ШТАММ BIFIDOBACTERIUM LONGUM Я4, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КИСЛОМОЛОЧНЫХ, ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ И НЕФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, ЗАКВАСОК, ГИГИЕНИЧЕСКИХ И КОСМЕТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК И БАКТЕРИЙНЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A23L1/29 A23C9/12 

Изобретение относится к пищевой, косметической, биотехнологической и медицинской промышленности, в частности, используется для приготовления кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов.

В связи с неблагоприятными экологическими условиями, стрессами, длительной антибактериальной, лучевой и химиотерапией, дисбиозами, возникающими вследствие перенесенных заболеваний, увеличивается количество людей, страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. Для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, обладающим пробиотическим действием, так и пищевым продуктам, содержащим бифидобактерии.

В кишечнике человека встречаются 5 видов бифидобактерий - B.bifidum, B. longum, B.adolescentis, B.breve и B.infantis. С наибольшей частотой в биоценозе обнаруживаются виды B.bifidum, B.longum и B.adolescentis (39-75%), причем два последних преобладают у взрослых людей, а виды B.breve и B.infantis - преимущественно у детей грудного возраста (17-36%).

Известны зарубежные моно- и комплексные препараты - эубиотики и кисломолочные продукты, включающие в свой состав бифидобактерии видов B.bifidum, B. longum, B.adolescentis, B.breve (патент 2336886, патент 2411008, Франция; патент 637297, Швейцария; патент 2134179, патент 2421066 ФРГ; патент 05227946, патент 0430642, Япония; патент 4645667, США).

У нас в стране для приготовления бактерийных препаратов и продуктов лечебно-диетического питания применяют отечественные штаммы бифидобактерий видов B.bifidum 1; 791; ВКПМ S-1257, Ac-1578; B.longum В379М; B.adolescentis MC-42 (авторское свидетельство 343588, патент РФ 1347221, патент 849779, патент РФ 2108383, патент РФ 2152993, патент 863639).

Качество лечебных продуктов и препаратов во многом обусловлено свойствами штамма-продуцента - его специфической активностью и технологичностью. Большой ассортимент биологически активных и технологичных штаммов бифидобактерий делает возможной разработку новых моно- и комплексных продуктов лечебного питания и бакпрепаратов, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека, восстановить его нормальную микрофлору и снизить заболеваемость различными кишечными инфекциями.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов вида B.longum с высокой биологической активностью, устойчивостью к условиям внешней среды, обладающего стабилизирующим кислотообразованием во всем температурном диапазоне развития клеток, хорошо сквашивающего молоко и быстро размножающегося на искусственных питательных средах.

Поставленная задача решается путем использования штамма Bifidobacterium longum Я4 для получения кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов.

Штамм Bifidobacterium longum Я4 выделен из содержимого кишечника здорового взрослого человека и депонирован в музее микроорганизмов ГУ МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского под 169. Заявляемый штамм может быть использован при производстве кисломолочной продукции, ферментированных пищевых продуктов, например: квас, пиво и т.п., неферментированных пищевых продуктов, например: соки, напитки и т.п., заквасок для приготовления кисломолочной продукции и биологически активных добавок к пище. Так же штамм Bifidobacterium longum Я4 может широко использоваться для производства гигиенических и косметических средств, например: кремов, лосьонов, салфеток, мыла, присыпок, тампонов, питательных масок, гелей, женских прокладок, косметического молочка, различных пудр и т.д.

Кроме того, штамм Bifidobacterium longum Я4 может быть использован и при производстве бактериальных препаратов, в виде свечей, пероральных и других средств.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов, которые в качестве действующего начала содержат штамм Bifidobacterium longum Я4, обладающий кислотообразующей и антагонистической активностью в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры, что обеспечивает нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов, а также расширение арсенала аналогичных средств.

Культурально-морфологические свойства штамма
Клетки представляют собой гр+ полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2-х концах, в жидких питательных средах растут по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Отдельно выросшие колонии на печеночной питательной среде имеют шаровидную, крошкообразную форму колоний. Логарифмическая фаза роста заканчивается к 12-24 ч.

Физико-биохимические свойства штамма
Бесспоровый, неподвижный анаэроб. Оптимальная температура выращивания 37-39^oC. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L + молочной кислот, без образования газа, закисляя среду выращивания до рН 4,1-3,9. Ферментирует лактозу, арабинозу, ксилозу, вариабельно целлобиозу, маннозу, сорбит, инозит, салицин. Штамм сквашивает молоко к 12-24 ч с образованием сгустка.

Штамм активно наращивает микробную массу при росте на гидролизатно-молочной среде (ГМ), Бифидум-среде (БФ), продуцируя кислоты (таблица 1 приведена в конце описания).

Штамм максимально накапливает микробную массу к 12-24 ч, достигая в 1 мл lg 8-9 микробных клеток. Штамм проявляет антагонистическое действие в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры (таблица 2 приведена в конце описания).

