подвергаются действию ферментов метаболизма и быстро разрушаются. Повторные приемы ПАВ приводят к истощению запасов нейромедиаторов, что проявляется недостаточно выраженным возбуждением системы подкрепления при поступлении "нормального" импульса. Психофизически у человека это выражается падением настроения, ощущением вялости, слабости, переживаниями скуки, эмоционального дискомфорта, депрессивными симптомами. Прием ПАВ на этом фоне вновь вызывает дополнительное высвобождение нейромедиаторов из депо, что временно компенсирует их дефицит в синаптической щели и нормализует деятельность лимбических структур мозга. Этот процесс сопровождается субъективным ощущением улучшения состояния, эмоциональным и психическим возбуждением и т.д. Однако свободные КА быстро разрушаются, что приводит к дальнейшему падению их содержания, ухудшению психоэмоционального состояния и, соответственно, к стремлению вновь использовать ПАВ.

Ранняя диагностика таких состояний очень важна, т.к. помимо всего эти заболевания имеют социальный аспект.

Известен способ определения предрасположенности к формированию опиатной зависимости, в котором определяют in vitro концентрацию циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) при тестовой нагрузке морфином в сочетании с налоксоном в нативных и в нативных предварительно морфинизированных мононуклеарных клетках переферической крови, рассчитывают индекс предрасположенности путем деления значения концентрации цАМФ в нативных предварительно морфинизированных на ее значение в нативных мононуклеарных клетках и при значении индекса более 1,3 определяют высокую предрасположенность к формированию опиатной зависимости. (RU, C1, 2177157, МКИ 7 G01N 33/68, опуб. 2001.12.20)

Этот способ имеет высокую точность, однако сложен и определяет лишь опиатную зависимость.

Из уровня техники известен способ прогнозирования риска возникновения аддитивных, компульсивных и импульсивных расстройств в форме алкоголизма, ожирения и табакокурения путем молекулярно-генетического исследования гена DRD2 (Pat. US 5550021, 27.08.1996).

Однако проведение медико-генетического исследования является длительным многозатратным процессом, требующим дорогостоящего оборудования и высокой квалификации специалистов.

Известен способ определения предрасположенности к заболеваниям зависимости по наличию естественных антител к эндогенным биорегуляторам в составе крови здоровых и больных людей, страдающих различными типами наркомании, игровой зависимостью, алкоголизмом, ожирением. Установлено, (патент РФ 2369872, МПК G01N 33/53 (2006.01), опуб. 10.10.2009), что у больных с заболеваниями зависимости: имеется достоверно повышенный или сниженный уровень антител. При лечении он может меняться и коррелировать с состоянием здоровья человека. На основании этого факта отклонение от нормы в содержании антител в группе здоровых лиц может расцениваться как биологический фактор риска, который в определенной ситуации приводит к заболеванию зависимости.

Эти факторы надо выявлять заранее, чтобы намечать индивидуальную программу охраны здоровья для этих людей, рекомендовать щадящую профессиональную ориентацию и т.д.

В известном способе анализируемую пробу инкубируют с коньюгатом гаптен: макромолекулярный носитель, иммобилизованным на твердой фазе, затем инкубируют образовавшийся иммунный комплекс с коньюгатом антител против иммуноглобулинов класса М и G человека, меченных ферментом, при этом в качестве коньюгата используют конъюгат, в котором гаптен относится к группе опиоидных пептидов, или биогенным аминам или пептидам ренин-ангиотензиновой системы, а макромолекулярный носитель имеет белковую или полимерную природу

Панель антигенов включала эндогенные биорегуляторы, относящиеся к следующим классам - опиоидные пептиды: (β-эндорфин, дерморфин, энкефалин), биогенные амины: (серотонин, гистамин, дофамин, норадреналин, адреналин), пептиды ренин-ангиотензиновой системы (ангиотензин II, брадикинин, вазопрессин).

Однако процент выявления больных не всегда является удовлетворительным.

Предлагаемое изобретение решает задачу поиска новых диагностических маркеров определения заболеваний зависимости, позволяющих увеличить точность этой оценки за счет увеличения процента выявления людей, имеющих отклонение этого показателя от нормы в ту или иную стороны.

