СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ МУЖСКОГО БЕСПЛОДИЯ НА ОСНОВЕ АССОЦИАЦИИ С ПОЛИМОРФНЫМ ВАРИАНТОМ rs25487 ГЕНА БЕЛКА РЕПАРАЦИИ ДНК XRCC1 Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 G01N33/50 C12Q1/6876 

Изобретение относится к медицине, а именно, к андрологии, репродуктологии, генетике и к патофизиологии, может быть использовано для уточнения причин мужского бесплодия, а также прогноза исхода процедуры ЭКО/ИКСИ в клиниках вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).

По оценкам ВОЗ, около 90 миллионов пар в настоящее время во всем мире затрагивают проблемы с фертильностью [Calogero А. 2023]. Мужское бесплодие является одной из фундаментальных проблем репродуктивной медицины, решение которой на молекулярном уровне имеет прикладное значение для предоставления нуждающимся парам шанса завести ребенка в естественном цикле или посредством вспомогательных репродуктивных технологий [Agarwal A. et al., 2021; Aitken R., 2020; Павлов B.H. и др., 2020]. С целью прогнозирования репродуктивного потенциала и контроля качества лечения используется классический анализ спермограммы в соответствии с рекомендациями ВОЗ. Этот протокол включает определение стандартизированными методами рутинных параметров эякулята, нижние референтные пределы которых имеют низкую чувствительность, что не позволяет получить достоверной информации для оценки вероятности зачатия. Одним из критериев диагностики мужского бесплодия является анализ спермограммы [WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5th ed. WHO (Geneva), 2010. Vol.270; Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека. Пер. с англ. Н.П. Макаровой под научн. ред. Л.Ф. Курило. 5-е изд. М.: Изд-во "Капитал принт", 2012]. Однако он имеет недостатки и не всегда по данному анализу можно оценить фертильность пациентов. Недостатки классической спермограммы:

1. Анализ основан лишь на визуальном исследовании функционально-морфологических критериев сперматозоидов и не дает возможность выявить биохимические и патофизиологические нарушения в мужских половых клетках.

2. Имеет субъективный характер, зависящий от лабораторных навыков лаборанта.

3. От 30 до 50% анализов спермограммы соответствуют критериям ВОЗ, что не позволяет выявить патологию при идиопатическом бесплодии у мужчин.

Многочисленные исследования показывают, что проблемы сперматогенеза, развития яичек, созревания и миграции сперматозоидов могут быть связаны с нарушениями репарации ДНК. Дефицит механизма репарации может усилить повреждение ДНК в зародышевых клетках, что приведет к аномальному сперматогенезу и бесплодию. Прецизионная репарация ДНК необходима для поддержания целостности и качества генома зародышевых клеток. Следовательно, система восстановления повреждений ДНК является ключевым элементом поддержания оплодотворяющей способности эякулята. Одним из центральных факторов репарации ДНК является много доменный белок XRCC1, который совместно с комплексом ферментов, включая НАД-зависимую полиАДФ-рибозополимеразу (polyADP-ribosepolymerase - PARP), участвует, в частности, в устранении основных типов повреждения ДНК - одно- и двухцепочечных разрывов полинуклеотидной цепи [Gunes S. et al., 2015, Palazzo L et al., 2019].

Известен способ прогнозирования идиопатического бесплодия мужчин, включающий определение концентрации термостабильной карбоксиэстеразы в семенной плазме методом латекс-агглютинации в начале исследования и через 4-6 недель. Далее по сумме концентраций двух определений выше 16,0 нг/мл прогнозируют идиопатическое бесплодие [патент RU 2697395 С1, 2019]. Недостатком способа является то, что он выявляет прогноз идиопатического бесплодия путем определения концентрации термостабильной карбоксилэстеразы в семенной плазме, но не в эякуляте.

