ШТАММ БАКТЕРИЙ BIFIDOBACTERIUM LONGUM Z4 ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙНЫХ ПРЕПАРАТОВ, НОРМАЛИЗУЮЩИХ МИКРОФЛОРУ ПРИ НАРУШЕНИЯХ МИКРОБИОЦЕНОЗА ВЛАГАЛИЩА Российский патент 2000 года по МПК A61K35/74 C12N1/20 

Настоящее изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к акушерско-гинекологической практике, в частности, может быть использовано при изготовлении лечебных препаратов для нормализации микрофлоры при нарушениях микробиоценоза влагалища.

Известно, что исследования в области нормализации нарушений микробиоценоза влагалища сконцентрированы прежде всего на разработке препаратов-пробиотиков на основе лактобацилл. Эти бактерии являются главной, но не единственной составляющей индигенной "протективной" микрофлоры урогенитального тракта, чем, вероятно, объясняется недостаточный клинический эффект от применения монопрепаратов лактобацилл (Baerheim A. et al. Vaginal application in the prophylaxis reccurent lower urinary tract in women. Scandinavian Journal of Primary Health Care. 1994. vol. 12. p. 239-243). Известно также, что коммерчески доступные бактерийные препараты, используемые для коррекции микрофлоры влагалища, не отвечают требованиям, предъявляемым к эффективному препарату-пробиотику (Viki L. Hughes et al. Microbiologic Characteristics of Lactobacillus Products Used for Colonization of the Vagina. Obstetrics and Gynecology. 1990, vol. 75, p. 244-248), или требуют назначения длительных (до 1 года) курсов лечения для обеспечения клинического эффекта (Hilton Е. et al. Annals of Internal Medicine. American College of Physicians. 1992, 116:353-357).

Известны также попытки некоторых отечественных исследователей использовать для санации полости влагалища у беременных и гинекологических больных коммерческих препаратов. Очевидным недостатком промышленно выпускаемых препаратов, содержащих кишечные штаммы бифидобактерий, является их низкая адгезивность, тогда как наличие данной способности рассматривается как необходимое условие для приживления бактерий в данной экологической нише (Reid G. et. al. Implantation of Lactobaccillus casei var rhamnosus into vagina. Lancet. 1994, p. 1229).

Данные о разработке и применении препаратов-пробиотиков на основе индигенных бифидобактерий влагалища при лечении неспецифических бактериальных вагинозов в доступной нам литературе отсутствуют.

Целью изобретения является получение штамма бифидобактерий, используемого в производстве бактерийного препарата для нормализации нарушений микробиоценоза влагалища.

Эта цель достигнута тем, что из влагалища здоровой женщины репродуктивного возраста был выделен штамм Bifidobacterium longum Z4, обладающий повышенной адгезивной активностью по отношению к влагалищным эпителиоцитам, значительной антагонистической активностью и кислотообразующей функцией, естественной устойчивостью к ряду антибиотиков.

Штамм депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов института "ВНИИ генетика" под номером Ас-1571 и характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические свойства.

При культивировании в столбике 0,75%-ного агара Блаурокка образует колонии в виде гречишных зерен или дисков размером до 0,5 -1 мм в диаметре в течение 2-х суток. При культивировании в жидкой среде Блаурокк в анаэробных условиях образует равномерное помутнение через 24 часа. На плотной среде Блаурокк в анаэробных условиях растет в виде колоний S-типа, круглые с ровными краями, диаметром 2-3 мм, непрозрачные, блестящие, пигмента не образуют; профиль колоний выпуклый, легко снимаются петлей с поверхности плотной среды.

В мазках клетки расположены в форме "китайских иероглифов", имеют вид прямых или разветвленных палочек с У-образными раздвоениями на одном или обоих концах, иногда образуют утолщения на концах. Неподвижны, в мазке располагаются беспорядочно. Грамположительны, иногда внутри клеток выявляется зернистость. Спор не образуют.

Физиологические свойства.

Облигатный анаэроб; растет в высоком столбике агара в пробирке, в пробирках с жидкой средой и на чашках Петри с плотной средой в анаэробных условиях. При культивировании в жидкой среде в анаэробных условиях через 18-20 часов после посева в 1 мл среды вырастает 5,0 • 10⁸ - 1,0 • 10⁹ живых микробных клеток. Максимум роста при 37,5^oC.