Поставленная задача решается с помощью набора для иммуноферментного определения антител к эндогенным биорегуляторам в сыворотке крови для выявления заболеваний зависимости методом двухстадийного иммуноферментного анализа в сыворотке крови человека in vitro, представляющий собой комплект в одной коробке, содержащий, по крайней мере один, 96-луночный разборный стрипованный планшет, с нанесенными на его поверхность последовательно всеми конъюгатами из ряда: β-эндорфин, серотонин, дофамин, гистамин, орфанин и ангиотензин; а также емкости содержащие положительные контрольные образцы сыворотки крови человека, содержащие антитела к перечисленным выше коньюгатам, отрицательные контрольные образцы сыворотки крови человека, не содержащие антитела к перечисленным выше соединениям, антивидовые антитела против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой из корня хрена, фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий твин-20, субстратный буферный раствор, раствор субстрата тетраметилбензидина и стоп-реагент.

Выявление заболеваний зависимости, основано на взаимодействии антител к эндогенным биорегуляторам (β-эндорфину, серотонину, дофамину, гистамину, орфанину, ангиотензину), содержащихся в анализируемой пробе, с иммобилизованным на внутренней поверхности планшета антигеном указанного эндогенного биорегулятора. Образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляют с помощью конъюгата антител против иммуноглобулинов человека, меченных пероксидазой из корня хрена. Учет результатов проводят по изменению окраски субстратно-хромогенной смеси.

Проведенные нами исследования установили, что при развитии заболевания зависимости, в том числе: токсико-химической зависимости: алкоголизму, наркомании, токсикомании; пищевой зависимости, гэмблингу (игромания), наиболее сильные изменения происходят в метаболизме таких ключевых соединений, как: β-эндорфина, серотонина, дофамина, гистамина, орфанина и ангиотензина, которые сопровождаются нарушением продукции специфических естественных антител. Если изменения в содержании антител к ним произошли, все равно когда: в детстве, при рождении, в результате болезни, травмы, стрессовой ситуации, при участии психического или токсического, генетического фактора, мы можем определить эти изменения и говорить о биологическом факторе развития болезни зависимости. Корреляция между изменением этого уровня и подтвержденным клинически диагнозом, позволяет использовать заявляемый набор для выявления ряда заболеваний зависимости, в том числе: алкоголизма, наркомании, токсикомании; пищевой зависимости, гэмблингу (игромания), в результате одного забора крови с повышенными показателями чувствительности и специфичности метода и, таким образом, сообщает всему изобретению соответствие критерию «промышленная применимость».

Таким образом, техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение точности определения заболевания зависимости за счет повышения показателей чувствительности и специфичности метода путем использования набора из 6 маркеров.

Из уровня техники нам не известны сведения, касающиеся одновременного выявления развития ряда заболеваний зависимости при анализе антител к эндогенным биорегуляторам, заявленным в НАБОРЕ, которые определяют у пациента в одном заборе крови.

Таким образом, установленная нами закономерность сообщает всему изобретению как соответствие критерию «новизна», так и критерию «изобретательский уровень».

В таблице 1 указано минимальное содержание антител к β-эндорфину, серотонину, дофамину, гистамину, орфанину, ангиотензину, определяемое с помощью набора.

В таблице 2 приведены значения OD450 в ИФА в среднем по группам из 1000 человек больных алкоголизмом, опиатной наркоманией и доноров при использовании в качестве гаптена Орфанина, где *p<0,01 (в сравнении с донорами).

В таблице 3 приведены значения расчета чувствительности и специфичности метода при использовании заявляемого набора и одного из его компонентов (орфанина)

Оборудование и реагенты, необходимые при работе с набором:

- Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность раствора в лунках планшета при длине волны 450 нм;

- термостат суховоздушный, позволяющий поддерживать температуру +37±0,1°C;

- пипетки полуавтоматические одноканальные с переменным объемом со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости 2-20 мкл, 20-200 мкл, 200-1000 мкл;

- пипетка полуавтоматическая восьмиканальная с переменным объемом со сменными наконечниками, позволяющая отбирать объем жидкости 50-200 мкл;

- цилиндры мерные вместимостью 50 и 100 мл;

- колба мерная вместимостью 200 мл;

- флаконы стеклянные вместимостью 5,0 мл;

- ванночки для реагентов или стеклянные чашки Петри;

- бумага фильтровальная;

- вода дистиллированная;

- перчатки резиновые или пластиковые

Потенциальный риск применения набора - класс 2a.

