СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ПРИ ДИАГНОСТИКЕ МУЖСКОГО БЕСПЛОДИЯ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/50 A61B5/00 

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при диагностике нарушений сперматогенеза и бесплодия в урологии, андрологии, гинекологии, репродукции, дерматовенерологии для выявления этиологии и патогенеза патозооспермии.

Уровень техники

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендует проводить дополнительное исследование спермы с помощью тестов для выявления оксидативного стресса (ОС) или активных форм кислорода (АФК) и тестов фрагментации ДНК сперматозоидов (ДФС) [1].

В руководстве ВОЗ представлены методики для проведения этих лабораторных исследований, а также перечень используемых химических реагентов, которые в настоящее время не используются в лабораторной практике российских медицинских лабораторий.

На сегодняшний день в России отсутствуют доступные способы решения данных задач, разрешенные к использованию в клинической практике.

В 2022-2023 гг. были созданы и апробированы Наборы для оценки репродуктивного здоровья мужчины: «ГалоСперм Л&К» для оценки дисперсии ДНК-фрагментов сперматозоидов и «ОксиСперм Л&К (NBT-тест)» для определения АФК в сперме взрослого мужчины (оценка ОС эякулята). Российские разработки основывались на рекомендациях руководства ВОЗ (2021) [1].

Однако, как показала последующая практика, вследствие ряда причин - недостаток информации, потенциальная угроза здоровью состава химических реагентов представлял, многоступенчатость и трудоемкость рекомендуемого процесса проведения тестов и др., появилась необходимость модификации существующих методик и воссоздания Наборов, адаптированных к российским условиям.

Гипотеза о том, что дисбаланс окислительно-восстановительных реакций в мужских добавочных половых железах (МДПЖ) может отрицательно сказываться на фертильности, выдвигалась десятилетиями [1-4].

Общепризнано, что АФК, продуцируемые лейкоцитами, лежат в основе их вредного воздействия, если концентрация в сперме превышает пороговые значения [5,6].

По данным мировой литературы, оксидативное повреждение сперматозоидов, в том числе ДНК-фрагментация, обусловленное повышением уровня АФК в эякуляте, может иметь место даже при концентрации пероксидазо-позитивных клеток (ППК)<10 млн/мл (ниже порогового значения) [7-10].

До настоящего времени в мире не были проведены исследования с убедительными доказательствами в пользу определенного теста или доказательства взаимосвязи между окислительно-восстановительными процессами и результатами спонтанного или искусственного зачатия.

Тем не менее, общепризнано, что ОС, вероятно, является важным модулятором функции сперматозоидов человека и результатов зачатия [11].

Поскольку одним из последствий ОС является повреждение ДНК сперматозоидов, что является наиболее часто измеряемым маркером мужской фертильности, существует несколько других методов исследования, которые можно использовать для непосредственного изучения баланса антиоксидантов и АФК.

С точки зрения клинической диагностики, эту группу анализов следует использовать и интерпретировать с осторожностью только до тех пор, пока не будет получено более убедительное доказательство их клинической значимости.

Несмотря на то, что лабораторные тесты, которые могут быть использованы для оценки ОС или АФК, различаются как по методу, так и по типу АФК, которые они обнаруживают, существуют единые стандартные показания для их использования:

- прегравидарная подготовка супружеской пары без применения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ);

- супружеские пары, планирующие зачатие в непродуктивном возрасте;

- идиопатическое бесплодие супружеской пары на протяжении 6 месяцев и более;

- потеря беременности (выкидыши, замершая беременность); прегравидарная подготовка для ВРТ;

- неуспешные циклы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) (плохое качество эмбриона во время второго цикла донации яйцеклетки);

- перед программой внутриматочной инсеменации (ВМИ);

- возраст мужчины старше 40 лет;

- мужчины с нормальными параметрами спермограммы (нормальными показателями подвижности, концентрации, жизнеспособностью и морфологией сперматозоидов), но с неудачными попытками зачатия, а также выкидышами и замершей беременностью у супруг;

- мужчины, которые носят тесное нижнее белье;

- мужчины, планирующие зачатие после химиотерапии;

- мужчины, планирующие зачатие с тяжелыми сопутствующими заболеваниями; мужчины с вредными привычками (курение, злоупотребление алкоголем, переедание, малоподвижный образ жизни);

- мужчины с урогенитальными инфекциями; мужчины с варикоцеле; мужчины, у которых в анамнезе рак; идиопатическое мужское бесплодие.

