СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, а именно биохимии, и может быть использовано, в частности, для выявления биологической активности химических веществ.

В практической медицине известен способ выявления биологической активности химических веществ с использованием для этой цели сперматозоидов в качестве тест-объекта (Исраилов С.Р. Влияние некоторых лекарственных препаратов in vitro на морфофункциональное состояние сперматозоидов. - Врачебное дело, Киев: 1989. - 8. - С.52, 53).

Недостатками этого метода являются: недостаточно хорошая воспроизводимость; трудоемкость, длительность проведения - 72 часа.

Наиболее близким способом к предлагаемому является способ оценки биологической активности химических веществ, основанный на определении подвижности сперматозоидов в опытной и контрольной пробах каждые 30 мин в течение 3 часов (Линева О.И., Карнаух В.И. Скрининг-метод оценки влияния ксенобиотиков на репродуктивную функцию. // Гигиена и санитария. - М.: 1991. - 3. - С.79, 80).

Данный способ имеет следующие недостатки:
способ не является достаточно точным, так как имеет невысокую чувствительность из-за небольшого количества оцениваемых параметров (характер подвижности) и относительно длительных промежутков (30 минут) между замерами контрольных параметров (что может не позволить выявить биологическую активность, если она изменяется во времени);
способ требует применения специальных биосред (среда Хенкса, среда 1999), собственный состав которых может вызывать ошибку за счет химического взаимодействия с тестируемым веществом;
способ предусматривает применение в качестве тест-объекта спермы быка, что снижает значимость данного способа для медицинских исследований ввиду межвидовых отличий сперматозоидов быка и человека, что также может служить источником ошибок.

Способ требует относительно длительного проведения - 3 часа.

Целью представленного изобретения является повышение точности и скорости выявления биологической активности химических веществ при одновременной простоте и доступности для широкого практического применения.

Поставленная цель в изобретении достигается тем, что после полного разжижения эякулята человека через каждые 15 минут в течение одного часа проводят оценку следующих параметров качества спермы: относительное содержание активноподвижных сперматозоидов, скорость сперматозоидов, относительное содержание слабоподвижных сперматозоидов, относительное содержание неподвижных сперматозоидов, количество агглютинатов и количество мертвых сперматозоидов, и по изменению более чем на 1% хотя бы одного из оцениваемых параметров в сравнении с контролем выявляют биологическую активность химического вещества.

Сперматозоиды человека являются чувствительными к действию многих химических веществ (Николаев А.А., Луцкий Д.Л., 2000). Однако действие химических веществ может проявляться не только в изменении количества подвижных сперматозоидов, но и в изменении скорости сперматозоидов (Евдокимов В.В., 1999), образовании агглютинатов, снижении жизнеспособности сперматозоидов. Поэтому нами были выбраны шесть информативных показателей, наиболее полно отражающих возможную биологическую активность тестируемого соединения (Николаев А.А., 1994).

Отдельные из наблюдаемых проявлений биологической активности могут иметь обратимый характер, например агглютинация сперматозоидов (Луцкий Д.Л., Николаев А. А., 2001), но восстановление оцениваемых параметров происходит не ранее чем через 15 минут после воздействия тестируемого вещества (Николаев А. А. , 2001). Поэтому для снятия промежуточных результатов был выбран промежуток времени 15 минут.

По полученным нами данным изменение хотя бы одного из оцениваемых параметров (относительное содержание активноподвижных сперматозоидов, скорость сперматозоидов, относительное содержание слабоподвижных сперматозоидов, относительное содержание неподвижных сперматозоидов, количество агглютинатов и количество мертвых сперматозоидов) в присутствии тестируемого химического вещества более чем на 1% по сравнению с контролем свидетельствует о наличии у данного вещества биологической активности. Различия более чем в 1% могут считаться достоверными, так как погрешность измерения используемых показателей качества спермы не превышает 1%.

Таким образом, преимущество предлагаемого способа в более высокой точности при выявлении биологической активности химических веществ за счет увеличения количества оцениваемых параметров тест-объекта до шести и повышения частоты снятия промежуточных результатов (через каждые 15 минут), что позволяет уловить кратковременные и обратимые проявления биологической активности. При этом сокращается время проведения способа в 3 раза по сравнению с прототипом. Способ доступен для широкого практического использования благодаря относительно низкой себестоимости и простоте выполнения.

Положительный эффект предлагаемого способа достигается точностью оценки тестируемых параметров в контрольном и опытном образцах спермы. Это позволяет при отклонении тестируемых параметров более чем на 1% выявить наличие у химического вещества биологической активности.

Предложенный способ был успешно апробирован в практической работе кафедры общей и биоорганической химии Астраханской государственной медицинской академии и в Астраханском городском центре планирования семьи и репродукции с медико-генетической консультацией с марта 2001 года по ноябрь 2001 года на 23 различных химических веществах.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1 (табл.1)
Донор спермы 16/2001. Показатели спермограммы соответствуют критериям, предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме. Время разжижения 14 минут. Объем эякулята 3,4 мл. Концентрация сперматозоидов - 52 млн/мл.

Для выявления биологической активности Fe²⁺ провели сравнительный анализ показателей качества спермы (относительное содержание активноподвижных сперматозоидов, скорость сперматозоидов, относительное содержание слабоподвижных сперматозоидов, относительное содержание неподвижных сперматозоидов, количество агглютинатов и количество мертвых сперматозоидов).

В опытный образец спермы объемом 0,5 мл внесли 0,5 мл 10,0 мкМ раствора Fe²⁺ в дистиллированной воде. В контрольный образец спермы объемом 0,5 мл внесли 0,5 мл дистиллированной воды. Затем образцы инкубировались при комнатной температуре.