Все компоненты набора, за исключением стоп-реагента (раствор серной кислоты), в используемых концентрациях не токсичны.

Раствор серной кислоты обладает раздражающим действием. При попадании на кожу и слизистые покровы следует смыть ее большим количеством проточной воды.

Пример 1. Набор, содержащий планшет, отдельные стрипы которого сенсибилизированы шестью различными антигенами (β-эндорфин, серотонин, дофамин, гистамин, орфанин, ангиотензин).

В состав набора входят:

- планшет 96-луночный разборный стрипованный, (состоящий из 12 столбиков-стрипов, в каждом из которых имеется 8-лунок с обозначением от A по H). с иммобилизованными конъюгированными антигенами β-эндорфина (стрипы №1-2), серотонина (стрипы №3-4), дофамина (стрипы №5-6), гистамина (стрипы №7-8), орфанина (стрипы №9-10) и ангиотензина (стрипы №11-12) - 1 шт.;

- положительный контрольный образец №1 (сыворотка крови человека, содержащая антитела к β-эндорфину), концентрированный - 1 фл. (0,05 мл);

- положительный контрольный образец №2 (сыворотка крови человека, - содержащая антитела к серотонину), концентрированный - 1 фл. (0,05 мл);

- положительный контрольный образец №3 (сыворотка крови человека, содержащая антитела к дофамину), концентрированный - 1 фл. (0,05 мл);

- положительный контрольный образец №4 (сыворотка крови человека, содержащая антитела к гистамину), концентрированный - 1 фл. (0,05 мл);

- положительный контрольный образец №5 (сыворотка крови человека, содержащая антитела к орфанину), концентрированный - 1 фл. (0,05 мл);

- положительный контрольный образец №6 (сыворотка крови человека, содержащая антитела к ангиотензину), концентрированный - 1 фл. (0,05 мл);

- отрицательный контрольный образец №1 (сыворотка крови человека, не содержащая антитела к β-эндорфину), концентрированный - 1 фл. (0,05 мл);

- отрицательный контрольный образец №2 (сыворотка крови человека, не содержащая антитела к серотонину), концентрированный - 1 фл. (0,05 мл);

- отрицательный контрольный образец №3 (сыворотка крови человека, не содержащая антитела к дофамину), концентрированный - 1 фл. (0,05 мл);

- отрицательный контрольный образец №4 (сыворотка крови человека, не содержащая антитела к гистамину), концентрированный - 1 фл. (0,05 мл);

- отрицательный контрольный образец №5 (сыворотка крови человека, не содержащая антитела к орфанину), концентрированный - 1 фл. (0,05 мл);

- отрицательный контрольный образец №6 (сыворотка крови человека, не содержащая антитела к ангиотензину), концентрированный - 1 фл. (0,05 мл);

- конъюгат антител против иммуноглобулинов человека, конъюгированных с пероксидазой из корня хрена, жидкий концентрированный - 1 фл. (0,5 мл);

- фосфатно-солевой буферный раствор, концентрированный, содержащий твин-20 (ФСБ-Т) - 2 фл. (по 10 мл);

- субстратный буферный раствор, концентрированный - 1 фл. (1,5 мл);

- раствор субстрата тетраметилбензидина (ТМБ) - 1 фл. (3,5 мл);

- серная кислота (стоп-реагент), 10% - 1 фл. (10 мл).

Подготовка реагентов для анализа

Растворение компонентов должно проводиться при комнатной температуре (+18-25°C) и периодическом перемешивании.

Для приготовления буферного раствора содержимое одного флакона с концентратом фосфатно-солевого буфера (ФСБ-Т) переносят в мерную колбу вместимостью 200 мл, дважды ополоскивают флакон дистиллированной водой, все промывные воды объединяют с разведенным ФСБ-Т и доводят общий объем до метки дистиллированной водой.

Приготовление растворов положительных контрольных образцов производят внесением 0,025 мл соответствующего концентрированного положительного контрольного образца антител соответствующего эндогенного биорегулятора, к 0,225 мл разведенного ФСБ-Т.