Известен метод измерения окислительно-восстановительного потенциала (REDOX) [1, стр. 141-143]. Известный метод основан на прямом измерении окислительно-восстановительного баланса эякулята электрохимическим способом.

В настоящее время этот метод является предметом многочисленных исследований в области бесплодия, так как требует минимальных манипуляций и, следовательно, вполне поддающийся стандартизации.

Проблема широкомасштабного внедрения метода в практику заключается в его существенных недостатках:

- отсутствует апробированная убедительная доказательная база для этого метода, поэтому настоящее время он по-прежнему рассматривается как исследовательский тест;

- вязкость пробы и плохое разжижение существенно затрудняют его осуществление по причине затруднения заполнения контрольной камеры, что в свою очередь снижает достоверность получаемых результатов.

Известен метод «Оценки общей оксидантной способности» [1]. Данный метод предназначен для получения информации о компенсаторной возможности эякулята нейтрализовать любой ОС. Таким образом, это измерение способности антиоксидантных ферментов и систем в семенной плазме, а также любых антиоксидантов, полученных из пищевых или иных веществ, которые попадают в семенную плазму (но не в сперматозоиды, так как они удаляются центрифугированием).

В ходе анализа присутствующие антиоксиданты ингибируют окисление 2'-азинобис-(3-этилбензтиазолинсульфокислоты) (ABTS) катионом-радикалом.

Недостаток данного метода заключается в том, что изначально он был разработан с целью использования для анализа большого количества разнообразных биологических жидкостях организма и не специфичен для спермы, что существенно снижает его информативность,

- кроме того, в связи с тем, что он основан на колориметрии, то может быть использован только с применением соответствующего аппаратного анализатора;

- на достоверность получаемых результатов влияют достаточно большое количество сопутствующих веществ [1-11].

В качестве прототипа принят метод люминометрии (Люминол) [1, стр. 141-143]. Данный метод основан на хемилюминесцентной реакции люминола, когда он вступает в реакцию со свободным радикалом.

Он включает следующие действия:

- хемилюминесцентную реакцию люминола - реакция со свободным радикалом;

- измерение количества световых единиц с помощью люминометра;

- подсчет количество относительных световых единиц на миллион сперматозоидов.

По этим результатам оценивается качество активных форм кислорода и дисперсии хроматина сперматозоидов.

Метод имеет следующие недостатки:

- люминометры, как правило, не аккредитованы для диагностики in vitro, они предназначены только для научных исследований;

- конструкция приборов, для реализации данного способа, (например, объем пробы) и, как следствие, калибровка, чувствительность, динамический диапазон и даже используемые единицы измерения достаточно сильно различаются у различных производителей;

- вследствие различий в конструкции приборов и, как следствие, методологиями и низкой прогностической ценностью конечного результата, отсутствуют согласованные контрольные показатели назначения;

- результаты, получаемые с использованием данного метода, достаточно чувствительны к обращению с образцами испытаний и времени измерения;

- «Люминол» имеет повышенную чувствительность к рН, изменениям температуры и воздействию химических веществ, которые часто варьируются в зависимости от свойств эякулята, таких как аскорбиновая кислота (снижает сигнал) или тиолсодержащие молекулы (повышают результаты), а также к уровням других присутствующих белков.

В соответствии с этим, использование данного метода для рутинных исследований эякулята на практике затруднительно.

Сущность изобретения

Изобретение направлено на решение задачи повышение достоверности оценки активных форм кислорода и дисперсии хроматина сперматозоидов в процессе диагностики бесплодии мужчин.

Технический результат, достигаемый при использовании представленного способа, состоит в повышения информативности и достоверности диагностики за счет расширения спектра исследования факторов нарушения репродуктивной функции.