Известен способ прогнозирования нарушения фертильности у мужчин путем исследования периферической крови, отличающийся тем, что на выделенной из лимфоцитов ДНК амплифицируют фрагменты генов глутатион-8-трансфераз M1 и P1 и при выявлении одного из генотипов GSTM1 0/0, GSTP1 В/В, GSTP1 В/С, GSTP1 С/С прогнозируют риск развития астенозооспермии [патент RU 2314530, 2008]. Недостатком способа является то, что он выявляет только диагностические маркеры астенозооспермии (низкая подвижность сперматозоидов), но не прогнозирует риск развития идиопатического мужского бесплодия при олигозооспермии (низкая концентрация жизнеспособных сперматозоидов) и тератозооспермии (сперматозоиды с измененной морфологией). Наиболее близким аналогом изобретения является способ прогноза мужского бесплодия, включающий анализ роли полиморфизмов генов XRCC1, ХРС, NBN в сперматогенезе и мужском бесплодии [Т.А. Шерчкова, Н.А. Григорян, М.А. Амелина и др. Генные отчеты. - 2021.- 24 (1): 101238]. В данном исследовании определена частота полиморфизмов генов системы репарации: XRCC1 rs25487, rs25489; NBN rs1805794 и ХРС rs2228001 у мужчин репродуктивного возраста населения Ростовской области. Образцы были разделены на четыре группы в соответствии с анализами спермы: нормозооспермия, олигозооспермия, астенозооспермия и комбинированная группа с патоспермией. В результате проведенного исследования было обнаружено, что Arg280His (839G>A) (rs25489) полиморфизм гена XRCC1 ген может быть связан с нарушением процесса сперматогенеза человека. У мужчин с генотипом Arg/His по сравнению с генотипом Arg/Arg чаще обнаруживалось снижение концентрации сперматозоидов. Вариант ХРС также может быть связан с повышенным риском развития олигозооспермии. Полученные результаты в данной работе являются шагом к доказательству того, что полиморфные варианты генов системы репарации ДНК XRCC1, ХРС и NBN вносят вклад в риск патоспермии.

Недостатками прототипа являются:

1. Авторы в своей работе четко не указывают, какую биологическую жидкость они использовали в работе, для изучения генетических маркеров.

2. Основная часть работы основывается фактически на полученных результатах спермограммы фертильных и инфертильных мужчин. Задачей изобретения стала разработка объективного, высокоинформативного способа прогнозирования идиопатического мужского бесплодия, позволяющего в качественном отношении оценить риск возникновения данной нозологии у бесплодных мужчин на основе выявления ассоциации полиморфных вариантов rs25487 гена белка XRCC1 с астенотератозооспермией и олигоастенотератозооспермией. Технический результат при использовании изобретения - повышение точности прогноза.

Предлагаемый способ прогнозирования идиопатического мужского бесплодия осуществляется следующим образом. Образцы эякулята получают путем мастурбации в стерильный одноразовый пластиковый контейнер. После сбора образцы оставляют разжижаться при температуре 37°С в течение 30 минут. Тотальную геномную ДНК выделяют из спермы пациента методом экстракции фенолом и хлороформом.

Определяют генотипы полиморфных локусов в гене системы репарации ДНК XRCC1 с помощью метода дискриминации аллелей TaqMan. Для валидации нуклеотидных замен в гене белка XRCC1 используют секвенирование ДНК методом Сэнгера на автоматическом ДНК-анализаторе (Life Technologies). При обнаружении генотипа GG полиморфного варианта rs25487 или аллеля rs25487*G гена белка XRCC1 прогнозируют высокий риск развития идиопатического мужского бесплодия в виде олигоастенотератоспермиии или астенотератозооспермии.

Проведено исследование семенной плазмы 318 мужчин-пациентов центра клиники «Семья» (г. Уфа). Диагноз идиопатического бесплодия устанавливался на основании клинических и лабораторных данных. Группа субфертильных мужчин была представлена 154 пациентами с астенотератозооспермией (N=89) и олигоастенотератоспермией (N=65), группа сравнения - фертильными мужчинами (N=164). Для определения маркеров ДНК был использован нативный эякулят.Исследование проводили в два этапа. Первый этап - подготовительный, заключался в выделении ДНК из спермы мужчин, второй этап - в детекции нуклеотидных вариантов локусов rs25487 и rs415407 ядерной ДНК. Методика выделения ДНК:

1. Лизис клеток - 5 мл спермы смешивали с 30-40 мл лизирующего раствора и центрифугировали при 4000 об/мин с охлаждением в течение 20 мин, при температуре+4°С.При большом количестве осадка на дне пробирки данную процедуру повторяли дважды.

2. Ферментативное разрушение белков протеиназами и/или депротеинизация клеточного лизата.

Полученный осадок переносили в отдельную пробирку, ресуспензировали его с добавлением 800 мкл Soline EDTA, 80 мкл SDS, 20-40 мкл протеиназы К, тщательно перемешивали на шейкере в течение 15 мин, после чего инкубацию полученного материала проводили в течение 12 часов при температуре 37°С.

3. После 12-часовой инкубации добавляли 800 мкл забуференного фенола и тщательно перемешивали на шейкере в течение 10 минут, затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 минут, после чего отбирали супернатант в чистую пробирку. На следующем этапе к супернатанту добавляли 500 мкл забуференного фенола и 500 мкл хлороформ-изоамилового спирта, тщательно перемешивали и повторно центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 минут. Полученный супернатант снова отбирали в чистую пробирку, добавляли 1000 мкл хлороформ-изоамилового спирта, перемешивали, повторно центрифугировали и отбирали полученный супернатант. К супернатанту добавляли холодный 96% этиловый спирт для преципитации ДНК. Затем ДНК промывали последовательно 96% и 70% этиловым спиртом, высушивали при комнатной температуре и растворяли в деионизированной воде. Концентрация и чистота выделенной ДНК оценивалась путем измерения оптической плотности с использованием спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific). Растворенную ДНК использовали в последующем в работе для изучения анализа ассоциации полиморфных вариантов rs25487 (Leu295=); и rs415407 (р.Рго346=); гена белка XRCC1 с риском развития мужского бесплодия.