Приготовление растворов отрицательных контрольных образцов производят внесением 0,025 мл соответствующего концентрированного отрицательного контрольного образца, не содержащего антител соответствующего эндогенного биорегулятора, к 0,225 мл разведенного ФСБ-Т.

Приготовление раствора конъюгата антител против иммуноглобулинов человека проводят внесением во флакон 2,0 мл разведенного ФСБ-Т и добавлением к нему 0,02 мл концентрированного конъюгата антител к иммуноглобулинам человека.

Субстратно-хромогенную смесь готовят непосредственно перед применением внесением 0,2 мл концентрированного субстратного буферного раствора, разбавленного 1,8 мл дистиллированной воды, к 0,5 мл раствора субстрата ТМБ.

Стоп-реагент готов к использованию.

Подготовка планшета

Во все лунки планшета вносят по 0,2 мл разведенного ФСБ-Т, перемешивают потряхиванием в течение 5 сек и удаляют раствор декантированием. Промывание повторяют еще два раза. После последнего промывания удаляют остатки жидкости из лунок постукиванием планшета в перевернутом положении по фильтровальной бумаге.

Все образцы сыворотки крови разводят в 100 раз разведенным ФСБ-Т:

Пример 2. Проведение анализа:

Внесение отрицательного контрольного образца.

В лунки планшета A1, A2 вносят по 0,1 мл отрицательного контрольного образца №1

В лунки планшета A3, A4 вносят по 0,1 мл отрицательного контрольного образца №2

В лунки планшета A5, A6 вносят по 0,1 мл отрицательного контрольного образца №3

В лунки планшета A7, A8 вносят по 0,1 мл отрицательного контрольного образца №4.

В лунки планшета A9, A10 вносят по 0,1 мл отрицательного контрольного образца №5.

В лунки планшета A11, A12 вносят по 0,1 мл отрицательного контрольного образца №6

Внесение положительного контрольного образца.

В лунки планшета B1 и B2 вносят по 0,1 мл положительного контрольного образца №1

В лунки планшета B3 и B4 вносят по 0,1 мл положительного контрольного образца №2.

В лунки планшета B5 и B6 вносят по 0,1 мл положительного контрольного образца №3.

В лунки планшета B7 и B8 вносят по 0,1 мл положительного контрольного образца №4.

В лунки планшета B9 и B10 вносят по 0,1 мл положительного контрольного образца №5.

В лунки планшета B11 и B12 вносят по 0,1 мл положительного контрольного образца №6.

В оставшиеся лунки разборного планшета, состоящего из стрипов сенсибилизированных различными, указанными выше антигенами панели, внести для каждого из антигенов β-эндорфина, серотонина, дофамина, гистамина, орфанина и ангиотензина в дубликатах по 0,1 мл исследуемых образцов сывороток крови. Исследуемые образцы сыворотки крови и инкубируют в течение 1 ч при температуре +37°C. Затем содержимое всех лунок планшетов удаляют декантированием, лунки отмывают, и вносят в них по 0,1 мл раствора конъюгата антител против иммуноглобулинов человека. Через 1 ч содержимое лунок планшетов удаляют и отмывают указанным выше способом. После чего добавляют во все лунки планшетов по 0,1 мл субстратно-хромогенной смеси, приготовленной за 15 мин до окончания второй инкубации. Выдерживают планшеты при комнатной температуре (+18-25°C) в темном месте в течение 5-10 мин в зависимости от степени развития окраски и добавляют в них по 0,05 мл раствора стоп-реагента.

Измерение величины оптической плотности (ОП) в лунках планшетов проводят при длине волны 450 нм. Окраска содержимого планшета стабильна не более 1 ч при комнатной температуре в темном месте.

Учет результатов.

На основании результатов ИФА проводили анализ содержания иммуноглобулинов класса М (IgM) в индивидуальных сыворотках больных и здоровых доноров, определяя достоверное изменение уровня антител.