Результат достигается за счет того, что собирают образец эякулята путем маструбации или полового контакта после 48 ч воздержания, проводят химическое разжижение с помощью разжижающего раствора, если образец высокой вязкости или плохо разжижается, перед проведением анализа реакционную ячейку с микрогелем помещают в сухожаровый шкаф или водяную баню на +80 - +100°С до полного разжижения микрогеля, переносят реакционную ячейку в водяную баню или термостат при 37°С на 5 мин для стабилизации температуры, цвет микрогеля должен быть беловато-желтоватый. Если цвет микрогеля темно-желтый, значит реагент потерял эффективность, добавляют в реакционную ячейку 140 мкл эякулята, образец эякулята размешивают наконечником дозатора без образования пузырьков во избежание дополнительного стресса сперматозоидов, смешивают образец эякулята с микрогелем реакционной ячейки и выдерживают 1-2 мин; вставляют реакционную ячейку в отверстие плавающего планшета при 37°С на водяную баню (в условиях клинок-диагностической лаборатории) или размещают ячейку в термостат при 37°С на 30 мин; определяют уровень АФК невооруженным глазом по цвету смеси образца эякулята с микрогелем в соответствие с таблицей (фиг. 2), осуществляют внутренний контроль качества полученных результатов следующим образом: отрицательный контроль: цвет расплавленного при +80 - +100°С микрогеля и доведенного до комнатной температуры 22°С без добавления эякулята - беловато-желтоватый; положительный контроль: цвет расплавленного при +80 - +100°С микрогеля с добавлением 2-20 мкл 2% H₂O₂ и выдержанного при температуре 37°С 30 мин - от светло-сиреневого до темно-сиреневого. Принцип тестирования основан на том, что супероксид-ионы АФК сперматозоидов обладают высокой реакционной способностью, которая может быть восстановлена с помощью NBT-реагента (нитросиний тетразолий) до синего формазана. Супероксид-ионы АФК сперматозоидов восстанавливается с помощью NBT-реагента (нитросиний тетразолий) до синего формазана за счет их высокой реакционной способности. Цвет формазана положительно коррелирует с содержанием кислорода в сперме. Проводится одноступенчатое исполнение теста. Оценка результатов теста основана на визуальной оценке результатов согласно цветовой оценочной шкале, соответствующей уровню АФК. При проведении исследования должны отсутствовать факторы, которые влияют на итоговый результат теста за исключением криптозооспермии и азооспермии.

Описание графических материалов

Сущность изобретения и возможность достижения технического результата будут более понятны из последующего описания со ссылками на фигуры графических материалов, где показано:

фиг. 1 - Таблица 1. Основной состав «ОксиСперм Л&К» (NBT-тест);

фиг. 2 - Таблица 2. Цветовая шкала оценки уровня АФК;

фиг. 3 - АФК высокий уровень (+++ резко-положительный «ГалоСперм Л&К» (NTB-тест);

фиг. 4 - АФК низкий уровень (+ слабо-положительный «ГалоСперм Л&К» (NTB- тест).

На фигурах приведены следующие обозначения:

NBT-тест;

ВО3 - Всероссийская организация здравохранения;

МГГ - Май-Грюнвальд-Гимзе;

АФК - активные формы кислород;

NBT - нитросиний тетразолий;

Л&К - ООО «Компания «Лайф энд Кволити» (ООО «Компания «Л&К»).

Осуществление изобретения

Методические рекомендации руководства ВОЗ (2021) и концепция разработанных операционных процедур первого российского технологического решения «ОксиСперм Л&К» (NBT-тест) совпадают по принципу определения общей антиоксидантной способности эякулята, описанного в ВОЗ (2021) [3].

Различия состоят в применении разных химических реагентов для проведения реакции (ABTS и NBT-реагент) и в способе конечной оценки результатов (приборная и визуальная оценка).

Принцип тестирования: Супероксид-ионы АФК сперматозоидов обладают высокой реакционной способностью, которая может быть восстановлена с помощью NBT-реагента (нитросиний тетразолий) до синего формазана. Цвет формазана положительно коррелирует с содержанием О₂ в сперме.

Собирают образец эякулята, выполняя следующие требования.

Образец должен быть собран путем маструбации или полового контакта после 48 ч воздержания.

Если образец высокой вязкости или плохо разжижается, следует провести химическое разжижение с помощью разжижающего раствора 1:1. Рекомендуется использовать Реагент №7 (Фосфатно-солевой раствор бромелайна) из набора Гемстандарт-СПЕРМОГРАММА.

Образец должен быть свежим, без криоконсервации.

Если образец не может быть протестирован вовремя, допускается кратковременное хранение свежей спермы в закрытом одноразовом контейнере при температуре ~2-8°С в течение ~6-8 ч.

Процесс проведения анализа:

1. Приготовление реагента

Перед проведением анализа реакционную ячейку необходимо разместить в сухожаровый шкаф или водяную баню на +80 - +100°С до полного разжижения геля. Затем перенесите реакционную ячейку в водяную баню или термостат при 37°С на 5 мин для стабилизации температуры).

Цвет микрогеля должен быть беловато-желтоватый. Если цвет микрогеля темно-желтый, значит реагент потерял эффективность.

2. Подготовка образца

Добавить в реакционную ячейку 140 мкл эякулята. Во избежание дополнительного стресса сперматозоидов образец эякулята аккуратно размешать наконечником дозатора без образования пузырьков, смешать с микрогелем реакционной ячейки, выдержать 1-2 мин.

3. Инкубация

Вставить реакционную ячейку в отверстие плавающего планшета при 37°С на водяную баню (в условиях клинико-диагностической лаборатории) или разместите ячейку в термостат при 37°С (при РОСТ) на 30 мин.

4. Оценка результата

Оценивают результат невооруженным глазом.

Результат основывается на интенсивности цвета согласно цветовой шкале, а уровень АФК относятся к идентификационным критериям теста.

Референсные результаты. Отрицательно (-); слабо-положительно (+); положительно (++); резко-положительно (+++).

Показатель эффективности продукта - отрицательный (-) холостой тест, то есть реакционная ячейка с микрогелем без добавления эякулята не дает окрашивания, соответствующие цветовой шкале.

Ограничения метода. Концентрация сперматозоидов <2 млн/мл, криптозооспермия, азооспермия.

Отрицательный контроль: цвет расплавленного при +80 - +100°С микрогеля и доведенного до комнатной температуры 22°С без добавления эякулята - беловато-желтоватый.

Положительный тест: цвет расплавленного при +80 - +100°С микрогеля с добавлением 2-20 мкл 2% H₂O₂ и выдержанного при температуре 37°С 30 мин - от светло-сиреневого до темно-сиреневого.

Методические рекомендации руководства ВОЗ (2021) и концепция разработанных операционных процедур первого российского технологического решения «ОксиСперм Л&К» (NBT-тест) совпадают по принципу определения общей антиоксидантной способности эякулята, описанного в ВОЗ (2021) в Главе «Продвинутые исследования». Различия состоят только в применении разных химических реагентов для проведения реакции (ABTS и NBT-реагент) и в способе конечной оценки результатов (приборная и визуальная оценка). Важно подчеркнуть, что операционные процедуры отечественного Набора простые и занимают в общей сложности около 40 мин. Технологические испытания Набора показали бесприборное получение информативных результатов анализа как в условиях медицинской лаборатории, так и РОСТ. База для внутреннего контроля качества - это микрогель чистый, куда добавляется 2- 20 мкл 2% H₂O₂ и выдерживается при температуре 37°С 30 мин.

При осуществлении способа выполняют следующие действия:

- собирают образец эякулята путем маструбации или полового контакта после 48 ч воздержания;

- проводят химическое разжижение с помощью разжижающего раствора, если образец высокой вязкости или плохо разжижается;

- перед проведением анализа реакционную ячейку с микрогелем помещают в сухожаро-вый шкаф или водяную баню на +80 - +100°С до полного разжижения микрогеля;

- переносят реакционную ячейку в водяную баню или термостат при 37°С на 5 мин для стабилизации температуры, цвет микрогеля должен быть беловато-желтоватый. Если цвет микрогеля темно-желтый, значит реагент потерял эффективность;

- добавляют в реакционную ячейку 140 мкл эякулята;

- образец эякулята размешивают наконечником дозатора без образования пузырьков во избежание дополнительного стресса сперматозоидов;

- смешивают образец эякулята с микрогелем реакционной ячейки и выдерживают 1-2 минуты;

- вставляют реакционную ячейку в отверстие плавающего планшета при 37°С на водяную баню (в условиях клинико-диагностической лаборатории) или размещают ячейку в термостат при 37°С на 30 мин;

- определяют уровень АФК невооруженным глазом по цвету смеси образца эякулята с микрогелем в соответствие с таблицей (фиг. 2);

- осуществляют внутренний контроль качества полученных результатов следующим образом:

- референсный результат отрицательный, если цвет расплавленного при +80 - +100°С микрогеля и доведенного до комнатной температуры 22°С без добавления эякулята - беловато-желтоватый;

- референсный контроль положительный, если цвет расплавленного при +80 - +100°С микрогеля с добавлением 20 мкл 2% H₂O₂ и выдержанного при температуре 37°С 30 мин - от светло-сиреневого до темно-сиреневого.

Принцип тестирования основан на том, что супероксид-ионы АФК сперматозоидов обладают высокой реакционной способностью, которая может быть восстановлена с помощью NBT-реагента (нитросиний тетразолий) до синего формазана.

Супероксид-ионы АФК сперматозоидов восстанавливается с помощью NBT-реагента (нитросиний тетразолий) до синего формазана за счет их высокой реакционной способности.

При проведении анализа следует учитывать следующие факторы:

- цвет формазана положительно коррелирует с содержанием кислорода в сперме;

- проводится одноступенчатое исполнение теста;

- оценка результатов теста основана на визуальной оценке результатов согласно цветовой оценочной шкале, соответствующей уровню АФК;

- при проведении исследования должны отсутствовать факторы, которые влияют на итоговый результат теста за исключением криптозооспермии и азооспермии.

Пример

Пациент М, 39 лет. Попытки спонтанной беременности безуспешны. ВРТ (вспомогательные репродуктивные технологии) не применяли.

Результат Спермограммы - Астенозооспермия. Некрозооспермия. Вискозипатия.

Уровень АФК высокий (+++ резко-положительный «ГалоСперм Л&К» (NTB- тест) (фиг. 3).

Пациенту была назначена антиоксидантная терапия: L-карнитин в дозе 1000 мг один раз в день и витамин Е в дозе 500 мг два раза в день в течение 2 месяцев.

Спустя 2 месяца было проведено повторное измерение уровня АФК, который показал низкий уровень АФК (+ слабо-положительный) - фиг. 4.

Результат повторной спермограммы - Астенозооспермия.

Результаты лабораторного обследования показывают положительную динамику и шанс на спонтанную беременность при условии относительного здоровья супруги.

Такой результат невозможно было получить проводя обследования по способу, принятому в качестве прототипа.

Важно подчеркнуть, что операционные процедуры отечественного Набора простые и занимают в общей сложности около 40 мин. Технологические испытания Набора показали бесприборное получение информативных результатов анализа как в условиях медицинской лаборатории, так и РОСТ, что отражено на фиг. 1-3, где приведена визуальная оценка результатов теста согласно цветовой шкале.

Список использованной литературы

1. Who Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. Sixth Edition. World Health Organization. 2021. Доступно по: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787. Ссылка активна на 23.08.2023.

2. Jones R., Mann T., Sherins R. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma // Fertility and Sterility 1979. Vol. 31, № 5, р. 531-537.

1. Alvarez J.G., Touchstone J.C., Blasco L., Storey В.Т. Spontaneous lipid peroxidation and production of hydrogen peroxide and superoxide in human spermatozoa. Superoxide dismutase as major enzyme protectant against oxygen toxicity // Journal of andrology 1987. Vol. 8, № 5, р. 338-48.

2. Aitken R.J., Clarkson J.S. Cellular basis of defective sperm function and its association with the genesis of reactive oxygen species by human spermatozoa // Journal of reproduction and fertility, 1987. Vol. 81, № 2, р. 459-69.

3. Bisht S., Dada R. Oxidative stress: Major executioner in disease pathology, role in sperm DNA damage and preventive strategies// Frontiers in bioscience (Scholar edition) 2017. Vol. 9, № 3, р. 420-47.

4. O'Flaherty C., Matsushita-Fournier D. Reactive oxygen species and protein modifications in spermatozoa// Biology of reproduction. 2017. Vol. 97, № 4, р. 577-85.

5. Ko E.Y., Sabanegh ES Jr, Agarwal A. Male infertility testing: reactive oxygen species and antioxidant capacity// Fertility and sterility. 2014. Vol. 102, № 6, р. 1518-27.

6. Venkatesh S., Shamsi M.B., Dudeja S. et al. Reactive oxygen species measurement in neat and washed semen: comparative analysis and its significance in male infertility assessment// Archives of gynecology and obstetrics. 2011. Vol. 283, № 1, р. 121-126.

7. Henkel R., Kierspel E., Stalf Т. et al. Effect of reactive oxygen species produced by spermatozoa and leukocytes on sperm functions in non-leukocytospermic patients// Fertility and Sterility. 2005. Vol. 83, № 3. P. 635-642.

8. Erenpreiss J., Hlevicka S., Zalkalns J., Erenpreisa J. Effect of leukocytospermia on sperm DNA integrity: a negative effect in abnormal semen samples// Journal of Andrology. 2002. Vol. 23, №5. P. 717-723.

9. Сапожкова Ж.Ю., Милованова Г.А., Пацап О.И. Лабораторная диагностика мужского бесплодия. Маркеры и методы. Часть II// Лабораторная и клиническая медицина. Фармация. 2021. Т. 1, No 2. С. 65-79.

10. Сапожкова Ж.Ю., Милованова Г.А., Пацап О.И. Лабораторная диагностика мужского бесплодия. Маркеры. Часть I // Лабораторная и клиническая медицина. Фармация. 2021. Т. 1, No 1. С. 57-68.

11. Aitken RJ. Impact of oxidative stress on male and female germ cells: implications for fertility// Reproduction. 2020. Vol. 159, № 4. P. R189-R201

Изобретение относится к медицине, может быть использовано при диагностике нарушений сперматогенеза и бесплодия и касается способа оценки активных форм кислорода (АФК) сперматозоидов. Собирают эякулят, при подготовке образца эякулята проводят его химическое разжижение с помощью разжижающего раствора. Перед проведением анализа реакционную ячейку с микрогелем выдерживают при температуре +80 - +100°С до полного разжижения микрогеля, реакционную ячейку переносят в термостат при 37°С на 5 мин для стабилизации температуры. Определяют эффективность микрогеля по его цвету, при этом используют референсные результаты: за отрицательный контроль принимают беловато-желтоватый цвет расплавленного при +80 - +100°С и доведенного до комнатной температуры микрогеля без добавления эякулята; положительный тест соответствует цвету от светло-сиреневого до темно-сиреневого расплавленного с добавлением 2-20 мкл 2% H₂O₂ при +80 - +100°С и выдержанного при 37°С в течение 30 мин микрогеля. Затем в реакционную ячейку с эффективным микрогелем добавляют подготовленный образец эякулята в объеме 140 мкл, размешивают без образования пузырьков для снижения стресса сперматозоидов. Смешивают образец эякулята с микрогелем реакционной ячейки и выдерживают 1-2 мин. Далее вставляют реакционную ячейку в отверстие плавающего планшета при 37°С, размещают ячейку в термостате при 37°С на 30 мин. Определяют уровень АФК по цвету смеси образца эякулята с микрогелем следующим образом: при бело-желтом или светло-розовом цвете смеси делают вывод о нормальном уровне АФК, при светло-сиреневом - о низком уровне АФК, при сиреневом - о среднем уровне АФК и при темно-сиреневом - о высоком уровне АФК. Изобретение обеспечивает повышение информативности и достоверности диагностики. 4 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 пр.

1. Способ оценки активных форм кислорода (АФК) сперматозоидов, включающий сбор эякулята, подготовку образца эякулята и оценку уровня АФК, отличающийся тем, что:

- при подготовке образца эякулята для исследования проводят его химическое разжижение с помощью разжижающего раствора;

- перед проведением анализа реакционную ячейку с микрогелем выдерживают при температуре +80 - +100°С до полного разжижения микрогеля;

- реакционную ячейку переносят в термостат при 37°С на 5 мин для стабилизации температуры;

- определяют эффективность микрогеля по его цвету, при этом используют референсные результаты: за отрицательный контроль принимают беловато-желтоватый цвет расплавленного при +80 - +100°С и доведенного до комнатной температуры микрогеля без добавления эякулята, положительный тест соответствует цвету от светло-сиреневого до темно-сиреневого расплавленного с добавлением 2-20 мкл 2% H₂O₂ при +80 - +100°С и выдержанного при 37°С в течение 30 мин микрогеля;

- в реакционную ячейку с эффективным микрогелем добавляют подготовленный образец эякулята в объеме 140 мкл, размешивают без образования пузырьков для снижения стресса сперматозоидов;

- смешивают образец эякулята с микрогелем реакционной ячейки и выдерживают 1-2 мин;

- вставляют реакционную ячейку в отверстие плавающего планшета при 37°С, размещают ячейку в термостате при 37°С на 30 мин;

- определяют уровень АФК по цвету смеси образца эякулята с микрогелем следующим образом: при бело-желтом или светло-розовом цвете смеси делают вывод о нормальном уровне АФК, при светло-сиреневом - о низком уровне АФК, при сиреневом - о среднем уровне АФК и при темно-сиреневом - о высоком уровне АФК.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что химическое разжижение образца проводят разжижающим раствором фосфатно-солевого раствора бромелайна в пропорции 1:1.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для оценки АФК сперматозоидов используют свежий образец эякулята без криоконсервации.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют кратковременно храненный образец эякулята, который выдерживали в закрытом одноразовом контейнере при температуре 2-8°С в течение 6-8 ч.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что микрогель включает легкоплавкую агарозу и нитросиний тетразолий.