СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ N-КОНЦЕВОГО ПРО-МНП Российский патент 2003 года по МПК G01N33/53 C12N5/10 C07K16/26 

Данное изобретение относится к способу обнаружения N-концевого про-МНП в пробе с использованием по меньшей мере двух антител, которые распознают различные эпитопы N-концевого про-МНП. Способ может применяться для дифференциации или классификации проб здоровых людей и проб пациентов классов I-IV NYHA (New York Heart Association). Кроме того, данное изобретение относится к рекомбинантному N-концевому про-МНП, его применению в качестве стандарта в способе обнаружения N-концевого про-МНП, а также к антителам, которые распознают рекомбинантный N-концевой про-МНП, и их получению.

Сердечная недостаточность является широко распространенным феноменом, особенно в западном мире. Под сердечной недостаточностью понимают согласно медицинской энциклопедии Roche (1993, Urban & Schwarzenberg) острую или хроническую неспособность сердца при нагрузке или уже в состоянии покоя выдавать требующийся для обмена веществ выброс крови или принимать венозный отток (так называемую обратную и прямую недостаточность). Существует также слабость насосной функции сердца. Причины сердечной недостаточности являются многосторонними. Среди прочего следует здесь назвать воспалительные и дегенеративные изменения сердечной мышцы, нарушение коронарного кровоснабжения, сердечный инфаркт и повреждения сердца. Это приводит к изменениям в периферическом кровообращении, нарушению дыхания, функции почек и обмена электролитов (отеку) и к пониженной функциональной способности мускулатуры скелета.

Согласно New York Heart Association (NYHA) сердечную недостаточность при помощи тестов физической нагрузки делят на так называемые NYHA-классы: I обозначает полное отсутствие жалоб при нормальной физической нагрузке, II обозначает легкое ограничение толерантности к физической нагрузке, III обозначает сильное ограничение толерантности к нагрузке, IV обозначает, что при любой физической деятельности имеет место увеличение признаков недостаточности, в большинстве случаев существующих также в состоянии покоя.

Для эффективного медикаментозного лечения сердечной недостаточности при помощи гликозидов, вазодилататоров, АСЕ-ингибиторов (ингибиторов ангиотензинпревращающих ферментов) и/или β-блокаторов необходимо предварительно точно диагностировать существование сердечной недостаточности и по возможности также классифицировать по ее степени тяжести и дополнительно наблюдать за ходом лечения.

В существующем уровне техники обсуждаются несколько сывороточных маркеров для ранней диагностики сердечной недостаточности, такие как, например, ПНП (ANP) (N-концевой предсердный натрийуретический пептидный гормон) и про-ПНП, CNP (С-натрийуретический пептид), адреномедуллин, нейропептид Y, эндотелин и МНП (мозговой натрийуретический пептид). ПНП и про-ПНП в принципе пригодны в качестве маркера для диагностики сердечной недостаточности, но обладают низкой стабильностью или коротким периодом полураспада в крови, что затрудняет диагностические измерения (Clin. Sci. , 95(3) (1998), 235-239; Cleland et al., Heart 75, (1996), 410-413).

Часто цитируемым и считающимся убедительным маркером является МНП (мозговой натрийуретический пептид). МНП был первоначально идентифицирован в мозгу свиней. Речь идет при этом о сердечном гормоне, который обладает структурным и функциональным сходством с ПНП (предсердным натрийуретическим пептидом) (Sudoh et al.. Nature, 332 (1988), 78-81). Человеческий МНП, который состоит из 32 аминокислот, секретируется прежде всего из желудочков сердца и циркулирует в плазме крови человека. Применение МНП в качестве диагностического маркера известно, например, из ЕР-А-0542255. МНП обладает внутримолекулярными дисульфидными мостиками и в качестве аналитического средства благодаря его физиологической функции в качестве гормона, который должен быстро вновь распадаться, является не очень стабильным и поэтому лишь ограниченно пригоден в качестве диагностического маркера (Masuta et al., Clin.Chem., Vol.44, No.6, Supplement A (1998), 130; Tsuji et al., Clin.Chem. , 40 (1994), 672).

Молекула-предшественник МНП, про-МНП, состоит из 108 аминокислот, из которых описанные ранее 32 С-концевые аминокислоты (77-108), которые обозначаются как МНП, проявляют собственное гормональное действие. Отщепляемые от предшественника N-концевые аминокислоты 1-76 называют N-концевым про-МНП. Наряду с МНП (77-108) циркулирует также N-концевой про-МНП и последующие продукты распада 1-76 в плазме (Hunt et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 214 (1995), 1175-1183), так что N-концевой про-МНП также рассматривается в качестве маркера для сердечной недостаточности. Присутствует ли также молекула-предшественник про-МНП в плазме, еще не выяснено однозначно. Однако описано (Hunt et al. , Peptides, Vol.18, No. 10 (1997), 1475-1481), что небольшой выход про-МНП (1-108) обнаруживается в плазме, но вследствие очень быстрого частичного распада на N-концах некоторые аминокислоты отсутствуют. Эта молекула обозначена в литературе как высокомолекулярный МНП.

В WO 93/24531 (US 5786163) описан иммунологический способ обнаружения N-концевого про-МНП и применяемые для этого антитела. Для получения антител применяют отдельные синтетически полученные пептиды из последовательности N-концевого про-МНП. Хотя в принципе получение антител посредством иммунизации пептидами возможно, однако аффинность в отношении всей молекулы обычно является слишком низкой, чтобы достичь необходимой чувствительности в тест-способе. Кроме того, существует опасность, что при применении пептидов образуются антитела, которые распознают, например, С-конец пептида и, следовательно, могут связывать только этот фрагмент всей молекулы. Отсюда следует, что эти антитела могут не связывать или только слабо связывать целую молекулу. В WO 93/24531 получают поликлональные антитела против единственного произведенного из N-концевого про-МНП пептида. Показано, что полученные антитела действительно связывают иммунизирующий пептид (аминокислоты 47-64) в конкурентном тесте. Однако не показано, что эти антитела способны связывать N-концевой про-МНП в виде целой молекулы в пробе. Кроме того, описанный в WO 93/24531 сэндвич-тест в пробе не может проводиться, как описано, так как в распоряжении не имеется никакого подходящего стандартного материала и не представлены антитела против двух различных эпитопов.