Исследуемый образец расценивают как сыворотку с нормальным содержанием антител к эндогенным биорегуляторам в том случае, если среднее значение оптической плотности в лунках с анализируемым образцом соответствует значению, рассчитанному по формуле:

ОПнорма=ОПотр±0,20,

где ОПнорма - среднее значение оптической плотности в лунке с анализируемым образцом,

ОПотр - среднее значение оптической плотности в лунке с отрицательным контрольным образцом (на основании обследования группы доноров, среднее значение оптической плотности изменяется в диапазоне от 0,55 до 0,65).

Исследуемый образец расценивают как сыворотку, отличающуюся от нормы по содержанию антител к эндогенным биорегуляторам, если значение оптической плотности в лунках с анализируемым образцом ниже 0,35 или выше 0,85.

Пример 3. ИФА определения антител к β-эндорфину, серотонину, дофамину, гистамину, орфанину и ангиотензину, где *p<0,01 при обследовании здоровых лиц.

При обследовании здоровых лиц (группа из 1000 человек), не имеющих диагноза заболевания зависимости, было установлено следующее процентное распределение по наличию антител в сыворотке крови к исследуемой панели антигенов.

Для дофамина у 7% пациентов превышение показателя 0,85 значения оптической плотности, а у 12% лиц этот параметр ниже 0,35 значения оптической плотности. Для других антигенов выявлена следующая закономерность. Для серотониа у 15% обследованных превышение, а для 6% понижение указанных показателей. Для β-эндорфина и орфанина наблюдалось следующее распределение: 16% и 15% человек имели уровни антител выше 0,85, а у 14% и 11% обследованных показатели уровня антител были ниже 0,35. Для гистамина и ангиотензина эти величины составили значения 11% и 8% повышение и 14% и 9% понижение соответственно.

Таким образом, в группе обследованных здоровых людей существует популяция с повышенным и пониженным уровнем антител к исследованным антигенам. Именно эти люди и представляют группу риска склонную к заболеваниям зависимости, т.к. у большинства больных при их обследовании мы обнаружили именно такие же показатели.

Минимальное содержание антител к β-эндорфину, серотонину, дофамину, гистамину, орфанину, ангиотензину, определяемое с помощью набора, указано в таблице 1 и составляет не более 3-6 мкг/мл.

Для практической оценки полученных результатов для клиники и возможности их использования в дальнейшем в качестве дополнительного диагностического критерия проведено сопоставление результатов ИФА определения естественных антител с УРП - уровнем реабилитационного потенциала. Полученные результаты указывают на корреляцию между различными формами болезней зависимости, определенными с помощью предлагаемого набора, и определенными с помощью УРП.

Пример 4. Иммуноферментный анализ (ИФА) определения антител к орфанину в сыворотке крови человека.

На основании результатов ИФА проводили сравнительный анализ содержания иммуноглобулинов класса М (IgM) в индивидуальных сыворотках больных и доноров, определяя достоверное изменение уровня антител (см. таблицу 2).

Как видно из таблицы, для больных опиатной наркоманией разница показателя оптической плотности анализирумого образца и эталонного значения показателя оптической плотности образцов крови здоровых доноров имеет положительные значения. Эти данные подтверждены клиническим диагнозом у 95% обследованных

Для больных алкоголизмом эта разница имеет отрицательные значения. Эти данные подтверждены клиническим диагнозом у 94% обследованных

Для больных игровой зависимостью в среднем по группе показатель значения оптической плотности в анализируемых образцах достоверно снижен по сравнению с показателем значения оптической плотности эталонных образцов сыворотки крови здоровых доноров. Эти данные подтверждены клиническим диагнозом у 97% обследованных.

Для больных токсикоманией эта разница имеет положительное значения и подтверждена клиническим диагнозом у 92% обследованных.

- Пример 5. ИФА определения антител к β-эндорфину, серотонину, дофамину, гистамину, орфанину и ангиотензину, где *p<0,01 при обследовании больных опийной наркоманией.

- При исследовании уровня антител в группе из 1000 больных опийной наркоманией установлено в среднем по группе превышение показателя 0,85 значения оптической плотности для дофамина у 92%, для орфанина у 95%, для β-эндорфина у 91%, для серотонина у 87% пациентов. Содержание антител к гистамину и ангиотензину было в пределах от 0,35 до 0,85 оптических единиц.

Таким образом, первоначальный диагноз-опийная наркомания - был подтвержден с помощью заявляемого набора по изменению уровня антител с помощью 4 маркеров

Пример 6. ИФА определения антител к β-эндорфину, серотонину, дофамину, гистамину, орфанину и ангиотензину, где *p<0,01 при обследовании больных алкогольной зависимостью.

- При исследовании уровня антител в группе из 1000 больных алкогольной зависимостью установлено в среднем по группе понижение показателя 0,35 значения оптической плотности для орфанина у 94%, для β-эндорфина у 96%, для ангиотензина у 81%, для дофамина у 80%, пациентов. Содержание антител к серотонину, гистамину было в пределах от 0,35 до 0,85 оптических единиц.

Таким образом, первоначальный диагноз- алкогольная зависимость - был подтвержден с помощью заявляемого набора по изменению уровня антител с помощью 4 маркеров

Пример 7. ИФА определения антител к β-эндорфину, серотонину, дофамину, гистамину, орфанину и ангиотензину, где *p<0,01 при обследовании больных токсикоманией.

- При исследовании уровня антител в группе из 1000 больных токсикоманией установлено в среднем по группе превышение показателя 0,85 значения оптической плотности для дофамина у 95%, для серотонина у 81%, для гистамина у 94% пациентов, понижение показателя 0,35 значения оптической плотности для орфанина у 90%, для β-эндорфина у 91%. Содержание антител к ангиотензину было в пределах от 0,35 до 0,85 оптических единиц.

Таким образом, первоначальный диагноз-токсикомания - был подтвержден с помощью заявляемого набора по изменению уровня антител с помощью 5 маркеров.

Пример 8. ИФА определения антител к β-эндорфину, серотонину, дофамину, гистамину, орфанину и ангиотензину, где *p<0,01 при обследовании больных гэмблингом (игроманией).

- При исследовании уровня антител в группе из 1000 больных игровой зависимостью установлено в среднем по группе понижение показателя 0,35 значения оптической плотности для β-эндорфина у 97% для орфанина у 91%, повышение показателя 0,85 значения оптической плотности для серотонина у 81%, для дофамина у 80%, пациентов. Содержание антител к ангиотензину, гистамину было в пределах от 0,35 до 0,85 оптических единиц.

Таким образом, первоначальный диагноз-гэмблинг - был подтвержден с помощью заявляемого набора по изменению уровня антител с помощью 4 маркеров.

Пример 9. ИФА определения антител к B-эндорфину, серотонину, дофамину, гистамину, орфанину и ангиотензину, где *p<0,01 при обследовании больных пищевой зависимостью.

- При исследовании уровня антител в группе из 1000 больных пищевой зависимостью установлено в среднем по группе превышение показателя 0,85 значения оптической плотности для дофамина у 85%, для серотонина у 80%, для гистамина у 89% пациентов, понижение показателя 0,35 значения оптической плотности для β-эндорфина у 79%. Содержание антител к орфанину, ангиотензину было в пределах от 0,35 до 0,85 оптических единиц.

Таким образом, первоначальный диагноз - пищевой зависимость - был подтвержден с помощью заявляемого набора по изменению уровня антител с помощью 4 маркеров.

Расчет чувствительности и специфичности метода

Результаты исследования образцов сыворотки крови пациентов с различными заболеваниями зависимости, полученные при использовании реагентов, сравнивали с результатами диагностического заключения врача-специалиста, внесенными в истории болезни каждого испытуемого больного. На основании полученных данных рассчитывали чувствительность и специфичность метода. При этом в каждой группе определяли количество больных с ложноположительным, ложноотрицательным и истинно положительным и отрицательным результатом. Расчет проводили по формулам.

1 Число истинно положительных результатов теста.

3 Число ложноположительных результатов теста.

4 Число ложноотрицательных результатов теста.

5 Чувствительность метода: $$\text{Ч}=\frac{\text{ИП}}{\text{ИП}+\text{ЛО}}\cdot \text{100\%}$$ .

6 Специфичность метода: $$\text{С}=\frac{\text{ИО}}{\text{ИО}+\text{ЛП}}\cdot \text{100\%}$$ .

При использовании панели антигенов, входящих в состав Набора, получены следующие результаты (см. таблицу 3). Для сравнения в таблице приведены результаты расчета аналогичных показателей при использовании только одного маркера (орфанина).