Биохимические признаки.

Синтезирует фермент фруктозо-6-фосфатфосфокеталазу.

Сбраживает глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, ксилозу, арабинозу, мелизитозу, рафинозу.

Не сбраживает глицерол, рамнозу, манитол, салицин, целобиозу, манозу, сорбитол, трегалозу.

Не образует индол и каталазу, не восстанавливает нитраты.

Кислотообразование при выращивании в среде Блаурокк через 72 часа - 71,8^o (по Тернеру).

Чувствительность к антибиотикам и антагонистическая активность представлена в таблице 1.

Лабораторная проверка показала непатогенность штамма Bifidobacterium longum Z4 для экспериментальных животных (мышей), а также для людей (в опытах на добровольцах).

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Изучение адгезивной способности Bifidobacterium longum Z4 на эпителиоцитах влагалища здоровых женщин. Получали вагинальный эпителий от трех здоровых женщин, центрифугировали его при 420 g 10 мин, осадок ресуспензировали в McIvaine's буфере (pH 5,4), на основе 0,1H С₆H₈O₇ и 0,2H NaH₂PO₄, и вновь центрифугировали. Центрифугирование повторяли пять раз. Затем готовили суспензию эпителиоцитов с концентрацией 1,0•10⁵ клеток/мл.

16-часовую культуру бифидобактерий центрифугировали два раза при 1700 g 10 минут в том же буфере, что и эпителиоциты. Готовили взвесь бактерий в концентрации 1,0 • 10⁸ м. т./мл. Суспензии бифидобактерий и эпителиоцитов смешивали в равных объемах (по 0,5 мл) в пробирках. Смесь инкубировали при +37^oC 2 часа (при постоянном легком горизонтальном помешивании). Затем смесь бифидобактерий и эпителиоцитов центрифугировали при 420 g 5 мин пять раз. Осадок ресуспензировали в 1 мл буфера, на предметном стекле готовили мазок, высушивали на воздухе, фиксировали в метаноле 15 мин и окрашивали по Граму, после чего подсчитывали общее количество бифидобактерий, прикрепившихся на поверхности 100 эпителиоцитов. В качестве контроля использовали штамм B. bifidum 791, выделенный из фекалий здорового взрослого человека и использующийся для приготовления препарата "Кисломолочный бифидумбактерин".

Адгезивная активность бифидобактерий оценивалась по среднему числу бактерий, прикрепившихся к одному эпителиоциту.

Установлено, что количество бифидобактерий штамма Bifidobacterium longum Z4, адгезировавшихся на 1 эпителиоцит, составило 23,4±1,1, а количество бифидобактерий штамма B.bifidum 791 кишечного происхождения - 2,6±0,2 (см. табл. 2).

Таким образом, штамм Bifidobacterium longum Z4 обладает более высокой адгезивной способностью к вагинальным эпителиоцитам с возможностью более длительного и стойкого приживления в генитальном тракте женщины, чем штамм кишечного происхождения.

Пример 2. Изучение непатогенности, апирогенности и антагонистической активности штамма Bifidobacterium longum Z4 в кишечнике добровольца.

Женщина в возрасте 34 лет в течение 7 дней получала штамм Bifidobacterium longum Z4 в дозе 1,0•10⁹ клеток в сутки. Производили оценку общего состояния, температуры утром и вечером в течение всего периода приема суспензии микроорганизмов. Кроме того, провели бактериологическое исследование содержимого толстой кишки перед началом и на второй день после окончания приема взвеси бифидобактерий.

В течение всего периода наблюдений штамм Bifidobacterium longum Z4 не вызывал никаких побочных действий, жалоб обследуемая не предъявляла, температура тела оставалась нормальной, сон и аппетит не нарушались, диспептических расстройств не было.

Анализ данных бактериологического исследования выявил позитивные сдвиги в количественном составе микроорганизмов, присутствующих в кишечнике добровольца. Отмечалось снижение уровня H₂S(+) лецитиназонегативных клостридий с 3,0•10⁵ микробных клеток/грамм кишечного содержимого (м. т./г) до < 10⁴ м. т. /г, неспорообразующих анаэробов: Bacteroides spp. с 1,8•10¹¹ м. т./г до 1,36•10⁹ м. т. /г, Fusobacterium spp. с 3,0•10⁹ м. т./г до < 10⁸ м. т./г; энтерококков с 8,1•10⁵ м. т./г до 3,0•10⁵ м. т./г.