Следующей проблемой в существующем уровне техники является чувствительность теста. При помощи проводимого в WO 93/24531 конкурентного теста, при котором пептид 47-64 в меченой форме конкурирует с пробой или с немеченым пептидом-стандартом 47-64 в отношении связывания с поликлональными антителами из кроличьей сыворотки, после 48-часовой инкубации достигается только очень умеренная конкуренция, из которых в лучшем случае может быть получен нижний предел обнаружения приблизительно 250 фмоль/мл. Это является недостаточным ни для дифференцирования здоровых и больных людей с сердечной недостаточностью, ни для разграничивающей классификации проб пациентов по степени тяжести сердечной недостаточности. Кроме того, продолжительные периоды инкубации конкурентного теста являются неприемлемыми для повседневных измерений проб в автоматизированной лаборатории.

Hunt et al., (Clinical Endocrinology, 47 (1997), 287-296) описан также конкурентный тест для обнаружения N-концевого про-МНП. Для этого следует пробу плазмы перед измерением экстрагировать, при этом существует опасность, что аналитическое средство разрушается и возникают ошибочные измерения. Применяемую здесь антисыворотку получают аналогично WO 93/24531 путем иммунизации аминокислотами 1-13 N-концевого про-МНП, в качестве стандарта используют пептид из аминокислот 1-21. Также и в этом тесте должно учитываться длительное время инкубации. После 24-часовой инкубации достигается нижний предел определения 1,3 фмоль/мл.

Таким образом, в предыдущем уровне техники не существует способа обнаружения N-концевого про-МНП, который при коротких периодах инкубации делает возможным надежное, чувствительное определение нативного N-концевого про-МНП.

Поэтому задача состояла в разработке способа обнаружения N-концевого про-МНП в пробе, в котором в значительной степени отсутствуют приведенные недостатки существующего уровня техники. В частности, должна достигаться высокая чувствительность в тесте, чтобы можно было дифференцировать пробы больных от проб здоровых людей и различать пробы пациентов NYHA-классов I-IV.

Эта задача решается при помощи более подробно определенного в формуле изобретения способа обнаружения N-концевого про-МНП в пробе. Способ отличается тем, что используют по меньшей мере два антитела, которые распознают различные эпитопы N-концевого про-МНП.

Существенным в рассматриваемом способе является то, что в пробе регистрируется нативный N-концевой про-МНП. Это означает, что антитела должны распознавать и специфически связывать интактную молекулу и возможно присутствующий нерасщепленный про-МНП (1-108) и по возможности также протеолитически расщепленные фрагменты в пробе. В способе используют по меньшей мере два различных антитела, которые связывают различные эпитопы N-концевого про-МНП. Эти эпитопы могут быть линейными или так называемыми конформационными эпитопами. Предпочтительно эпитопы локализованы таким образом, что оба антитела могут связываться одновременно), и находятся на не слишком большом расстоянии друг от друга.

Так как способ данного изобретения не позволяет различать N-концевой про-МНП, про-МНП и близкородственные пептиды (продукты распада), в дальнейшем под NT-проМНП понимают все узнаваемые в тест-способе пептиды, в частности, известный N-концевой про-МНП (1-76).

Под понятием "эпитоп" в соответствии с данным изобретением имеют в виду сайт связывания на иммунологическом партнере связывания, таком как, например, антиген, с которым специфически связыватся антитело. "Эпитоп" в большинстве случаев определяется однозначно 6-8 аминокислотами. Партнер связывания соответствует в соответствии с данным изобретением N-концевому про-МНП или его частичной последовательности. Эпитоп, с которым связывается антитело, является тогда частичным участком на партнере связывания. Эпитоп может находиться в линейной форме или в виде конформационного эпитопа.

При помощи обоих антител различной специфичности можно вместо конкурентного продолжительного проведения теста существующего уровня техники проводить более быстрый способ обнаружения анализируемого вещества. Способ обнаружения данного изобретения может осуществляться посредством гомогенного или гетерогенного проведения теста. Предпочтительным является гетерогенный тест и особенно предпочтительным является известный специалисту сэндвич-способ.

Предпочтительно такой способ определения N-концевого про-МНП проводят посредством следующих стадий:
a) преобразования пробы специфическим для N-концевого про-МНП первым антителом, которое имеет способную связываться с твердой фазой группу, через которую может происходить связывание с твердой фазой, или преобразования пробы специфическим для N-концевого про-МНП первым антителом, которое уже связано с твердой группой,
b) преобразование этого раствора вторым антителом, которое распознает другой эпитоп N-концевого про-МНП, чем первое антитело и которое имеет метку,
c) связывания образовавшихся иммунных комплексов с твердой фазой, причем твердая фаза может уже присутствовать на стадии а),
d) отделения твердой фазы от жидкой фазы,
e) детектирования метки в одной или обеих фазах.

При количественном определении такое же измерение проводят с определенным количеством N-концевого про-МНП в качестве стандарта и после определения пробы на стадии f) проводят сравнение измеренных значений стандарта со значением пробы и получают количественное значение.

Под понятием "антитело" понимают согласно данному изобретению моно- или поликлональные, химерные или гуманизированные или другие полученные генно-технологическими модификациями антитела, а также все известные специалисту фрагменты, такие как F(ab')₂, Fab' или Fab-фрагменты. Должна гарантироваться только иммунологически специфическая способность связывания с N-концевым про-МНП.