Исследование проведено в соответствии с общепринятыми методами, рекомендованными ВОЗ для исследования спермы. Оценка результатов проводилась каждые 15 минут в течение одного часа. Полученные данные занесены в таблицу 1. Выявлено изменение, превышающее 1% для всех тестируемых параметров, за исключением образования агглютинатов в опыте по сравнению с контролем. Таким образом, Fe²⁺ обладает биологической активностью.

Пример 2 (табл.2)
Донор спермы 21/2001. Показатели спермограммы соответствуют критериям, предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме. Время разжижения 13 минут. Объем эякулята 4,2 мл. Концентрация сперматозоидов - 63 млн/мл.

Для выявления биологической активности хлорида натрия провели сравнительный анализ показателей качества спермы (относительное содержание активноподвижных сперматозоидов, скорость сперматозоидов, относительное содержание слабоподвижных сперматозоидов, относительное содержание неподвижных сперматозоидов, количество агглютинатов и количество мертвых сперматозоидов).

В опытный образец спермы объемом 0,5 мл внесли 0,5 мл 0,3 М раствора хлорида натрия в дистиллированной воде. В контрольный образец спермы объемом 0,5 мл внесли 0,5 мл дистиллированной воды. Затем образцы инкубировались при комнатной температуре.

Исследование проведено в соответствии с общепринятыми методами, рекомендованными ВОЗ для исследования спермы. Оценка результатов проводилась каждые 15 минут в течение одного часа. Полученные данные занесены в таблицу 2. Изменения для всех тестируемых параметров в опыте по сравнению с контролем не превышали 1%. Таким образом, хлорид натрия не обладает биологической активностью.

Пример 3 (табл.3)
Донор спермы 22/2001. Показатели спермограммы соответствуют критериям, предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме. Время разжижения 14 минут. Объем эякулята 3,3 мл. Концентрация сперматозоидов - 58 млн/мл.

Для выявления биологической активности гепарина провели сравнительный анализ показателей качества спермы (относительное содержание активноподвижных сперматозоидов, скорость сперматозоидов, относительное содержание слабоподвижных сперматозоидов, относительное содержание неподвижных сперматозоидов, количество агглютинатов и количество мертвых сперматозоидов).

В опытный образец спермы объемом 0,5 мл внесли 0,5 мл 1,0 мкМ раствора гепарина в дистиллированной воде. В контрольный образец спермы объемом 0,5 мл внесли 0,5 мл дистиллированной воды. Затем образцы инкубировались при комнатной температуре.

Исследование проведено в соответствии с общепринятыми методами, рекомендованными ВОЗ для исследования спермы. Оценка результатов проводилась каждые 15 минут в течение одного часа. Полученные данные занесены в таблицу 3. Изменения для всех тестируемых параметров в опыте по сравнению с контролем превышали 1%. Таким образом, гепарин обладает биологической активностью.

Пример 4 (табл.4)
Донор спермы 25/2001. Показатели спермограммы соответствуют критериям, предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме. Время разжижения 16 минут. Объем эякулята 4,7 мл. Концентрация сперматозоидов - 53,5 млн/мл.

Для выявления биологической активности нитроксалина провели сравнительный анализ показателей качества спермы (относительное содержание активноподвижных сперматозоидов, скорость сперматозоидов, относительное содержание слабоподвижных сперматозоидов, относительное содержание неподвижных сперматозоидов, количество агглютинатов и количество мертвых сперматозоидов).

В опытный образец спермы объемом 0,5 мл внесли 0,5 мл 1,0 мМ раствора нитроксалина в дистиллированной воде. В контрольный образец спермы объемом 0,5 мл внесли 0,5 мл дистиллированной воды. Затем образцы инкубировались при комнатной температуре.

Исследование проведено в соответствии с общепринятыми методами, рекомендованными ВОЗ для исследования спермы. Оценка результатов проводилась каждые 15 минут в течение одного часа. Полученные данные занесены в таблицу 4. Изменение в образовании агглютинатов в опыте по сравнению с контролем превышало 1% при исследовании через 15 минут инкубации. Таким образом, нитроксалин обладает биологической активностью.

Предлагаемым способом достигается положительный эффект: повышается точность выявления биологической активности химических веществ за счет увеличения чувствительности. Способ требует в 3 раза меньше времени для проведения по сравнению с прототипом.

Предлагаемый способ может быть использован в фундаментальной и практической медицине для выявления биологической активности химических веществ.

Изобретение относится к медицине, а именно биохимии, и может быть использовано для выявления биологической активности химических веществ. Сущность изобретения состоит в том, что через каждые 15 мин в течение одного часа проводят оценку параметров качества спермы: относительное содержание активноподвижных сперматозоидов, скорость сперматозоидов, относительное содержание слабоподвижных сперматозоидов, относительное содержание неподвижных сперматозоидов, количество агглютинатов и количество мертвых сперматозоидов и изменение более чем на 1% хотя бы одного из оцениваемых параметров в сравнении с контролем, свидетельствует о биологической активности химического вещества. Техническим результатом является повышение точности и скорости выявления биологической активности химических веществ, простота и доступность для широкого практического применения. 4 табл.

Способ выявления биологической активности химических веществ путем использования в качестве тест-объекта сперматозоидов, отличающийся тем, что после полного разжижения эякулята человека через каждые 15 мин в течение одного часа проводят оценку следующих параметров качества спермы: относительное содержание активноподвижных сперматозоидов, скорость сперматозоидов, относительное содержание слабоподвижных сперматозоидов, относительное содержание неподвижных сперматозоидов, количество агглютинатов и количество мертвых сперматозоидов и по изменению более чем на 1% хотя бы одного из оцениваемых параметров в сравнении с контролем выявляют биологическую активность химического вещества.