Таким образом, штамм Bifidobacterium longum Z4 является непатогенным и апирогенным для человека и обладает антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам не только in vitro, но и in vivo.

Пример 3. Изучение влияния штамма Bifidobacterium longum Z4 на микрофлору генитального тракта женщины.

Лиофильно высушенный штамм Bifidobacterium longum Z4 вводился на тампоне per vaginum женщине Ф., 24 лет, в течение 10 дней в дозе 10⁸ (перед применением лиофилизат разводился в 5 мл остуженной кипяченой воды). Бактериологическое исследование влагалищного отделяемого осуществлялось до и после применения микроорганизмов.

Анализ данных бактериологического исследования выявил выраженные позитивные сдвиги в качественном и количественном составе микроорганизмов, присутствующих во влагалище обследуемой женщины. Наиболее значительные из них - увеличение уровня лактобацилл (с 4,0•10³ м. т./г до 1,6•10⁵ м. т./г.

Одновременно с повышением количества лактобацилл отмечалось уменьшение уровня гемолизинпродуцирующих Streptococcus spp. с 3,25 •10⁸ м. т./г до 1,8•10⁶ м. т./г, негемолизинпродуцирующих Streptococcus spp. с 2,75•10⁷ м.т. /г до 1,6•10⁶ м.т./г, H₂S (+) лецитиназонегативных клостридий с 3,0•10² м. т./г до < 10² м. т./г, гемолизинпродуцирующих Staphylococcus spp. с 8,7 •10³ м. т./г до < 10² м. т./г и Staphylococus aureus с 5,0•10² м. т./г до< 10² м. т./г.

Таким образом, применение штамма Bifidobacterium longurn Z4, выделенного из влагалища здоровой женщины репродуктивного возраста, вызывает позитивные изменения вагинальной микрофлоры in vivo, проявляющиеся повышением уровня одних из основных представителей микрофлоры генитального тракта, а именно - лактобацилл, и снижением уровня условно-патогенных микроорганизмов, что обеспечивает выраженную коррекцию дисбиотических нарушений вагинальной микрофлоры и восстановление доминирующего положения молочнокислых бактерий.

Несмотря на кажущуюся простоту, восстановление микрофлоры вагинального тракта за счет использования препаратов-пробиотиков представляет собой сложную микробиологическую и гинекологическую проблему. Выделение из влагалища здоровой женщины перспективного для производства штамма бифидобактерий и изучение его свойств является плодом длительной исследовательской работы, в результате которой впервые получен штамм Bifidobacterium longum Z4, обладающий высокой адгезивной способностью к вагинальным эпителиоцитам, естественной резистентностью к ряду антимикробных препаратов, антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам не только in vitro, но и in vivo. Штамм проверен на непатогенность и апирогенность для животных и человека. Все эти свойства дают возможность использовать штамм Bifidobacterium longum Z4 в качестве препарата-пробиотика в клинике для профилактики и лечения нарушений микрофлоры женского генитального тракта.

Штамм Bifidobacterium longum Z4 полностью готов к использованию.

Изобретение относится к биотехнологии и может применяться в акушерско-гинекологической практике в качестве препарата-пробиотика для коррекции нарушений микробиоценоза генитального тракта женщин. Штамм выделен из влагалища здоровой женщины репродуктивного возраста, способен активно ингибировать условно-патогенные микроорганизмы in vitro и in vivo, является кислотообразователем и обладает выраженной адгезивностью к вагинальным эпителиоцитам. Bifidobacterium longum Z4 не патогенен и апирогенен для людей и животных, нормализует микрофлору генитального тракта женщин. 2 табл.

Штамм-бактерий Bifidobacterium longum Z4 (Центральный музей промышленных микроорганизмов института "ВНИИ генетика" N Ас-1571), используемый для приготовления бактерийных препаратов, нормализующих микрофлору при нарушениях микробиоценоза влагалища.