НАБОР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СУЛЬФАТВОССТАНАВЛИВАЮЩИХ БАКТЕРИЙ И ПОДБОРА БАКТЕРИЦИДА ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА СУЛЬФАТВОССТАНАВЛИВАЮЩИХ БАКТЕРИЙ Российский патент 2003 года по МПК C12Q1/06 G01N33/569 

Изобретение относится к технической микробиологии и может быть использовано в нефтяной промышленности при исследовании нефтепромысловых сред на содержание в них сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ) и подбора бактерицидов для подавления роста СВБ.

При выполнении любой методики количественного определения веществ необходимо приготовление исходных реагентов или устройств для дальнейшего проведения серии последовательных операций в соответствии с методикой. Приготовление исходных реагентов требует точности измерений количества входящих компонентов, условий стерильности и высокой квалификации от исполнителей. Поэтому для многих используемых методик соответствующие исходные реагенты или устройства изготавливают в специализированных лабораториях и продают в виде наборов.

Известен набор для определения первичных ароматических аминов в растворах и биологических жидкостях, включающий 4 флакона с различными химреагентами и 1 флакон с полосками хроматографической бумаги (патент РФ 2097762, МКИ G 01 N 33/48, публ. 1997 г.).

Известен набор для измерения концентрации анализируемого вещества в биологических жидкостях, содержащий прибор для измерения концентрации анализируемого вещества в образце биологической жидкости, которая наносится на поверхность пористой мембраны с анализируемым веществом, и удлиненный контейнер для содержания множества устройств (заявка РФ 97113750, МКИ G 01 N 33/48, публ. 1998 г.).

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является набор, включающий стерильные флаконы для отбора проб и с питательной средой, снабженные стерильными резиновыми пробками, шприц для дозированного отбора или ввода исследуемой среды, емкость с этиловым спиртом, вату и упаковку с универсальной индикаторной бумагой для определения рН среды. Известный набор используется для проведения методики контроля микробиологической зараженности нефтепромысловых вод и оценки защитного и бактерицидного действия реагентов (РД 39-3-973-83. Министерство нефтяной промышленности. ВНИИСПТнефть, 1984 г. , с. 6). Для применения данной методики лаборатория должна быть оснащена необходимыми материалами и оборудованием. Также для проведения данной методики требуются питательные среды, содержащие разнообразные соли и добавки. Приготовление питательных сред, их фасовка во флаконы и обеспечение герметичности закупорки флаконов требует создания условий стерильности. Такой возможностью обладают лишь хорошо оснащенные лаборатории с квалифицированными сотрудниками. Поэтому для выявления СВБ и подбора бактерицида для подавления роста СВБ необходимо промысловую жидкость везти в лабораторию для проведения анализов, что значительно снижает эффективность исследований, приводит к удорожанию и требует затраты времени.

В основу настоящего изобретения положена задача создания набора для выявления СВБ и подбора бактерицида для подавления роста СВБ, позволяющая определить степень зараженности нефтепромысловых вод СВБ, а также оценить защитное действие бактерицидов против микробиологической коррозии.

Поставленная задача решается путем создания набора для выявления СВБ и подбора бактерицида для подавления роста СВБ, содержащего стерильные флаконы для отбора проб и с питательной средой, снабженные стерильными резиновыми пробками, шприц для дозированного отбора или ввода исследуемой среды, емкость с этиловым спиртом, вату и упаковку с универсальной индикаторной бумагой для определения рН среды, флаконы дополнительно снабжены поверх резиновых пробок колпачками из алюминиевой фольги для повышения стерильности и удобства хранения, которые закреплены на флаконах кремпером, причем набор дополнительно содержит флакон с раствором щелочи и флакон с раствором соляной кислоты для создания нейтральной среды и карандаш для маркировки флаконов.

Набор содержит стерильные флаконы с питательной средой по 9 мл в каждом флаконе и шприцы объемом 1 мл от 100 до 1000 штук.

Комплектование такого набора позволяет использовать его как в лабораторных условиях, так и непосредственно на месте отбора нефтепромысловой жидкости, эффективно провести исследования и подобрать бактерицид применительно к данным пластовым условиям. Набор компактен, удобен для перевозки.