4. Реакцию секвенирования проводили с помощью набора флюоресцентно меченых ddNTP (Big Dye Terminators v.3.1 RR kit) по протоколу производителя. Тотальную геномную ДНК выделяли из спермы методом фенольно-хлороформной экстракции. Концентрация и чистота выделенной ДНК оценивалась путем измерения оптической плотности с использованием спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific).

5. После секвенирования выполнялось сравнение последовательностей ДНК обследованных индивидов с референсной последовательностью ядерного генома человека.

6. Определение генотипов полиморфных локусов в гене XRCC1 осуществлялось с помощью метода дискриминации аллелей TaqMan. Анализ аллельной дискриминации проводили с использованием прибора CFX96 Real-Time PCR Detection System (BioRad). Результаты каждой аллельной дискриминации были проанализированы с использованием программного обеспечения CFX96 Real-Time PCR Detection System (BioRad). Распределение частот аллелей также статистически значимо различалось у пациентов с патоспермией и нормоспермией. Частота наличия аллеля rs25487*A составляла 42% и 58% у пациентов с патоспермией и нормоспермией, соответственно, а частота аллеля rs25487*G - 60% и 40%), соответственно. Исходя из полученных данных, присутствие аллеля rs25487*A является генетическим маркером пониженного риска развития бесплодия (р=0,007, OR=0,48, 95%> CI=0,28-0,82), а аллеля rs25487*G - маркером повышенного риска мужского бесплодия (р=0,007, OR=2,l, 95%С1=1,23-3,59). При генотипировании полиморфного локуса rs415407 гена XRCC1 выявлено, что у пациентов с патоспермией наиболее часто встречался генотип rs415407*AC полиморфного локуса rs415407 (52,4%). Вместе с тем, этот генотип встречался с близкой частотой (49,8%) у пациентов с нормоспермией и с частотой 47,3%о у фертильной группы мужчин. Различия в частотах распределения указанного генотипа статистически незначимы. Генотип rs415407*AA полиморфного локуса rs415407 встречался у мужчин с нормоспермией в 27,3%, у пациентов с патоспермией он обнаружен в 26,2%) (р>0,05). У фертильных мужчин генотип rs415407*CC выявлен в 25,2%о, у индивидов с нормоспермией в 22,2%, а у пациентов с патоспермией - 21,4%). Различия результатов были статистически несущественными (р>0,05).

Результаты генотипирования полиморфных вариантов rs25487 и rs415407 гена XRCC1 у пациентов с нормо- и патоспермией и в группе фертильных мужчин, а также анализ ассоциации данных полиморфных локусов с риском развития мужского бесплодия представлены в таблице.

Сущность изобретения поясняется следующими клиническими примерами.

Пример №1

Пациент Г., возраст 33 лет, супруга С, возраст 28 лет, состояли в бесплодном браке в течение 7 лет, обратились в клинику ВРТ «Семья» г. Уфы по поводу бесплодия. При обследовании супруги патологических нарушений со стороны репродуктивной системы выявлено не было. При проведении обследования эякулята супруга выявлена астенотератозооспермия. Время разжижения эякулята составило 10 минут. Объем эякулята 6,4 мл. Концентрация сперматозоидов - 15,4 млн/мл, подвижных сперматозоидов 26,0%, нежизнеспособных 26,5%, атипичных форм 34,8%). У пациента проведен анализ полиморфных вариантов в гене белка XRCC1 и выявлен генотип rs25487*GG полиморфного варианта rs25487. Прогнозирован высокий риск развития мужского бесплодия. В течение последующих двух лет беременность у супруги не наступила. Заключение: Прогноз повышенного риска развития бесплодия, подтвердившийся в последующие после диагностики два года. Показатели спермограммы соответствуют критериям, предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме, за исключением снижения показателей подвижности сперматозоидов. Результат проведенного анализа спермограммы позволяет прогнозировать риск развития нарушения подвижности сперматозоидов у пациента при выявлении генотипа rs25487* GG. Женский фактор без патологии.

Пример 2.