Первое специфическое для N-концевого про-МНП антитело может быть либо непосредственно связано с твердой фазой, либо связывание с твердой фазой происходит опосредованно через специфическую систему связывания. Прямое связывание этого антитела с твердой фазой происходит согласно известным специалисту методам, например адсорбционно. Если связывание проводится опосредованно через специфическую систему, то первое антитело является конъюгатом, который состоит из антитела против N-концевого про-МНП и партнера реакции специфической системы связывания. Под специфической системой связывания имеют в виду двух партнеров, которые могут специфически взаимодействовать друг с другом. Возможность связывания может быть при этом основана на иммунологической реакции или на другой специфической реакции. Предпочтительно в качестве специфической системы связывания используют комбинацию биотина и авидина или биотина и стрептавидина. Другими предпочтительными комбинациями являются биотин и антибиотин, гаптен и антигаптен, Fc-фрагмент антитела и антитело против этого Fc-фрагмента или углевод и лектин. Один из партнеров реакции специфической системы связывания является в этом случае частью конъюгата.

Другой партнер реакции специфической системы связывания для первого партнера реакции находится в виде покрытия твердой фазы. Предпочтительно здесь используют стрептавидин или авидин. Связывание другого партнера специфической системы связывания с нерастворимым материалом носителя может осуществляться обычными известными специалисту способами. При этом пригодным является как ковалентное, так и адсорбционное связывание.

В качестве твердой фазы пригодны химические пробирки или микротитрационные планшеты из полистирола или подобных пластмасс, которые покрыты на внутренней поверхности партнером реакции специфической системы связывания. Кроме того, пригодными и особенно предпочтительными являются вещества в форме частиц, такие как, например, латексные частицы, магнитные частицы, материалы молекулярных сит, стеклянные гранулы, полимерные трубки и т.п. В качестве носителей также могут применяться пористые слоистые носители, такие как бумага или нитроцеллюлоза. Особенно предпочтительно применяются магнитные шарики, так называемые гранулы, которые в свою очередь покрыты соответствующим партнером связывания вышеописанной специфической системы связывания. Эти микрочастицы после завершения тест-реакции для проведения последующих реакций обнаружения могут быть отделены, например, фильтрованием, центрифугированием или в случае магнитных частиц при помощи магнита от жидкой среды.

Второе специфическое антитело распознает другой эпитоп N-концевого про-МНП, чем первое антитело. Расстояние обоих эпитопов на молекуле должно быть таким большим, чтобы было возможным одновременное связывание без ограничения обоих антител на N-концевом про-МНП, так как в ином случае не может образоваться сэндвич-комплекс.

Детектирование специфической реакции связывания между антителами против N-концевого про-МНП и N-концевым про-МНП может выполняться различным образом. Обычно второе антитело является меченым. Обычными метками являются хромогены, флуорофоры, способные к хеми- или электрохемилюминесценции вещества, радиоактивные изотопы, гаптены, ферментные метки или вещества, которые в свою очередь могут образовывать специфическую пару связывания, такие как, например, биотин/стрептавидин. Обнаружение иммунного комплекса осуществляется в этом случае при помощи сигнала, который посылается меткой. Например, второе антитело может быть помечено гаптеном дигоксигенином. Этот гаптен в свою очередь связывается с дополнительным специфическим для дигоксигенина антителом. Специфическое для дигоксигенина антитело является меченным, например, ферментом, таким как пероксидаза. Конечное обнаружение происходит в этом случае при помощи изменения окраски или экстинкции, происходящего при превращении пероксидазой соответствующего субстрата.

В качестве проб для проведения способа для обнаружения N-концевого про-МНП могут применяться все известные специалисту биологические жидкости. Предпочтительно используются в качестве пробы жидкости тела, такие как цельная кровь, сыворотка крови, плазма крови, моча или слюна, особенно предпочтительно сыворотка и плазма крови.

Наряду с так называемыми мокрыми тестами, при которых тест-реагенты находятся в жидкости, могут также применяться все общепринятые сухие тест-форматы, которые пригодны для обнаружения антигенов, гаптенов, пептидов, белков, антител и т. д. При этих сухих тестах или тест-полосках, которые описаны, например, в ЕР-А-0186799, обычно все компоненты теста кроме подлежащей исследованию пробы наносят на носитель. Реакция обнаружения происходит, если эту тест-полоску приводят в контакт с жидкой пробой.

Способ данного изобретения отличается тем, что нижний предел обнаружения для N-концевого про-МНП находится ниже 1 фмоль/мл (соответствует 1 пмоль/л). Высокая чувствительность согласно данному изобретению <1 фмоль/мл достигается без продолжительных периодов инкубации. В целом продолжительность способа составляет в случае теста с микротитрационным планшетом менее 2 часов, предпочтительно с более чувствительными способами обнаружения, такими как электрохемилюминесценция, 15 минут. Верхнего предела подлежащей определению концентрации для способа обнаружения практически не существует. Технологически верхний предел обычно зависит от методов измерения. Способ определяет в принципе также очень высокие концентрации N-концевого про-МНП.

Следующим преимуществом способа данного изобретения является хорошая дифференциация проб пациентов с сердечной недостаточностью и без сердечной недостаточности при помощи полученных измеряемых величин. Способ обнаружения является настолько чувствительным, что может выполняться даже дифференциация между пациентами без коронарного заболевания и пациентами с лишь слабо выраженной или медленно начинающейся сердечной недостаточностью NYHA-классов I и II. Такое раннее распознавание начинающейся сердечной недостаточности может влиять на раннее медикаментозное лечение и тем самым заметно продлевать время жизни пациента.

Следующим объектом данного изобретения является рекомбинантно полученный N-концевой про-МНП. Под N-концевым про-МНП понимают отщепленную от большой молекулы-предшественника из 108 аминокислот про-МНП N-концевую часть, которая состоит из аминокислот 1-76. Под N-концевым про-МНП имеют в виду также его части, которые могут существовать в крови в результате реакций распада этой молекулы.

В существующем уровне техники до сих пор неизвестен рекомбинантный N-концевой про-МНП, так как невозможно его получение вследствие его короткой аминокислотной последовательности. Химический синтез пептида из более чем 30 аминокислот из-за возникающих ошибочных последовательностей и сильно снижающегося выхода на один синтетический цикл не является альтернативой рекомбинантному получению в организме-хозяине.

Однако для диагностического способа обнаружения всегда необходим стандартный или контрольный материал, с помощью которого можно, во-первых, выполнять количественное определение анализируемого вещества и, во-вторых, контролировать функционирование теста. Если требуется количественное определение, то можно предпринять при помощи ряда стандартов определенное количественное калибрование. Такое калибрование в свою очередь имеет также смысл только в том случае, если применяемый в качестве стандарта материал в иммунологическом тесте ведет себя так же, как анализируемое вещество, или подобно анализируемому веществу. При этом важно, чтобы стандарт имел достаточно большое структурное и особенно иммунологическое сходство с анализируемым веществом, чтобы связывание стандарта с антителами детектирования происходило так же, как оно происходит в этом случае также у нативной молекулы в пробе.

Такой стандартный материал для способа обнаружения N-концевого про-МНП отсутствует в существующем уровне техники. Описаны только короткие синтетические пептиды. В соответствии с данным изобретением впервые возможно при помощи синтеза генов получить последовательность ДНК, кодирующую N-концевой про-МНП, и затем получить рекомбинантную экспрессию N-концевого про-МНП в E. coli. Последовательность действий обсуждается в примере 1.

Таким образом, объектом данного изобретения является применение рекомбинантного N-концевого про-МНП в качестве стандарта в способе обнаружения N-концевого про-МНП в пробе с использованием по меньшей мере двух антител, которые распознают различные эпитопы N-концевого про-МНП.

Для целей иммунизации в существующем уровне техники использовали до сих пор только синтетические произведенные из N-концевого про-МНП короткие пептиды. Недостатком при иммунизации пептидами является то, что в большинстве случаев получают только имеющие очень низкую аффинность антитела или полученные антитела взаимодействуют только с линейными эпитопами, и антиген, нативно расположенный в пробе, не может связываться с ними (пример 3).

Поэтому важно для иммунизации с целью получения антител использовать иммуноген, который обнаруживает достаточно большое сходство с подлежащим обнаружению анализируемым объектом. Только таким образом гарантируется, что нативный анализируемый объект в пробе связывается этими антителами с высокой аффинностью.

Поэтому объектом изобретения является также применение рекомбинантного N-концевого про-МНП в качестве иммуногена для получения антител против N-концевого про-МНП.

Следующим объектом данного изобретения являются антитела против рекомбинантного N-концевого про-МНП. Определение понятия антитела дано при описании проведения теста. Антитела данного изобретения распознают предпочтительно специфически эпитоп в N-концевой части состоящего из 76 аминокислот N-концевого про-МНП, причем предпочтительно в области аминокислот 10-66, особенно предпочтительно в области аминокислот 10-50 или 10-38. Имеет смысл, чтобы узнаваемые антителами эпитопы были локализованы таким образом, что также и N-концевой про-МНП, который в пробе уже расщеплен протеолитически на его концах, еще содержал эти эпитопы. Таким образом, стабильность анализируемого объекта в пробе занимает скорее второе место по значению. Эпитопы в предпочтительных областях N-концевого про-МНП могут существовать в линейной форме или в виде конформационных эпитопов.

Поэтому предпочтительным объектом данного изобретения являются моноклональные антитела, которые продуцируются линиями клеток МАК М 10.1.1 и МАК М 13.4.14, депонированными и поступившими 26.01.1999 года в DSMZ - Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур GmbH, Braunschweig. В случае антител, которые продуцируются этими обеими клеточными линиями, речь идет об антителах типа IgG. Клеточные линии М 10.1.11 и М 13.4.14 также являются объектом данного изобретения.

Объектом данного изобретения являются также антитела, равным образом эквивалентные к специфическому связыванию с N-концевым про-МНП относительно продуцируемых клеточными линиями М 10.1.11 и М 13.4.14 антител. Под понятием "эквивалентно продуцируемые" антитела подразумевается, что эти антитела получают иммунизацией рекомбинантным N-концевым про-МНП.

Объектом данного изобретения являются также способы получения антител, которые специфически связывают N-концевой про-МНП.

Получение поликлональных антител осуществляют предпочтительно с использованием стадий иммунизации подходящего организма, такого как, например, овцы, посредством рекомбинантно полученного N-концевого про-МНП, выделения антител, скрининга на самые реактивные эпитопы и очистки антител посредством иммуносорбции на подходящих пептидах. Такой способ описан в примере 2.

Получение моноклональных антител происходит предпочтительно с использованием стадий иммунизации подходящего организма, такого как, например, мыши, посредством рекомбинантно полученного N-концевого про-МНП и отбора клонов по реактивности антител с нативным N-концевым про-МНП в различных пулах сывороток пациентов. Один такой способ описан в примере 3.

Нижеследующие примеры дополнительно поясняют данное изобретение.

ПРИМЕР 1. Способ получения рекомбинантного N-концевого про-МНП (1-76)
1. Клонирование рекомбинантного N-концевого про-МНП
Нуклеотидную последовательность N-концевого про-МНП (аминокислотной последовательности 1-76) получали с использованием генного синтеза. Для достижения в E.coli оптимальной экспрессии гена эту ДНК-последовательность согласовывали с наиболее часто используемыми в E.coli кодонами. Последовательности олигонуклеотидов, используемых для получения гена, являются такими, какие изображены ниже
Pro5' (SEQ ID NO:1)
5'CCGGATCCCACCCGCTG3'
Pro1hum (SEQ ID NO:2)
5'CGGGATCCCACCCGCTGGGTTCCCCGGGTTCCGCTTCCGACCTGGAAACCTCCGGTCTGCAGGAACAGCGTAACCACCT3'
Pro2hum (SEQ ID NO:3)
5'CGGTTCCAGGGAGGTCTGTTCAACCTGCAGTTCGGACAGTTTACCCTGCAGGTGGTTACGCTGTTCCTGC3'
Pro 3hum (SEQ ID NO:4)
5'CAGACCTCCCTGGAACCGCTGCAGGAATCCCCGCGTCCGACCGGTGTTTGGAAATCCCGTGAAGTTGCTAC3'
Pro4hum (SEQ ID NO:5)
5'CCCAAGCTTAACGCGGAGCACGCAGGGTGTACAGAACCATTTTACGGTGACCACGGATA
CCTTGGTAGCAACTTCACGGGATTTCC3'
Рrо3' (SEQ ID NO:6)
5'CCCAAGCTTAACGCGGAGC3'
Получение гена проводили с этими праймерами с использованием ПЦР (полимеразной цепной реакции). Амплифицированный ген клонировали в подходящий вектор, такой как, например, вектор pUC19 и секвенировали. Для клонирования гена в экспрессирующий вектор pQE8 ген вырезали по сайтам рестрикции BamHI и HindIII из вектора pUC19, лигировали в вектор pQE8, который делает возможной экспрессию белков с N-концевой гистидиновой меткой, и трансформировали в E.coli M15 [pREP4].

2. Экспрессия N-концевого про-МНП в E.coli
Для экспрессии этого гена в E.coli ночную культуру клона E.coli 1/60 в Luria-бульоне (с 100 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл канамицина) пересевали и при OD 550 1 индуцировали при помощи IPTG (изопропилтиогалактозида; конечная концентрация 1 мМ). После индукции эти культуры инкубировали еще в течение 4 часов при 37^oС. Культуры центрифугировали и осадок клеток помещали в 50 мМ Na-фосфатный буфер, рН 8,0; 300 мМ NaCl. После обработки клеточной суспензии ультразвуком суспензию центрифугировали и супернатант наносили на Ni-NTA (нитрило-триацетатную) колонку. После стадии промывки 50 мМ Na-фосфатным буфером, рН 8,0; 300 мМ NaCl; 20 мМ имидазолом меченный гистидиновой меткой N-концевой про-МНП элюировали 50 мМ Na-фосфатным буфером, рН 8,0; 300 мМ NaCl; 300 мМ имидазолом. Элюированные фракции объединяли и диализовали против 50 мМ Трис, рН 8,0. Для отделения примесей диализат наносили на колонку Q-сефарозы. Массу очищенного N-концевого про-МНП определяли по способу MALDI-TOF.

ПРИМЕР 2. Получение поликлональных антител против N-концевого про-МНП
1. Иммунизация
Овец иммунизировали рекомбинантным N-концевым про-МНП (1-76) в полном адъюванте Фрейнда. Доза составляла 0,1 мг на одно животное. Иммунизации повторяли на протяжении 10 месяцев с интервалом 4 недели. Спустя 6 недель после первой иммунизации и после этого ежемесячно брали пробы сыворотки и исследовали на чувствительность и титр.

2. Очистка поликлональных антител из сыворотки овец
Из неочищенной сыворотки одной иммунизированной рекомбинантным N-концевым про-МНП овцы удаляли липидные компоненты делипидированием аэросилом (коллоидной кремнекислотой) (1,5%). После этого иммуноглобулины осаждали сульфатом аммония (2М). Растворенный осадок диализовали против 15 мМ К₃РO₄, 50 мМ NaCl, рН 7,0 и хроматографировали через ДЭАЭ-колонку. Фракция IgG, РАК<рек. NT-про-MHП>S-IgG(DE) находилась в протекающем элюенте.

3. Последовательная аффинная хроматография для получения NT-про-МНП-специфических поликлональных антител
Для очистки NT-про-МНП-специфических направленных против аминокислот 1-21 поликлональных антител, РАК<рек. NT-про-МНП>М-IgG(IS, 1-21), использовали С-концевой биотинилированный пептид HPLGSPGSASDLETSGLQEQR-Bi (1-21-Bi, SEQ ID NO:7). Аффинный матрикс готовили загрузкой 10 мл покрытых стрептавидином частиц из метакрилатного полимера (Boerhinger Mannheim, Best. Nr. 1529188) 1 мг пептида (1-21-Bi).

10 мл этого аффинного матрикса помещали в колонку и уравновешивали 50 мМ К₃РO₄, 150 мМ NaCl, рН 7,5 (ЗФР). Для первой стадии последовательной аффинной хроматографии на колонку наносили 850 мг PAK<NT-про-MHП>S-IgG(DE). Проходящий раствор сохраняли для второй стадии (см. ниже). Колонку промывали ЗФР и 20 мМ КРO₄, 500 мМ NaCl, 0,1% Тритоном Х-100, 0,5% Na-диоксихолевой кислотой рН 7,5. Этот специфически связанный с аффинной колонкой IgG элюировали буфером для элюирования ImmunoPure^® Gentle Ag/Ab (Pierce, Product # 21013). Аффинный матрикс регенировали 1М пропионовой кислотой и хранили в ЗФP/NaN₃.

Таким же образом, как описано выше, пептид Bi-ELQVEQTSL (Bi-30-38 SEQ ID NO: 8) использовали для приготовления аффинного матрикса для очистки NT-про-МНП-специфических, направленных против аминокислот 30-38 иммуноглобулинов. РАК<рек. NT-про-MHП>M-IgG(IS, 30-38) получали из элюента первой аффинной очистки.

4. Биотинилирование PAK<NT-про-MHП>S-IgG(IS, 1-21)
Аффинно очищенные антитела диализуют против буфера для биотинилирования (100 мМ КРO₄, 70 мМ NaCl pH 8,0) и затем раствор доводят до концентрации белка 1 мг/мл. Эфир N-гидроксисукцинимида и D-биотиноиламинокапроновой кислоты растворяют в ДМСО и примешивают в молярном соотношении 1:7,5 к раствору антител. Реакцию останавливают добавлением L-лизина и избыточный реагент мечения удаляют диализом,
5. Дигоксигенилирование PAK<NT-про-MHП>S-IgG(IS, 30-38)
Аффинно очищенные антитела диализуют против буфера для дигоксигенилирования (100 мМ КРО₄, 70 мМ NaCl pH 8,0) и затем раствор доводят до концентрации белка 1 мг/мл. Эфир N-гидроксисукцинимида и дигоксигенин-3-СМЕ растворяют в ДМСО и примешивают в молярном соотношении 1:5 к раствору антител. Реакцию останавливают добавлением L-лизина и избыточный реагент мечения удаляют диализом.

ПРИМЕР 3. Получение моноклональных антител и скрининг на моноклональные антитела против N-концевого про-МНП (1-76)
1. Получение моноклональных антител против NT-про-МНП (1-76)
Мышей Balb/c в возрасте 8-12 недель иммунизируют внутрибрюшинно 100 мкг рекомбинантного N-концевого про-МНП-анти-гена с полным адъювантом Фрейнда. Спустя 6 недель проводят три дополнительные иммунизации с 4-недельным интервалом. Спустя одну неделю после последней иммунизации проводят взятие крови и определение титров антител в сыворотке экспериментальных животных. Из положительно реагирующих мышей получают В-лимфоциты из селезенки этих животных, которые сливают с перманентной линией миеломных клеток. Слияние осуществляют по известному способу Kohler und Millstein (Nature, 256, 1975, S. 495-497). Образующиеся при этом первичные культуры гибридных клеток клонируют обычным образом, например, с использованием коммерчески доступных клеточных сортеров или при помощи "лимитирующего разбавления". Далее обрабатывают только культуры-клоны, которые в подходящем тест-способе, например, в ферментном иммуноанализе (способе ELISA) положительно взаимодействуют с рекомбинантным N-концевым про-МНП и распознают природный N-концевой про-МНП в сыворотках пациентов (см. пункт 2). Таким образом получают несколько гибридомных клеточных линий, которые продуцируют моноклональные антитела в соответствии с данным изобретением.

Для получения асцитов 5•10⁶ гибридомных клеток впрыскивают внутрибрюшинно мышам Ваlb/с, которые предварительно были обработаны 1-2 раза 0,5 мл пристана. Спустя 2-3 недели из брюшной полости мышей может быть получена асцитная жидкость. Из нее обычным путем могут быть выделены антитела. Эти моноклональные антитела специфически направлены против человеческого N-концевого про-МНП. Они называются в дальнейшем МАК М 10.1.11 или МАК М 13.4.14. Оба эти моноклональные антитела относятся к подклассу IgGl, каппа.

Таким образом могут быть выделены обе гибридомные клеточные линии клон М 10.1.11 и М 13.4.14, которые были депонированы при DSMZ, как упоминалось выше.

2. Тест-скрининг на антитела против про-МНП-пептида и рекомбинантного NT-про-МНП
Для обнаружения присутствия и определения специфичности антител против N-концевого про-МНП в сыворотке иммунизированных мышей, в супернатанте культуры гибридных клеток или асцитной жидкости клоны оценивали с использованием следующих тестов.

а) Реактивность с рекомбинантным N-концевым про-МНП
Микротитрационные планшеты (Fa. Nunc, Maxisorb) связывают с 2,5 мкг/мл рекомбинантным NT-про-МНП в качестве антигена в буфере для загрузки (Fa. Boehringer, 0,2M карбонат/бикарбонат натрия, рН 9,3-9,5, номер по каталогу 726559) 100 мкл на лунку, 1 час при комнатной температуре при встряхивании. Последующую загрузку осуществляют в ЗФР-буфере (забуференном фосфатом солевом растворе, Fa. Oxid. Code-BR 14a) и 1% Вусо С, 30 минут. Затем промывают буфером для промывки (0,9 раствор хлорида натрия, 0,05% Твин 20). Инкубацию проб антител осуществляют с 100 мкл на лунку, 1 час при комнатной температуре при встряхивании. Затем снова промывают дважды раствором для промывки. Затем следует дополнительная инкубация с конъюгатами детектирующие антитела РАК<М-Fсγ>S-Fab-пероксидаза (Boerhinger Mannheim, номер по каталогу 1500686), 100 мЕ/мл, 100 мкл на лунку, 1 час при комнатной температуре при встряхивании. После новой стадии промывки буфером для промывки определяют обычным путем пероксидазную активность (например, с ABTS^®, 30 минут при комнатной температуре, регистрируя разность экстинкции в мЕ при 405 нм при помощи ELISA-ридера).

b) Реактивность с N-концевыми про-МНП-пептидами
В этом случае загруженные стрептавидином микротитрационные планшеты связывают с конъюгатами N-концевой про-МНП-пептид-биотин последовательностей 1-10, 8-18, 1-21, 16-30, 30-38, 39-50, 50-63 или 64-76 в качестве антигена, 250 нг/мл в ЗФР-буфере (забуференном фосфатом солевом растворе, Fa. Oxid. Code-BR 14а) с 0,5% Вусо С, 100 мкл на лунку, 1 час при комнатной температуре при встряхивании. Сразу после этого промывают водой (0,9 раствор хлорида натрия, 0,05% Твин 20). Инкубацию и реакцию детектирования проводят, как описано в а). Благодаря реакционноспособности с определенными пептидами N-концевого про-МНП можно определить положение эпитопа.

c) Реакционноспособность с нативным N-концевым про-МНП в пробе пациента.

Микротитрационные планшеты (Fa. Nunc, Maxisorb) связывают с 5 мкг/мл РАК<про-МНП человека>S-1gС (IS, (1-21) или (30-38)S-IgG в буфере для загрузки (Fa. Boehringer, 0,2M карбонат/бикарбонат натрия, рН 9,3-9,5, номер по каталогу 728559) 100 мкл на лунку, 1 час при комнатной температуре при встряхивании. Последующую загрузку осуществляют в ЗФР-буфере (забуференном фосфатом солевом растворе, Fa. Oxid. Code-BR 14a) и 1% Вусо С, 30 минут. Затем промывают буфером для промывки (0,9 раствор хлорида натрия, 0,05% Твин 20). Инкубацию с нативным антигеном в плазме пациента, разбавленной в ЗФР-буфере, осуществляют со 100 мкл на лунку, 1 час при комнатной температуре при встряхивании. Затем снова промывают дважды раствором для промывки и затем следует дополнительная инкубация с конъюгатами детектирующие антитела РАК<М-Fсγ>S-Fab-пероксидаза (Boerhinger Mannheim, номер по каталогу 1500686), 100 мЕ/мл, 100 мкл на лунку, 1 час при комнатной температуре при встряхивании. После новой стадии промывки буфером для промывки определяют обычным путем пероксидазную активность (например, с ABTS^®, 30 минут при комнатной температуре, регистрируя разность экстинкции в мЕ при 405 нм при помощи ELISA-ридера).

3. Результаты: распределение реактивности моноклональных и поликлональных антител против N-концевого про-МНП
а) Реактивность моноклональных антител (МАК) (с=5 мкг/мл) из иммунизации N-концевыми про-МНП-пептидами приведена в табл.1.

Моноклональные антитела, которые получали из иммунизации различными пептидами, реагировали очень сильно с присутствующими в каждом случае пептидами. Реактивность с рекомбинантным N-концевым про-МНП можно увидеть только у 2 моноклональных антител, в то время как с нативным N-концевым про-МНП в пуле пациентов не происходит реакция (см. таблицу 1).

b) Реактивность моноклональных антител (МАК) из иммунизации рекомбинантным N-концевым про-МНП приведена в табл.2.

Моноклональные антитела из иммунизации рекомбинантным N-концевым про-МНП реагировали только в отдельных случаях с пептидами, но очень сильно с рекомбинантным N-концевым про-МНП или с нативным N-концевым про-МНП в пуле пациентов. Отсутствие реакции отдельных моноклональных антител с пептидами указывает на распознавание так называемых конформационных эпитопов (см. таблицу 2).

с) Реактивность поликлональных антител (РАК) из иммунизации рекомбинантным N-концевым про-МНП приведена в табл.3.

Полученное поликлональное антитело (РАК) реагировало сильнее всего с пептидами 1-21 и 30-38. По этой причине были выбраны эти эпитопы и это РАК иммуносорбировалось положительно при помощи этих пептидов. Иммуносорбированное пептидом 1-21 РАК реагирует сильнее всего с участком 8-20 и явно слабее с М-концевой последовательностью 1-10. Иммуносорбированные таким образом РАК реагировали очень сильно с рекомбинантным N-концевым про-МНП и в РАК/РАК-сэндвич-формате с нативной пробой (см. таблицу 3).

ПРИМЕР 4. Высокочувствительный иммуноанализ для определения N-концевого про-МНП (NT-про-МНП).

При помощи полученных в примерах 2 и 3 антител удалось разработать высокочувствительный иммуноанализ. В общем пригодны все тест-форматы, при которых используются 2 антитела с различным распознаванием эпитопов. В качестве примера описан так называемый сэндвич-ELISA.

В качестве твердой фазы использовали покрытый стрептавидином микротитрационный планшет (МТП). 10 мкл необработанной пробы или калибратора вместе с 100 мкл буфера, который содержит оба эпитоп-специфических антитела, пипетировали в лунки МТП и инкубировали 1 час при комнатной температуре. В качестве антител использовали 1 мкг/мл биотинилированного поликло-нального антитела РАК<рек. NT-про-MHП>S-IgG(IS, 1-21) и 0,5 мкг/мл диоксигенилированного поликлонального антитела РАК<рек. NT-про-MHП>S-IgG(IS, 30-38). После этого раствор отсасывают и промывают 3х350 мкл буфера для промывки. После этого пипетируют 100 мкл раствора конъюгата и снова инкубируют 1 час при комнатной температуре. В качестве конъюгата применяют конъюгат анти-дигоксин-антитела-POD в концентрации 100 мМЕ/мл. После этого раствор конъюгата отсасывают и промывают 3х350 мкл промывного буфера. Наконец, пипетируют ABTS^®-субстратный раствор в лунки и измеряют в течение 30 минут при комнатной температуре. После достижения 30-минутной реакции с субстратом микротитрационный планшет тотчас же измеряют в МТП-планшет-ридере при длине волны 405 нм против ссылочной длины волны 495 нм.

Для определения чувствительности строили калибровочную кривую и определяли точность нулевого стандарта (n=21). В качестве калибраторов использовали ЭДТА-плазму человека, в которую вносили рекомбинантный N-концевой про-МНП в требующейся концентрации. В качестве нулевого стандарта использовали плазму крупного рогатого скота. Результаты представлены в таблице 4.

По наклону калибровочной кривой 22,5 мЕ•мл/фмоль и стандартному отклонению (SD) 5,7 мЕ рассчитывали в соответствии с формулой Кайзера следующий нижний предел детектирования:
НПД=3SD_нул.ст./наклон кал.кривой=3•5,7/22,5=0,76 фмоль/мл.

ПРИМЕР 5. Определение стабильности в пробах N-концевого про-МНП
С использованием описанного в примере 4 сэндвич-ELISA измеряли стабильность анализируемого N-концевого про-МНП. Для этого у 4 пациентов NYHA-классов II-III брали кровь в ЭДТА-содержащие пробирки для взятия крови и выдерживали при комнатной температуре на протяжении 3 дней. Каждый день брали одну пробу и измеряли содержание N-концевого про-МНП. Сравнительную пробу, как и пробы для определения стабильности, в ЭДТА-плазме сразу же охлаждали до 4-8^oС и центрифугировали в пределах 15 минут. ЭДТА-плазмы выдерживали при 4^oС и при комнатной температуре и в различных временных точках в пределах 24-часового периода испытания измеряли. Результаты представлены в таблице 5.

Эти данные доказывают, что N-концевой про-МНП в течение эксперимента является полностью стабильным и, следовательно, годен в качестве традиционного параметра. Этот результат противоречит литературе (Hunt et al., Clinical Endocrinology, 47, 287 (1997)) и подтверждает предположение, что посредством выбора и построения этого теста с 2 специфическими антителами, эпитопы которых находятся на наружных концах анализируемого объекта, можно влиять на стабильность анализируемого объекта.

ПРИМЕР 6. Определение диагностической чувствительности анализов N-концевого про-МНП.

Для установления диагностической чувствительности использовали описанный в примере 4 тест. Для этого проводили измерения с 114 здоровыми людьми и 235 пациентами с NYHA классификацией между I и IV. Обычно особенно критическим является отличие здоровых людей от пациентов NYHA-класса I.

При помощи этого высокочувствительного анализа у 110 здоровых доноров крови получили показатель медианы 6,6 фмоль/мл N-концевого про-МНП со стандартным отклонением 7,3 фмоль/мл. Самый низкий показатель был 0,2 фмоль/мл. Это ясно показывает, что необходима чувствительность <1,0 фмоль/мл, чтобы точно включить в себя область сравнения. С использованием этого распределения верхняя область нормальных величин (97,5%) была получена с 26,6 фмоль/мл.

Приняв область сравнения 0-26,6 фмоль/мл, из 233 пациентов с NYHA-классификацией I-IV только 16 пациентов имели показатель в нормальной области. Это соответствует клинической чувствительности 93,3%. Если наблюдаются только пациенты с NYHA-классификацией I, то 30-37 пациентов признаются положительными, что соответствует чувствительности 81,1%.

Этот результат подтверждает, что при помощи этого высокочувствительного анализа N-концевого про-МНП возможна четкая дифференциация между пациентами с сердечной недостаточностью NYHA-класса I и здоровыми людьми. Это не достигалось с использованием методов анализа, известных из уровня техники (Dagubatti et al.. Cardiovascular Research, 36 (1997), 246.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу обнаружения N-концевого про-МНП, рекомбинантному N-концевому про-МНП, его применению в качестве стандарта в способе обнаружения N-концевого про-МНП, а также к антителам, которые распознают рекомбинантный N-концевой про-МНП, и их получению. Сущность изобретения состоит в том, что для обнаружения N-концевого про-МНП в пробе используют по меньшей мере два антитела, которые распознают различные эпитопы N-концевого про-МНП. Техническим результатом является разработка высокочувствительного способа обнаружения N-концевого про-МНП в пробе, позволяющего дифференцировать здоровых людей и больных с сердечной недостаточностью. 7 с. и 12 з.п.ф-лы, 5 табл.

1. Способ обнаружения N-концевого про-МНП в пробе, отличающийся тем, что используют по меньшей мере два антитела, которые распознают различные эпитопы N-концевого про-МНП.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитела могут одновременно связываться на N-концевом про-МНП.3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что способ проводят в виде гетерогенного способа.4. Способ по п.3, отличающийся тем, что способ проводят в сэндвич-формате.5. Способ по одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что нижний предел обнаружения для N-концевого про-МНП находится ниже 1 фмоль/мл используемой пробы пациента.6. Способ по одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что при помощи полученных показателей можно проводить дифференциацию между пробами здоровых пациентов и пробами пациентов с сердечной недостаточностью NУHA-классов I-IV.7. Способ по п.6, отличающийся тем, что при помощи полученных показателей можно проводить дифференциацию между пробами здоровых пациентов и пробами пациентов NУHA-класса I.8. Рекомбинантный N-концевой про-МНП.9. Рекомбинантный N-концевой про-МНП по п.8, отличающийся тем, что он пригоден в качестве стандарта в способе для обнаружения N-концевого про-МНП по пп.1-7.10. Рекомбинантный N-концевой про-МНП по п.8, отличающийся тем, что он пригоден для получения антител против N-концевого про-МНП.11. Антитела против рекомбинантного N-концевого про-МНП.12. Антитела по п.11, отличающиеся тем, что они специфически связываются в области аминокислот 10-66 N-концевого про-МНП.13. Антитела по п.11 или 12, полученные иммунизацией подходящего организма рекомбинантно полученным N-концевым про-МНП.14. Антитела по пп.11-13, полученные из депонированных 26.01.1999 года в DSMZ клеточных линий М 10.1.11 (регистрационный номер DSM АСС 2386) или М 13.4.14 (регистрационный номер DSM АСС 2387).15. Антитела по п.14, полученные аналогичным образом с N-концевым про-МНП, как и антитела, продуцируемые клеточными линиями М 10.1.11 (регистрационный номер DSM АСС 2386) или М 13.4.14 (регистрационный номер DSM АСС 2387).16. Штамм клеточной линии М 10.1.11 (регистрационный номер DSM АСС 2386), депонированный 26.01.1999 года в DSMZ.17. Штамм клеточной линии М 13.4.14 (регистрационный номер DSM АСС 2387), депонированный 26.01.1999 года в DSMZ.18. Способ получения поликлональных антител по пп.11-13 или 15, включающий стадии иммунизации подходящего организма рекомбинантно полученным N-концевым про-МНП, выделения антител, скрининга на самые реактивные эпитопы и очистки антител посредством иммуносорбции на подходящих пептидах.19. Способ получения моноклональных антител по пп.11-15, включающий стадии иммунизации подходящего организма рекомбинантно полученным N-концевым про-МНП и отбора клонов на основании реактивности антител с нативным N-концевым про-МНП в различных пулах сывороток пациентов.