Как видно из приведенных данных при обследовании больных имеющих различные заболевания зависимости мы получаем показатели чувствительности и специфичности метода иммуноферментного определения антител к эндогенным биорегуляторам в сыворотке крови с помощью заявляемого набора превышающих аналогичные, получаемые с помощью отдельных эндогенных биорегуляторов.

Таким образом, приведенные примеры подтверждают, что предлагаемый спектр реагентов для иммуноферментного определения антител к эндогенным биорегуляторам в сыворотке крови позволяет выявить произошедшие изменения в уровне антител при различных формах болезненных зависимостей с высокой точностью (достоверностью), в то время как использование только одного или нескольких маркеров из перечисленного набора может привести к искажению диагноза.

Таблица 1 Чувствительность определения антител к β-эндорфину, мкг/мл, не более 3,0 Чувствительность определения антител к серотонину, мкг/мл, не более 4,0 Чувствительность определения антител к дофамину, мкг/мл, не более 3,5 Чувствительность определения антител к гистамину, мкг/мл, не более 5,0 Чувствительность определения антител к орфанину, мкг/мл, не более 4,0 Чувствительность определения антител к ангиотензину, мкг/мл, не более 6,0

Таблица 2 Группа больных и доноров Значение OD₄₅₀ Орфанина в ИФА в среднем по группе Кол-во чел. с подтвержденным диагнозом % Больные опиатной наркоманией 1,34±0,056 95 Больные алкоголизмом 0,43±0,065 94 Больные игровой зависимостью 0,31±0,050 97 Больные пищевой зависимостью 0,61±0,071 Не определяются Больные токсикоманией 0,39±0,070 92 Доноры (эталон) 0,59±0,021   σ=0,029 - р<0,01 (в сравнении с донорами).

Таблица 3 Заболевания зависимости Опийная наркомания Алкогольная зависимость Игровая зависимость Токсикома-
ния Пищевая зависимость Чувствительность метода при использовании заявляемого набора, % 98 95 95 96 95 Специфичность метода при использовании заявляемого набора, % 100 100 100 100 100 Чувствительность метода при использовании орфанина, % 95,1 93,8 90,2 94,2 Не определяется Специфичность метода при использовании орфанина, % 93,2 92,5 93,7 95,1 Не определяется

Изобретение относится к области медицины. Предложен набор реагентов для иммуноферментного определения антител к эндогенным биорегуляторам в сыворотке крови для выявления заболеваний зависимости методом двухстадийного иммуноферментного анализа в сыворотке крови человека in vitro. Набор включает 96-луночный разборный стрипованный планшет с нанесенными на его поверхность последовательно всеми конъюгатами из ряда: β-эндорфин, серотонин, дофамин, гистамин, орфанин и ангиотензин; а также емкости, содержащие положительные и отрицательные контрольные образцы, антивидовые антитела против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой из корня хрена, фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий твин-20, субстратный буферный раствор, раствор субстрата тетраметилбензидина и стоп-реагент. Изобретение обеспечивает повышение точности определения заболеваний зависимости, в том числе алкоголизма, наркомании, токсикомании, пищевой зависимости и гэмблинга (игромания), за счет использования набора из шести маркеров. 3 табл., 9 пр.

Набор реагентов для иммуноферментного определения антител к эндогенным биорегуляторам в сыворотке крови для выявления заболеваний зависимости методом двухстадийного иммуноферментного анализа в сыворотке крови человека in vitro, представляющий собой комплект в одной коробке, содержащий, по крайней мере, один 96-луночный разборный стрипованный планшет с нанесенными на его поверхность последовательно всеми конъюгатами из ряда: β-эндорфин, серотонин, дофамин, гистамин, орфанин и ангиотензин; а также емкости, содержащие положительные контрольные образцы сыворотки крови человека, содержащие антитела к перечисленным выше коньюгатам, отрицательные контрольные образцы сыворотки крови человека, не содержащие антитела к перечисленным выше соединениям, антивидовые антитела против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой из корня хрена, фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий твин-20, субстратный буферный раствор, раствор субстрата тетраметилбензидина и стоп-реагент.