Пациент Г., возраст 33 лет, в браке состоит, обратился в клинику ВРТ «Семья» г. Уфы по поводу первичного профилактического осмотра. При проведении обследования эякулята - время разжижения 8 минут. Объем эякулята - 4,8 мл, общее количество сперматозоидов 42 млн., концентрация - 14,8 млн/мл, подвижных сперматозоидов 43,8%, нежизнеспособных 25,3%, атипичных форм 38,4%. У пациента проведен анализ полиморфного варианта rs25487 в гене белка XRCC1 и выявлен генотип rs25487*AA. Нарушений фертильности не выявлено. В течение года произошло зачатие у супруги с последующим нормальным течением беременности.

Заключение: Показатели спермограммы соответствуют критериям, предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме. Отсутствие риска бесплодия. Параметры проведенного анализа спермограммы в пределах нормы. Сделан прогноз на реализацию нормальной фертильной функции.

Пример 3.

Пациент 3., возраст 32 года, супруга Б., возраст 27 лет, состояли в бесплодном браке в течение 3 лет, обратились в клинику ВРТ «Семья» г. Уфы. При обследовании патологических нарушений со стороны репродуктивной системы супруги выявлено не было. Время разжижения эякулята составило 10 минут. Объем эякулята 6,2 мл. Концентрация сперматозоидов - 12 млн/мл, подвижных сперматозоидов 31,0%, нежизнеспособных 29,5%, атипичных форм 42,9%. Была диагностирована олигоастенотератоспермия. У пациента проведен анализ полиморфного варианта rs25487 в гене белка XRCC1. Выявлен генотип rs25487*GG полиморфного варианта rs25487. Через год при повторном обращении беременность в браке не наступила, несмотря на проведенную терапию. Заключение: Прогноз повышенного риска развития бесплодия в виде олигоастенотератоспермии. Выявленный вариант rs25487*GG коррелировал с развитием олигоастенотератоспермии и является маркером повышенного риска развития идиопатического мужского бесплодия.

Пример 4.

Пациент С, возраст 29 лет, в браке не состоит, является пациентом клиники ВРТ «Семья», по поводу мужского фактора бесплодия. Показатели спермограммы соответствуют критериям, предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме. Время разжижения 15 минут. Объем эякулята - 4,4 мл, общее количество сперматозоидов 42 млн., концентрация - 16,4 млн./мл, подвижных сперматозоидов 46,8%, нежизнеспособных 26,4%, атипичных форм 38,6%). Выявлена аллель вариант rs25487*G. Заключение: Параметры проведенного анализа спермограммы в пределах нормы. Выявленный вариант rs25487*G не коррелировал с показателями спермограммы и является маркером повышенного риска идиопатического бесплодия.

Заключение: Прогноз повышенного риска развития бесплодия в виде олигоастенотератоспермии. Выявленный вариант rs25487*G коррелировал с развитием олигоастенотератоспермии и является маркером повышенного риска развития идиопатического мужского бесплодия. В течение последующих двух лет беременность у супруги не наступила. Таким образом, приведенные примеры, демонстрируют, что предлагаемый метод определения основе ассоциации с полиморфным вариантом rs25487 гена белка репарации ДНК XRCC1 позволяет выявить нарушения репродуктивной функции у мужчин до исследования спермограммы. Приведенные примеры демонстрируют прогностическую и диагностическую значимость предлагаемого способа. Способ позволяет прогнозировать риск развития мужского бесплодия до исследования традиционного анализа спермограммы. Преимущества заявляемого метода:

1. Применение генотипирования полиморфного локуса rs25487 в качестве биомаркера риска развития идиопатического бесплодия может быть использовано в андрологии и репродуктивной медицине.

2. Предлагаемый способ прогнозирования является перспективным методом раннего выявления риска развития репродуктивной патологии у мужчин с возможностью его использования для коррекции нарушений гаметогенеза и оплодотворения, ассоциированных с репарацией ДНК.

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан способ прогнозирования идиопатического мужского бесплодия, включающий выделение ДНК и генотипирование полиморфного варианта rs25487 гена системы репарации ДНК (XRCC1). Согласно изобретению в способе используют полученный путем мастурбации нативный эякулят, и при обнаружении генотипа GG или аллеля G полиморфного варианта rs25487 прогнозируют риск развития идиопатического мужского бесплодия в виде олигоастенотератоспермии или астенотератозооспермии. Технический результат при использовании изобретения заключается в повышении точности прогноза. 1 табл., 4 пр.

Способ прогнозирования идиопатического мужского бесплодия, включающий выделение ДНК и генотипирование полиморфного варианта rs25487 гена системы репарации ДНК (XRCC1), отличающийся тем, что используют полученный путем мастурбации нативный эякулят, и при обнаружении генотипа GG или аллеля G полиморфного варианта rs25487 прогнозируют риск развития идиопатического мужского бесплодия в виде олигоастенотератоспермии или астенотератозооспермии.