Флаконы с питательной средой готовят заранее по утвержденной методике. Наиболее благоприятной средой для выявления СВБ, накопления и поддержания с целью сохранения жизнеспособности клеток является среда Постгейта, содержащая разнообразные соли, которые растворяют в 1 литре водопроводной воды и стерилизуют. После стерилизации основной раствор питательной среды обескислороживают кипячением и последующим быстрым охлаждением под струей водопроводной воды. Затем вводят добавки с соблюдением правил стерильности. Затем простерилизованную питательную среду разливают пипеткой в количестве 9 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают стерильной резиновой пробкой и колпачками из алюминиевой фольги, которые закрепляют на флаконах кремпером. Готовые флаконы стерилизуют в автоклаве при температуре 121^oС в течение 20 минут. После остывания флаконы с питательной средой готовы для проведения исследований. Оптимальной для роста СВБ является рН, равная 7,0-7,2. Для определения рН среды используют универсальную индикаторную бумагу. Если рН среды изменилась в сторону подкисления или подщелачивания, то используют соответственно 5% раствор NaHCO₃ или 1% раствор НСl, которые вводят во флаконы в количестве 0,01 мл. Для проведения качественных исследований набор содержит от 100 до 1000 флаконов с питательной средой. К каждому флакону прикладывается стерильный шприц объемом 1 мл.

Вначале отбирают пробы исследуемой нефтепромысловой жидкости в пустые стерильные флаконы. Шприцем отбирают 1 мл исследуемой жидкости и вводят во флаконы с питательной средой. Флакон встряхивают, затем из него отбирают 1 мл жидкости и вводят во 2-й флакон с питательной средой. Обычно для обработки 1 пробы исследуемой жидкости используют 14-20 флаконов и соответственно 14-20 шприцев. Таким образом ведут посев до заполнения всех флаконов. Посев каждой пробы проводят не менее чем в 2-х повторениях. После окончания посева на флаконах делают запись с указанием времени и места отбора проб.

Посевные флаконы выдерживают в течение 15 суток при температуре 30-32^oС. Рост и развитие клеток СВБ сопровождается образованием сероводорода и хорошо видимого черного осадка - сульфида железа. Количество клеток СВБ в исходной пробе оценивают по последнему флакону, в котором наблюдают рост СВБ - образование черного осадка. Считают, что в последнем флаконе с черным осадком первоначально присутствовала 1 бактериальная клетка.

Количество бактерий в 1 мл исходной пробы воды рассчитывают по формуле
M=10П/V;
где М - количество бактериальных клеток, содержащихся в 1 мл исходной пробы;
10 - коэффициент разведения;
П - порядковый номер последнего разведения (флакона), где наблюдался рост бактерий;
V - объем взятой для посева воды (1 мл).

Подбор бактерицида для подавления роста СВБ проводят в 2 этапа - на выделенной накопительной культуре и на промысловой воде следующим образом. В ряд флаконов с питательной средой дозируют шприцем раствор испытуемого реагента - бактерицида с таким расчетом, чтобы его концентрация в пересчете на объем флакона составляла: 250, 200, 150, 100, 50, 25 мг/л. Флакон с выращенной культурой СВБ встряхивают, выдерживают до оседания осадка и отбирают шприцем 0,5 мл надосадочной жидкости и вводят во флаконы с питательной средой и бактерицидами. Флаконы перемешивают, маркируют и выдерживают при температуре 30-32^oС в течение 15 суток. Для каждой концентрации бактерицида проводят три параллельных испытания. Два флакона без добавки бактерицида служат контрольной пробой. По истечении 15 суток эффективными считаются те реагенты, которые не дают потемнения или слегка окрашенные.

Реагенты, показавшие положительный эффект, испытывают на промысловой воде, зараженной СВБ.

Промысловую жидкость отбирают в стерильные флаконы, быстро дозируют определенное количество реагента и выдерживают от 2-х до 24 часов при температуре 30-32^oС. Затем стерильным шприцом отбирают 1-2 мл пробы и вводят во флаконы с питательной средой. Проводят 3 параллельных опыта. Через 15 суток определяют содержание сероводорода в опытных и контрольных пробах.

Эффективность подавления СВБ рассчитывают по формуле
S=(C-C₁)/C•100%,
где С - содержание сероводорода в контрольной пробе, мг/л;
C₁ - содержание сероводорода в исследуемой пробе, мг/л.

Эффективным считается такой реагент и такой концентрации, при котором степень подавления роста СВБ не менее 90%.

Новая совокупность заявленных существенных признаков позволяет получить новый технический результат, а именно готовить наборы для выявления СВБ и подбора бактерицида для подавления роста СВБ, позволяющие быстро и качественно провести исследования непосредственно в нефтепромысловых условиях.

Анализ известных технических решений, отобранных в процессе поиска, показал, что в науке и технике нет объекта, обладающего заявленной совокупностью признаков и наличием преимуществ, что позволяет сделать вывод о соответствии заявленного объекта критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Для доказательства соответствия заявляемого изобретения приводим конкретные примеры использования набора для выявления СВБ и подбора бактерицида для подавления роста СВБ.

Приводим пример выявления СВБ в пластовой жидкости.

Отбирают пробу пластовой жидкости в стерильный флакон из скв. 18811 Павловской площади Ромашкинского месторождения. Шприцем отбирают 1 мл пластовой жидкости и вводят в флакон с питательной средой, разведение 1:10. Встряхивают этот флакон, отбирают 1 мл жидкости и вводят во 2-й флакон с питательной средой, разведение 1:100. Таким образом делают 5 разведении (1: 100000). При каждом разведении используют по 3 флакона с питательной средой. Делают соответствующие записи на флаконах. Засеянные флаконы выдерживают при температуре 30-32^oС в течение 15 суток. Определяют количество бактерий в 1 мл пластовой жидкости.

Результаты исследований приведены в таблице 1.

Количество клеток СВБ в пластовой жидкости рассчитывают по последнему флакону, в котором наблюдался рост СВБ - среда окрасилась в темный цвет. В наших исследованиях окрашивание среды было в последний раз при 3-м разведении. Подсчитываем количество СВБ в 1 мл пластовой жидкости по формуле
М=10•П/V=10•3/1=10³ кл/мл.

Таким образом, в 1 мл пластовой жидкости содержится 10³ клеток СВБ (табл. 1, опыт 3).

Приводим примеры по оценке защитного действия бактерицидов Сульфан и СНПХ-1002 для подавления роста СВБ в промысловых условиях.

Пример 1.

В стерильные флаконы отбирают пробы пластовой жидкости из систем ППД НГДУ "Альметьевнефть". Во флаконы с питательной средой дозируют шприцем бактерицид Сульфан с концентрацией, которая в пересчете на объем флакона составляет 25, 50 и 100 мг/л. Далее флаконы выдерживают от 2 до 24 часов при температуре 30-32^oС. Затем шприцем отбирают из флакона 1 мл пробы и вводят во флакон с питательной средой. Для каждой концентрации бактерицида проводят 3 параллельных опыта. Флаконы выдерживают при температуре 30-32^oС в течение 15 суток. Далее определяют содержание сероводорода в опытных и контрольных флаконах. Рассчитывают степень подавления СВБ по формуле
S=(С-C₁)/С•100%=(20-0)/20•100%=100%,
(табл. 2, опыт 2).

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, только в качестве бактерицида берут бактерицид СНПХ-1002. Рассчитывают степень подавления СВБ по формуле
S=(С-C¹)/C•100%=(20-18)/20•100%=10%,
(табл. 2, опыт 4).

Как видно из данных таблицы 2, наиболее эффективным для подавления роста СВБ в пластовой жидкости данного месторождения является бактерицид Сульфан по ТУ 2458-003-42147065-ОП-99 с концентрацией 50 мг/л, который на 100% подавляет рост СВБ.

Применение заявляемого изобретения позволяет быстро и качественно выявить наличие СВБ в промысловой жидкости и подобрать наиболее эффективный бактерицид для подавления роста СВБ как в лабораторных условиях, так и непосредственно в нефтепромысловых условиях.

Изобретение относится к технической микробиологии и может быть использовано в нефтяной промышленности при исследованиях нефтепромысловых сред на содержание в них сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ) и подбора бактерицида для подавления роста СВБ. Набор для выявления роста СВБ и подбора бактерицида для подавления роста СВБ содержит стерильные флаконы для отбора проб и с питательной средой, снабженные стерильными резиновыми пробками, шприц для дозированного отбора или ввода исследуемой среды, емкость с этиловым спиртом, вату и упаковку с универсальной индикаторной бумагой для определения рН среды, флаконы дополнительно снабжены поверх резиновых пробок колпачками из алюминиевой фольги для повышения стерильности и удобства хранения, которые закреплены на флаконах кремпером, причем набор дополнительно содержит флакон с раствором щелочи и флакон с раствором соляной кислоты для создания нейтральной среды и карандаш для маркировки флаконов. Набор содержит стерильные флаконы с питательной средой по 9 мл в каждом флаконе и шприцы объемом 1 мл от 100 до 1000 штук. Набор позволяет быстро и качественно выявить СВБ как в лабораторных, так и в нефтепромысловых условиях. 1 з. п.ф-лы, 2 табл.

1. Набор для выявления сульфатвосстанавливающих бактерий и подбора бактерицида для подавления роста сульфатвосстанавливающих бактерий, содержащий: стерильные флаконы для отбора проб и с питательной средой Постгейта, снабженные стерильными резиновыми пробками, шприц для дозированного отбора или ввода исследуемой среды, емкость с этиловым спиртом, вату и упаковку с универсальной индикаторной бумагой для определения рН среды, отличающийся тем, что флаконы дополнительно снабжены поверх резиновых пробок колпачками из алюминиевой фольги для повышения стерильности и удобства хранения, которые закреплены на флаконах кремпером, причем набор дополнительно содержит флакон с раствором щелочи и флакон с раствором соляной кислоты для создания нейтральной среды и карандаш для маркировки флаконов.2. Набор по п.1, отличающийся тем, что стерильных флаконов с питательной средой по 9 мл в каждом флаконе и шприцев объемом 1 мл он содержит от 100 до 1000 шт.