Таким образом, предлагаемый штамм B.longum Я4 технологичен, поскольку активно размножается в питательной среде с накоплением производственной биомассы в короткие, 12-24 ч, сроки культивирования с высокой концентрацией бифидобактерий; обладает кислотообразующими и ингибирующими свойствами в отношении патогенной и гнилостной микрофлоры. Кроме того, изучение спектра чувствительности к антибактериальным препаратам выявило, что штамм устойчив к тетрациклину, левомицитину; чувствителен к антибиотикам пенициллинового ряда, кефзолу, гентамицину.

Кисломолочные, ферментированные, неферментированные пищевые продукты, гигиенические, косметические средства, биологически активные добавки и бактерийные препараты, содержащие штамм B.longum Я4, могут найти широкое применение в пищевой, медицинской, биотехнологической и косметической промышленности.

Способность штамма B.longum Я4 наращивать биомассу в питательной среде в короткие сроки культивирования, его антагонистическая, кислотообразующая активность, а также и другие полезные для организма человека свойства, делают возможным использование штамма в составе различных корригирующих средств лечебно-профилактического назначения.

Пример 1. Использование штамма B.longum Я4 в составе биологически активных добавок
1 пассаж: лиофилизированный штамм Я4 в количестве 0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при температуре 37-38^oC до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру из 10^-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 37-38^oC в течение 12-24 ч до образования густого роста с видимой зоной аэробиоза.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38^oC до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10⁸/мл.

В результате получают биологически активную добавку, которая представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10⁸/мл, содержанием бифидобактерий.

Пример 2. Использование штамма В.longum Я4 для приготовления неферментированных пищевых продуктов
1 пассаж: лиофилизированный штамм Я4 в количестве 0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при 37-38^oC до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру из 10^-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 37-38^oC в течение 12-24 ч до образования густого роста с хорошо видимой зоной аэробиоза.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38^oC до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10⁸/мл.

Получение неферментированного пищевого продукта: выросшую биомассу вносят в пищевое сырье (молоко, соки, и пр.), перемешивают и разливают в емкости. В результате получают продукт с концентрацией живых бифидобактерий не менее 10⁶/мл.

Пример 3. Использование штамма бифидобактерий Я4 для приготовления кисломолочного продукта
1 пассаж: лиофилизированный штамм вносят в среду культивирования и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при 37-38^oC до образования видимого роста в последних разведениях. Или сухую лиофилизированную биомассу бифидобактерий вносят в количестве 1-2 дозы в пробирку с 30 мл питательной среды. Культивируют при температуре 37-38^oC до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10⁷/мл.

2 пассаж: выросшую культуру штамма Я4 из последних разведений или из пробирки с выросшей биомассой вносят в среду накопления объемом до 10% и культивируют при температуре 37-38^oC до получения биомассы с содержанием бифидобактерий не менее 10⁸/мл.

3 пассаж: полученную биомассу штамма Я4 в объеме до 10% вносят в стерильное молоко, культивируют до образования сгустка (кисломолочный продукт). Количество пассажей 2 может быть увеличено в зависимости от объема производства.

Пример 4. Использование штамма бифидобактерий Я4 для получения бактерийных препаратов
Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 37-38^oC до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 10⁸/мл. К полученной биомассе добавляют защитные среды высушивания (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко). Полученную суспензию разливают в ампулы, флаконы и другие емкости, замораживают при температуре минус 35-45^oC и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат содержит не менее 10⁷ живых клеток бифидобактерий. Данное содержание бифидобактерий согласуется с научно-технической документацией на аналогичный бифидосодержащий препарат - бифидумбактерин сухой (ФС 42 132 ВС-94) и является достаточным для использования полученного средства в качестве препарата - эубиотика.

Пример 5. Использование штамма бифидобактерий Я4 для получения гигиенических и косметических средств
Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 37-38^oC до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 10⁸/мл.

Получение продукта: выросшую биомассу бифидобактерий штамма Я4 вводят в состав гигиенического или косметического средства.

Изобретение относится к пищевой, косметической, биотехнологической и медицинской промышленности. Штамм Bifidobacterium longum Я4 выделен из содержимого кишечника здорового взрослого человека, активно размножается в питательной среде с накоплением производственной биомассы в короткие, 12-24 ч, сроки культивирования с высокой концентрацией бифидобактерий; обладает кислотообразующими и ингибирующими свойствами в отношении патогенной и гнилостной микрофлоры. Штамм устойчив к тетрациклину, левомицитину; чувствителен к антибиотикам пенициллинового ряда, кефзолу, гентамицину. Это позволяет получить кисломолочные, ферментированные и неферментированные пищевые продукты, закваски, гигиенические и косметические средства, биологически активные добавки и бактерийные препараты, обеспечивающие нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов, а также расширение арсенала аналогичных средств. 2 табл.

Штамм Bifidobacterium longum Я4 (коллекционный 169 государственной коллекции микрофлоры человека ГКНМ ГУ МНИИЭМ МЗ РФ им. Г. Н. Габричевского), используемый для получения кисломолочных, ферментированных и неферметированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов.