СПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ Российский патент 2008 года по МПК C07K16/26 C07K14/58 C07K7/06 C07K7/08 C07K16/06 C12P21/00 C12N5/12 C12N5/20 G01N33/74 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области диагностики in vitro желудочковой сердечной недостаточности.

Уровень техники

Сердечная недостаточность (congestive heart failure) - это распространенный клинический синдром, особенно у пожилых людей. Обычно он проявляется в виде скрытого нарастания неспецифических симптомов, таких как кашель при физической нагрузке, усталость и появление периферических отеков. Диагностика по традиции основывается на исследовании различных параметров, таких как клинические признаки (разделенные на 4 стадии от I до IV по классификации NYHA, т.е. Кардиологической ассоциации Нью-Йорка), эхокардиография, сцинтиграфия, тест на физическую нагрузку и др.

По причине тяжести сердечного заболевания, а также высоких затрат на уход, конечно, ранняя диагностика весьма желательна: она способствует предупреждению быстрого прогрессирования этого синдрома в тяжелую форму сердечной недостаточности. Таким образом, необходима идентификация лиц с риском сердечной недостаточности. Это бы также позволило быстрее, легче и с меньшими затратами адаптировать последующую терапию. К сожалению, полностью удовлетворительного и полностью информативного метода диагностики сердечной недостаточности еще нет.

Длительное время проводились поиски пресимптоматических прогностических маркеров сердечной недостаточности. В этом отношении привлекает внимание то, что кардиомиоциты вырабатывают и секретируют пептиды, обладающие натриуретической активностью: пептид из предсердий сердца - ANP (atrial natriuretic peptide, т.е. натриуретический пептид предсердий), открытый у крыс de Bold et al.. Life Science 1981, vol. 28(1): 89-94, и натриуретический пептид предсердно-желудочкового происхождения, названный BNP (brain natriuretic peptide, т.е. натриуретический пептид мозга), открытый Sudoh et al.. Nature 1988, vol. 332: 78-81, у свиней, а затем у человека.

Предшественником BNP является препроBNP(1-134), запасная форма молекулы внутри кардиомиоцитов. Он подвергается расщеплению с отделением сигнального пептида и проBNP(1-108) (пропептид BNP(1-108). ПроBNP(1-108) представляет собой полипептид из 108 аминокислот, имеющий следующую последовательность:

H₁PLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATE GIRGHRKMVLYTLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH₁₀₈ (SEQ ID No. 1).

Он подвергается расщеплению, до и/или во время секреции, между аминокислотами Arg⁷⁶ и Ser⁷⁷, образуя, с одной стороны, BNP, также называемый BNP(77-108) или BNP-32, либо BNP(1-32), и N-концевой фрагмент прогормона - BNP(1-76), также называемый N-концевым фрагментом проBNP или NT-проBNP.

BNP или BNP(77-108), вазоактивная форма молекулы, представляет собой пептид из 32 аминокислот, имеющий следующую последовательность:

S₇₇PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH₁₀₈ (SEQ ID No. 2).

NT-проBNP или BNP(1-76) состоит из 76 N-концевых аминокислот проBNP(1-108), образующих следующую последовательность:

HiPLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATE GIRGHRKMVLYTLRAPR₇₆ (SEQ ID No. 3).

Уровень гормональной формы BNP - BNP(77-108) в плазме крови повышается у больных с дистрофией желудочков. Кстати, определение уровня BNP(77-108) в плазме крови было описано в связи с его применением как прогностического маркера желудочковой сердечной недостаточности. В то же время хорошо известно, что гормон BNP(77-108) мало стабилен. Отсюда следует, что его определение требует особой осторожности: Davidson N.C. et al.. Circulation 1995, 91: 1276; Gobiner-Georges et al., Clin. Chem. Lab. Med. 2000, 38: 519-23). Более того, BNP имеет очень короткое время полужизни, и его концентрация в плазме повышается слабо. Отсюда следует, что наблюдается определенное количество ложно-отрицательных ответов у лиц с риском сердечной недостаточности. Таким образом, определение BNP(77-108) не позволяет правильно отличить больных на стадии I по классификации NYHA от здоровых лиц (Clerico A. et al., J. Endocrinol. Invest. 1998, 21: 170-9; Del Ry S. et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 2000, 60: 81-90).

Чтобы обойти эти трудности, в патентной заявке WO 93/24531 описан метод диагностики in vitro сердечной недостаточности, основанный на обнаружении BNP(1-76), т.е. N-концевого фрагмента проBNP - распространенного соединения, имеющего продолжительное время полужизни по сравнению с гормоном BNP(77-108). Во всяком случае, метод, описанный в заявке WO 93/24531, не так уж легко применим к BNP(1-76) в образцах крови. В самом деле, единственные представленные примеры реализованы не на реальной сыворотке, а на серии стандартов, полученных с помощью синтетического пептида - пептида BNP(47-64), представляющего собой часть последовательности BNP(1-76). Для компенсации этого недостатка потребовалось задействовать автоматизированную и очень сложную систему.

В статье Hunt et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 214(3), 1885, pp.1175-1183, описано применение конкурентной разновидности метода РИА для определения BNP(1-76) в плазме больных сердечной недостаточностью с применением антисыворотки против N-концевого фрагмента BNP(1-13). В этой статье показано, что при сердечной недостаточности уровень BNP(1-76), который очень хорошо коррелирует с уровнем BNP(77-108), заметно повышается по отношению к его уровню у контрольных лиц. Вместе с тем, описанная методика специфической экстракции одного BNP(1-76) из плазмы является сложной, поскольку она требует экстрагирования плазмы с помощью картриджа Sep-pak С 18 (Millipore-Waters) с последующей хроматографией методом ВЭЖХ. Кроме того, в этой статье подчеркивается, что применяемый при определении метод РИА, по-видимому, не распознает проBNP(1-108). В ней также предполагается, что проBNP(1-108) может секретироваться в кровоток из сердечной ткани, однако он затем подвергается быстрой деградации до меньшего пептида путем отщепления N-концевых аминокислот. Кроме того, согласно этой статье, проBNP(1-108) может принимать такую форму, с которой антисыворотка к проBNP(1-108) не способна связываться. Наконец, авторы предполагают, что сам BNP(1-76) (N-концевой фрагмент проBNP) мог бы служить более специфичным маркером сердечной дисфункции, чем BNP(77-108) или N-концевой фрагмент проANP.

В статье Kari et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1999, 59 (suppi 230): 177-181 описан метод обнаружения BNP(1-76), подобный методу патентной заявки WO 93/24531, однако в ней не приведены результаты, полученные на образцах больных.

В статье Schuiz et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 2001, vol. 61, pp.33-42 также описано радиоиммунологическое определение, специфичное к BNP(1-76) (N-концевому фрагменту проBNP), без экстракции, с помощью антисыворотки против аминокислот 1 -21 этого фрагмента. Авторы подтвердили полезность определения BNP(1-76) для диагностики желудочковой сердечной недостаточности, а также его хорошую корреляцию с определением BNP(77-108). При изучении различных циркулирующих форм проBNP(1-108) они выдвинули гипотезу, что проBNP(1-108) может циркулировать в крови одновременно в виде интактного прогормона и в виде продуктов расщепления - BNP(1-76) (N-концевого фрагмента проBNP) и BNP(77-108). В то же время в статье ничего не говорится и не предполагается касательно возможной физиологической активности проBNP(1-108) или какой-либо диагностической пользы проBNP(1-108) в качестве прогностического или диагностического маркера желудочковой сердечной недостаточности.

В статье Shimizu et al., Clinica Chimica Acta, 2002, vol. 316, pp.129-135 представлено исследование деградации BNP человека в крови и циркулирующих молекулярных форм иммунореактивного BNP в плазме больных сердечной недостаточностью. В их плазме наблюдается присутствие двух форм иммунореактивного BNP: BNP с высоким молекулярным весом (36 кДа), который может соответствовать тримеру проBNP(1-108), и BNP с низким молекулярным весом. Последний соответствует одновременному присутствию одного из продуктов деградации BNP-32, лишенного N-концевых серина и пролина (т.е. это ASerPro-BNP, иначе BNP(3-32), и гормональной формы BNP-32, называемой BNP(1-32). Таким образом, из сердца в кровь секретируются проBNP(1-108) и гормональный BNP (то есть BNP-32 или BNP(1-32), иначе BNP(77-108). Тем не менее, авторы как будто предполагают, что проBNP(1-108) в олигомеризованном виде (тример) присутствует в концентрации, близкой к концентрации циркулирующего BNP(77-108), но ее они не измеряли. Вследствие этого не была изучена корреляция между концентрацией проBNP(1-108) и клиническим состоянием больных. Таким образом, диагностическое или прогностическое значение проBNP(1-108) в сыворотке крови не было установлено. И тем более не предполагалось, что возможно рутинное определение проBNP(1-108).

Впрочем, известно некоторое число эпитопов на проBNP(1-108). Так, в рамках обнаружения BNP(77-108) в заявке WO 97/32900 описан эпитоп с последовательностью S₇₇PKMVQGSGC₈₆ (SEQ ID No. 105), соответствующей 10 N-концевым аминокислотам BNP(77-108). Аналогичным образом, в рамках обнаружения BNP(1-76) (N-концевого фрагмента проBNP) в заявке WO 00/35951 описан эпитоп с последовательностью R₆₅KMVLYTLRAPR₇₆ (SEQ ID No. 106), соответствующий 12 С-концевым аминокислотам BNP(1-76) (N-концевого фрагмента проBNP), а близкая последовательность H₆₄RKMVLYTLRAPR₇₆ (SEQ ID No. 107) описана в заявке WO 00/45176. Тем не менее, ни в одной из этих патентных заявок не описано и не предполагается существование промежуточного эпитопа или гибрида между этими последовательностями.

Таким образом, все еще существует потребность, в рамках ранней диагностики сердечной недостаточности, в таком методе, который был бы лишен недостатков предшествующего уровня техники. В частности, существует потребность в таком простом методе, имеющем рутинное применение и надежном, который был бы лишен неудобства обнаружения BNP(77-108) - малораспространенной и не очень стабильной молекулы, и при этом совсем избежать сложных экстракций, необходимых при определении других молекулярных форм BNP, при которых даже может потребоваться сложнейшая автоматизация.

Раскрытие изобретения

Авторы настоящего изобретения поэтому решили разработать альтернативный метод для решения поставленной проблемы. В основе настоящего изобретения лежит неожиданное, сделанное авторами изобретения, открытие одного эпитопа с уникальными свойствами, располагающегося в районе шарнирной последовательности Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅ (SEQ ID No. 4) или последовательности Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ (SEQ ID No. 108) из проBNP(1-108) и содержащего как минимум последовательность RAPR₇₆S₇₇P (SEQ ID No. 5).

В самом деле, при иммунизации кроликов одним пептидом из шарнирного участка проBNP(1-108) с последовательностью CY₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅ (SEQ ID No. 16) либо пептидом с последовательностью CY₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ (SEQ ID No. 109) они обнаружили, весьма неожиданно, что полученная антисыворотка не только содержала антитела, специфически распознающие данный пептид из шарнирного участка и практически не распознающие формы BNP(1-76) и BNP(77-108), но также обладающие способностью к распознаванию циркулирующего проBNP(1-108).

Авторы настоящего изобретения, кроме того, впервые показали, что циркулирующий проBNP(1-108) является эффективным прогностическим маркером сердечной недостаточности и что его концентрация существенно выше у больных с сердечной недостаточностью, чем у здоровых контролей.

Авторы также открыли, что другой способ получения таких антител заключается в иммунизации животных с помощью целой молекулы проBNP(1-108). Действительно, авторы обнаружили, что иммунизация целой молекулой проBNP(1-108) способна вызвать появление антител, специфически распознающих последовательность из шарнирного участка.

Более того, авторы настоящего изобретения показали, что минимальный эпитоп, распознаваемый антителами по изобретению, имеет следующую последовательность: RAPR₇₆S₇₇P. Кроме того, они показали, что хороший способ получения антител по настоящему изобретению заключается в иммунизации животных пептидами общей формулы

где a₁ означает Н или функциональную группу или химическую группировку, выбранную из тиоловой, спиртовой, аминоокси- функциональных групп, первичного или вторичного амина, аминокарбоксильной, биотинильной и ацетильной групп,

X₁ - пептидная последовательность из 0-3 аминокислот, происходящая или не происходящая из природной последовательности проBNP(1-108),

Х₂ - пептидная последовательность из 0-8 аминокислот, предпочтительно из 7 аминокислот, происходящая или не происходящая из природной последовательности проBNP(1-108),

а₂ - функциональная группа ОН, NH₂ или алкоксильная группа.

Кроме того, авторы настоящего изобретения показали, что можно получить такие же специфические антитела при иммунизации животных пептидом, содержащим последовательность RAPR₇₆S₇₇P или пептидом формулы

X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅-Z(II)

где Х означает Н или ацетильную группу либо 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108), a Z означает группу ОН или 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108).

Кроме того, авторы настоящего изобретения показали, что можно получить такие же специфические антитела при иммунизации животных пептидом по формуле

X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄-Z(III)

где Х означает Н или ацетильную группу либо 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108), a Z означает группу ОН или 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108).

Авторы настоящего изобретения также разработали простой и надежный метод ранней диагностики сердечной недостаточности, основывающийся на определении циркулирующего в крови проBNP(1-108), а также набор, позволяющий осуществлять такое определение циркулирующего проBNP(1-108).

Таким образом, предметом настоящего изобретения являются антитела к проBNP(1-108), отличающиеся тем, что, с одной стороны, они распознают специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅ из проBNP(1-108) и практически не распознают ни BNP(1-76), ни BNP(77-108), а с другой стороны - обладают способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека.

Предметом настоящего изобретения также являются антитела к проBNP(1-108), отличающиеся тем, что, с одной стороны, они распознают специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ из проBNP(1-108) и практически не распознают ни BNP(1-76), ни BNP(77-108), а с другой стороны - обладают способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека.

В частности, предметом настоящего изобретения являются антитела к проBNP(1-108), характеризующиеся тем, что, с одной стороны, они распознают специфическим образом последовательность RAPR₇₆S₇₇ из проBNP(1-108) и практически не распознают ни BNP(1-76), ни BNP(77-108), а с другой стороны - обладают способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека.

Кроме того, предметом настоящего изобретения является способ получения антител к проBNP(1-108), распознающих специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅, последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающих способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека, который отличается тем, что животных иммунизируют целой молекулой проBNP(1-108), а также тем, что полученную антисыворотку истощают с помощью пептида BNP(77-108) и/или пептида ВМР(1-76).

Под "истощением антисыворотки" против данного конкретного антигена (иммунизирующего антигена) понимается удаление неспецифических антител, которые могут присутствовать в антисыворотке, путем обработки и инкубирования этой антисыворотки с "неспецифическими антигенами", то есть антигенами, отличными от иммунизирующего антигена, а затем отделения и иммунологического удаления антител, прореагировавших с данными "неспецифическими антигенами", и выделения истощенной таким образом антисыворотки (т.е. обедненной неспецифическими антителами). Истощение в классическом виде служит для того, чтобы сделать полученную антисыворотку специфичной к данному антигену.

В настоящем случае антисыворотка, распознающая последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅ и/или последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSg4 или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), может быть истощена, то есть она станет специфической путем обработки ее вышеуказанными BNP(77-108) и/или BNP(1-76), причем эти последние, к примеру, могут быть иммобилизованы на твердой фазе и служить в качестве носителя при хроматографии методом иммуноадсорбции согласно традиционным методам, известным в этой области. При этом антитела, находящиеся в конечном счете в истощенной антисыворотке, являются поликлональными и моноспецифическими.

Предметом настоящего изобретения также является пептид формулы

a₁-X₁-RAPRSP-X₂-a₂ (I)

где a₁ означает Н или функциональную группу или химическую группировку, выбранную из тиоловой, спиртовой, аминоокси- функциональных групп, первичного или вторичного амина, аминокарбоксильной, биотинильной и ацетильной групп,

X₁ - пептидная последовательность из 0-3 аминокислот, происходящая или не происходящая из природной последовательности проBNP(1-108),

Х₂ - пептидная последовательность из 0-8 аминокислот, предпочтительно из 7 аминокислот, происходящая или не происходящая из природной последовательности проBNP(1-108),

а₂ - функциональная группа ОН, NH₂ или алкоксильная группа.

Предметом настоящего изобретения также является пептид формулы

X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅-Z (II)

где Х означает Н или ацетильную группу либо 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108), a Z означает группу ОН или 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108).

Предметом настоящего изобретения также является пептид формулы

X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄-Z (III)

где Х означает Н или ацетильную группу либо 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108), a Z означает группу ОН или 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108).

Следует отметить, что в вышеприведенных формулах (II) и (III) номера аминокислот (Y₇₀, R₇₆, S₇₇, S₈₄, G₈₅) сохраняются просто для того, чтобы облегчить понимание изобретения, а также для сравнения этой последовательности с последовательностью проBNP(1-108). В данной заявке есть и другие последовательности, которые приводятся вместе с номерами.

Изобретение также касается всех пептидов, содержащих последовательность X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅-Z (II) или последовательность X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄-Z (III) либо одну из последовательностей (II) или (III) в замещенной форме, консервативным или неконсервативным образом, по какой-либо из аминокислот в положении от 70 до 85 или 84 соответственно, при условии, что участок RAPR₇₆S₇₇R остается интактным (в частности, незамещенным).

При этом имеются в виду пептиды, имеющие последовательность, происходящую из последовательности X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅-Z (II) или последовательности X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄-Z (III) путем замены одной или нескольких аминокислот из числа Y₇₀, T₇₁, L₇₂, К₇₉, M₈₀, V₈₁, Q₈₂, G₈₃, S₈₄ и G₈₅, причем Х может отсутствовать или означает группу NH₂ либо 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108), a Z может отсутствовать или означает группу ОН или 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108).

Наконец, изобретение касается пептида с последовательностью Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅ и пептида с последовательностью Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄.

Следующим предметом изобретения является способ получения антител к проBNP(1-108), распознающих специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅, Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающих способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека, который характеризуется тем, что животное иммунизируют пептидом формулы:

a₁-X₁-RAPRSP-X₂-a₂ (I)

где a₁, X₁, X₂ и а₂ имеют те же значения, что и выше,

а также тем, что полученную антисыворотку при необходимости истощают с помощью пептида BNP(77-108) и/или пептида BNP(1-76). Полученные при этом антитела являются моноспецифическими.

Следующим предметом изобретения является способ получения антител к проBNP(1-108), распознающих специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅, Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающих способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека, который характеризуется тем, что животное иммунизируют пептидом формулы

X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅-Z(II)

или пептидом формулы

X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄-Z(III),

где Х и Z означают то же, что и выше,

а также тем, что полученную антисыворотку при необходимости истощают с помощью пептида BNP(77-108) и/или пептида BNP(1-76).

Предметом изобретения также является способ получения гибридомы, секретирующей антитела к проBNP(1-108), распознающие специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅, Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающие способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека, который характеризуется тем, что животное иммунизируют пептидом формулы

X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅-Z(II)

или пептидом формулы

X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄-Z (III)

в замещенной форме, консервативным или неконсервативным образом, при условии, что участок RAPR₇₆S₇₇P остается интактным (в частности, незамещенным), где Х и Z означают то же, что и выше, а также тем, что полученную антисыворотку при необходимости истощают с помощью пептида BNP(77-108) и/или пептида BNP(1-76).

Следующим предметом изобретения является способ получения антител к проBNP(1-108), распознающих специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅, Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающих способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека, который характеризуется тем, что животное иммунизируют пептидом с последовательностью Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅ или пептидом с последовательностью Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄, а также тем, что полученную антисыворотку при необходимости истощают с помощью пептида BNP(77-108) и/или пептида BNP(1-76).

Предметом изобретения также является способ получения гибридомы, секретирующей антитела к проBNP(1-108), распознающие специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅, Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающие способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека, который характеризуется тем, что:

- животное иммунизируют пептидом, выбранным из числа пептидов следующих формул:

a₁-X₁-RAPRSP-X₂-a₂ (I)

где a₁, X₁, X₂ и а₂ имеют те же значения, что и выше;

X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅-Z(II)

где Х и Z имеют те же значения, что и выше;

X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄-Z(III)

где Х и Z имеют те же значения, что и выше;

X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅-Z(II)

в замещенной форме, консервативным или неконсервативным образом, при условии, что участок RAPR₇₆S₇₇P остается интактным (в частности, незамещенным), где Х и Z имеют те же значения, что и выше;

X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄-Z(III)

в замещенной форме, консервативным или неконсервативным образом, при условии, что участок RAPR₇₆S₇₇P остается интактным (в частности, незамещенным), где Х и Z имеют те же значения, что и выше;

Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅

и Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄;

- выделяют лимфоциты, секретирующие иммуноглобулины этого животного, а также

- осуществляют слияние лимфоцитов с клетками миеломы для получения, по меньшей мере, одной гибридомы, секретирующей иммуноглобулины.

Этот способ соответствует классической методике получения гибридом, принцип которой описан в Kohler et Milstein (1975) Nature (London), 256: 495-497.

Предметом изобретения также является такая гибридома и моноклональные антитела к проBNP, секретируемые данной гибридомой.

Кроме того, предметом изобретения является способ диагностики in vitro сердечной недостаточности у человека, включающий обработку биологических образцов, предпочтительно крови, плазмы или сыворотки, антителами к проBNP(1-108), распознающими специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅, последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающие способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека, и детектирование проBNP(1-108) в образцах.

Изобретение обеспечивает обобщенным образом способ диагностики in vitro сердечной недостаточности у человека, включающий стадии:

a) обработки биологических образцов, предпочтительно крови, плазмы или сыворотки, антителами к проBNP(1-108), распознающими специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅, последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающими способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека;

b) инкубации этой смеси в условиях, способствующих образованию комплексов антиген-антитело;

c) обнаружения образовавшихся комплексов антиген-антитело, при необходимости с помощью детектирующих антител, меченых и способных к специфическому связыванию с проBNP(1-108), присутствующим в первом комплексе, либо с помощью детектирующего антигена, меченого и способного к связыванию с антителами к проBNP(1-108), присутствующими в первом комплексе.

В частности, изобретение обеспечивает способ диагностики сердечной недостаточности, который включает помимо вышеуказанных стадий a, b и с также стадию d) коррелирования количества обнаруженных комплексов антиген-антитело с клиническим состоянием субъекта.

Кроме того, предметом настоящего изобретения является набор для обнаружения проBNP(1-108) в биологических образцах, особенно в образцах крови, плазмы или сыворотки, содержащий, по меньшей мере, одно антитело к проBNP(1-108), распознающее специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅, последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающее способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека.

Наконец, изобретение предусматривает набор для обнаружения проBNP(1-108) в биологических образцах, особенно в образцах крови, плазмы или сыворотки, содержащий в качестве стандарта или контроля композицию, содержащую, по меньшей мере, один пептид, выбранный из числа пептидов следующих формул:

a₁-X₁-RAPRSP-X₂-a₂ (I)

где a₁, X₁, Х₂ и а₂ имеют те же значения, что и выше;

X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅-Z(II)

где Х и Z имеют те же значения, что и выше;

X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅-Z(II)

в замещенной форме, консервативным или неконсервативным образом, при условии, что участок RAPR₇₆S₇₇P остается интактным (в частности, незамещенным), где Х и Z имеют те же значения, что и выше;

X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄-Z(III)

где Х и Z имеют те же значения, что и выше;

X-Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄-Z(III)

в замещенной форме, консервативным или неконсервативным образом, при условии, что участок RAPR₇₆S₇₇P остается интактным (в частности, незамещенным), где Х и Z имеют те же значения, что и выше;

Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅;

Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄.

Определения

В контексте изобретения "биологический образец", а также "образец биологической жидкости" предпочтительно состоит из биологической жидкости, такой как кровь, плазма, сыворотка, моча, спинномозговая жидкость, слюна и др.

Под "сердечной недостаточностью" понимается такое патологическое состояние, при котором нарушение функции сердца вызывает неспособность его к прокачиванию крови достаточным образом, чтобы соответствовать метаболическим потребностям организма, и/или при котором сердце обеспечивает потребности, но с аномально высоким давлением при заполнении. В частности, можно говорить о недостаточности правого и/или левого желудочка.

Термин "антитело" относится к любым антителам, как целым, так и функциональным фрагментам антител (полученных методами генной инженерии или нет), включающим или состоящим из, по меньшей мере, одного участка связывания антигена, позволяющего связывание антитела, по меньшей мере, с одной антигенной детерминантой антигенного соединения. В качестве примера фрагментов антител можно привести фрагменты Fab, Fab', Р(ab')₂, а также вариабельные фрагменты с простой цепью (цепи scFv).

Антитела к проBNP(1-108) по изобретению могут быть поликлональными или моноклональными. Поликлональные антитела к проBNP(1-108) по изобретению могут быть получены, кроме прочего, путем иммунизации таких животных, как кролики, мыши и пр. с помощью целого проBNP(1-108), выделения и затем истощения полученной антисыворотки, к примеру, на иммуносорбенте, содержащем BNP(77-108) и/или BNP(1-76), в соответствии с методами, известными в этой области. Моноклональные антитела к проBNP(1-108) по изобретению могут быть получены, кроме прочего, классическим методом Kohler et Milstein, Nature (London), 256: 495-497 (1975).

Получение моноклональных антител или моноспецифических поликлональных антисывороток или антител, получаемых при скрининге геномных банков, применимых в рамках настоящего изобретения, основывается на общепринятых методах, которые подробно изложены ниже.

Под "захватывающими антителами" понимаются антитела или части антител, предпочтительно фиксированные на твердой фазе, которые способны связывать антиген проBNP(1-108), находящийся в биологическом образце, путем аффинной связи.

Наличие антигена в биологическом образце выявляют с помощью "средств детектирования". В отношении детекции антигена изобретение, в частности, предусматривает детектирование с помощью, по меньшей мере, одного "детектирующего антитела". Такие детектирующие антитела, меченые, способны связываться с захваченным антигеном путем аффинной связи, распознавая эпитопный участок, отличающийся от того, который распознается захватывающим антителом.

Термин "меченый" относится как к прямому мечению (при помощи ферментов, радиоизотопов, флуорохромов, люминесцентных соединений и т.п.), так и к непрямому мечению (например, при помощи других антител, меченых прямым способом, или с помощью реагентов, составляющих меченую "аффинную пару", к примеру, таких как пара меченый авидин-биотин и пр.).

Под "антигенным фрагментом" понимается любая часть проBNP(1-108), способная индуцировать у иммунизированного животного синтез антител, специфичных практически только к проBNP(1-108).

В соответствии с настоящим изобретением "антигенный фрагмент" содержит, по меньшей мере, "эпитопный участок" или эпитоп RAPR₇₆S₇₇P. "Эпитопный участок" или "эпитоп" - это аминокислотная последовательность, распознаваемая, по меньшей мере, одним антителом и позволяющая специфическое связывание с ним.

Термин "моноспецифические поликлональные антитела" применяется к любым поликлональным антителам, проявляющим специфичность только к одному эпитопу. Это означает, что эти антитела способны связываться с такой аминокислотной последовательностью из последовательности проBNP(1-108), которая содержит аминокислоты, входящие в состав эпитопа, но не способны связываться с такой аминокислотной последовательностью из последовательности проBNP(1-108), которая не содержит аминокислот, входящих в состав эпитопа.

Термин "специфически", если он относится к распознаванию или специфическому связыванию антитела с антигеном, означает, что антитело взаимодействует с антигеном без заметного связывания с другими антигенами или, когда речь идет о "специфическом" распознавании эпитопа, о почти исключительном распознавании этого эпитопа. Предпочтительно константа связывания превышает 10 л/моль.

Под "консервативной заменой" понимается, в частности, замена аминокислоты одного класса другой аминокислотой из того же класса, при этом замена не ведет к значительной модификации иммунореактивности полученного пептида по отношению к исходному пептиду. Из различных классов аминокислот обычно выделяют аминокислоты с полярной боковой цепью (аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин), аминокислоты с неполярной боковой цепью (глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, метионин, триптофан, цистеин), аминокислоты с боковой цепью основного характера (лизин, аргинин, гистидин) и аминокислоты с боковой цепью кислотного характера (аспарагиновая и глутаминовая кислота).

Под "неконсервативной заменой" понимаются все другие типы замен, которые не ведут к значительной модификации иммунореактивности полученного пептида по отношению к исходному пептиду.

Выражение "практически не распознает ни BNP(1-76), ни BNP(77-108)" означает, что антитело по изобретению проявляет перекрестную реакцию с BNP(1-76) или BNP(77-108) на уровне менее 20%, в особенности менее 10%, предпочтительно менее 5%. Определение степени перекрестной реакции осуществляется в соответствии с методами, известными в этой области, например, приведенными в примере 5.

"Практическое" отсутствие распознавания пептидов BNP(1-76) и BNP(77-108) предпочтительно соответствует отсутствию или почти полному отсутствию реакции антител по изобретению с этими пептидами.

Выражение "практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108)" означает, что антитела "практически не распознают ни BNP(1-76), ни BNP(77-108)" в смысле, изложенном выше.

Получение специфических антител

Антитела, используемые в изобретении, обладают специфичностью к антигену и по этой причине они представляют собой моноклональные антитела или моноспецифические поликлональные антитела, то есть они распознают специфически только один эпитоп.

Моноклональные антитела могут быть получены классическим методом слияния с лимфоцитами и культивирования гибридом, описанным Kohler et Milstein, Nature, 1975, 256: 495-497. Также известны и другие методы получения моноклональных антител (Harlow et al., ed., 1988 "Antibodies: a laboratory manual"). Моноклональные антитела могут быть получены путем иммунизации млекопитающих (к примеру, мышей, крыс, кроликов, а также человека и др.) и применения методики слияния с лимфоцитами с получением гибридом (Kohler et Milstein, 1975).

Существуют методы, альтернативные этому обычному методу. Например, можно получить моноклональные антитела путем экспрессирования нуклеиновой кислоты, клонированной из гибридомы. Равным образом можно получить антитела методом экспрессии в фаге ("фаговый дисплей") при введении ДНК антитела в векторы, которые, как правило, представляют собой нитевидные фаги, презентирующие банки генов V на поверхности фага (например, fUSE5 для Е.coli, см. Scott J.K. et al.. Smith G.P., Science, 1990, 249: 386-390). Методики создания таких банков антител описаны в Marks et al., 1991, J. Mol.Biol.22: 581-597.

Поликлональные антитела могут быть получены из сыворотки животного, иммунизированного антигеном пептидной природы в соответствии с обычными рабочими методами. Полученные при этом поликлональные антитела, при необходимости, путем истощения с помощью BNP(77-108) и BNP(1-76) в соответствии с известными в этой области методами, к примеру, колоночной иммуноадсорбции, можно сделать моноспецифичными к последовательности Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅, к последовательности Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или к пептиду, содержащему последовательность RAPR₇₆S₇₇P, обеспечивая тем самым специфичность к проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108).

Захватывающие и/или детектирующие антитела

В методе "сэндвича" захватывающие антитела выбирают таким образом, чтобы они специфически распознавали один эпитоп на природном антигене пациента, тогда как детектирующие антитела предпочтительно, но не обязательно, выбирают таким образом, чтобы они специфически распознавали другой эпитоп на природном антигене пациента.

Биологический образец в известных случаях может быть подвергнут предварительной обработке или же непосредственно приведен в контакт, по меньшей мере, с одним захватывающим антителом в условиях, способствующих контакту с подлежащим детекции эпитопом.

Способ диагностики по изобретению может быть реализован в различных форматах, хорошо известных в этой области: на твердой фазе или в гомогенной фазе, в одну стадию или в две стадии, методом сэндвича или конкурентным методом, в качестве неограничивающих примеров.

В соответствии с предпочтительным способом реализации захватывающие антитела подвергают иммобилизации на твердой фазе. В качестве неограничивающих примеров твердой фазы можно использовать микропланшеты, в особенности микропланшеты из полистирола типа тех, что выпускает фирма Nunc, Дания. Также можно использовать твердые частицы или шарики, парамагнитные шарики типа тех, что выпускает фирма Dynal или Merck-Eurolab (Франция) (под торговой маркой Estapor™), либо пробирки из полистирола или полипропилена и т.п.

Формат иммуноанализа по типу "сэндвича" между двумя антителами (захватывающим и детектирующим) особенно предпочтителен при обнаружении антигенов, находящихся в биологических образцах.

Также возможен конкурентный формат иммуноанализа при обнаружении антигенов. Предусматриваются и другие разновидности иммуноанализа, хорошо известные специалистам.

Методы ELISA, радиоиммуноанализа и любые другие методы детекции могут применяться для обнаружения образовавшихся комплексов антиген-антитело.

Наборы

Наборы и реагенты, пригодные для обнаружения проBNP(1-108) в образцах биологических жидкостей в соответствии со способом изобретения, могут быть легко получены при осуществлении изобретения применительно к различным биологическим образцам.

Наборы для обнаружения проBNP(1-108) в биологических образцах могут содержать, по меньшей мере, одно антитело из тех, что определены выше. Другие наборы, содержащие в качестве стандарта и/или контроля, по меньшей мере, один пептид формулы I, II или замещенный пептид из тех, что определены выше, также могут использоваться при осуществлении изобретения.

Итак, следующим отдельным предметом изобретения является набор для обнаружения проBNP(1-108) в образцах биологических жидкостей, включающий:

- по меньшей мере, одно антитело к проBNP(1-108), распознающее специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PK-MVQGSG₈₅, последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающее способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека, которое предпочтительно является захватывающим антителом для проBNP(1-108) в биологических образцах; и

- меченый конъюгат, способный специфически связываться с образовавшимися комплексами антиген-антитело.

Как описано ниже, захватывающие антитела могут предпочтительно находиться в иммобилизованном виде на твердой фазе, например, на микропланшетах, но не только.

Предпочтительно набор содержит, по меньшей мере:

- захватывающее антитело к проBNP(1-108), распознающее специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PK-MVQGSG₈₅, последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ и/или последовательность RAPR₇₆S₇₇P из проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108), и обладающее способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека, причем захватывающие антитела иммобилизованы на твердой фазе; и

- детектирующее антитело - меченое, направленное против другого интактного эпитопа проBNP(1-108), либо, при необходимости,

детектирующий антиген - меченый, которым служит какой-нибудь пептид из проBNP(1-108) или сам проBNP(1-108).

В соответствии с предпочтительным способом реализации набор для обнаружения проBNP(1-108) в биологических образцах может содержать:

- в одной емкости, по меньшей мере, одно антитело из тех, что определены выше;

- в другой емкости, по меньшей мере, один пептид из тех, что определены выше, используемый в качестве стандарта и/или контроля.

Нижеследующие фигуры и примеры раскрывают изобретение, не ограничивая его область действия.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлена реактивность поликлональных антител кролика №046 805, очищенных на белок А-сефарозе, к проBNP(1-108), фрагменту BNP(1-76) или BNP(77-108) либо к GST (глутатион-8-трансфераза, используемая в качестве контрольного белка), адсорбированным на микропланшете при 0,25 мкг/мл.

На фиг.2 представлена реактивность поликлональных антител из фильтрата кролика №046 805, полученных после истощения на ВНР-К₃-NHS-сефарозе. Поликлональные антитела применяли в виде серийного разведения от 2 до 20 мкг/мл, тестируя их в лунках, покрытых полипептидом проBNP(1-108), BNP(1-76) или BNP(77-108), которые адсорбировали при 0,25 мкг/мл.

На фиг.3 представлена реактивность поликлональных антител из фильтрата кролика №046 832, полученных после истощения на ВМР-К₃-NHS-сефарозе. Поликлональные антитела применяли в виде серийного разведения от 5 до 20 мкг/мл, тестируя их в лунках, покрытых полипептидом проBNP(1-108), BNP(1-76) или BNP(77-108), которые адсорбировали при 0,25 мкг/мл.

На фиг.4 представлена реактивность элюата поликлональной сыворотки кролика №046 805, полученного после истощения на ВМР-К₃-NHS-сефарозе. Поликлональные антитела применяли в виде серийного разведения от 2 до 20 мкг/мл, тестируя их в лунках, покрытых полипептидом проBNP(1-108), BNP(1-76) или BNP(77-108), которые адсорбировали при 0,25 мкг/мл.

На фиг.5 представлена реактивность элюата поликлональной сыворотки кролика №046 832, полученного после истощения на ВНР-К₃-МНЗ-сефарозе. Поликлональные антитела применяли в виде серийного разведения от 5 до 20 мкг/мл, тестируя их в лунках, покрытых полипептидом проBNP(1-108), BNP(1-76) или BNP(77-108), которые адсорбировали при 0,25 мкг/мл.

На фиг.6 представлен анализ эпитопов методом пятен поликлональной сывороткой кролика №046 805 до истощения (в этом примере фон составил 30,4±5,93 относительных единиц интенсивности).

На фиг.7 представлен анализ эпитопов методом пятен поликлональной сывороткой кролика №046 805 после истощения на ВМР-К₃-NHS-сефарозе (в этом примере фон составил 30,4±5,93 относительных единиц интенсивности).

На фиг.8 представлена реактивность супернатанта из культуры гибридомы 3D4 в разведении 1:2 при тестировании в лунках, покрытых проBNP(1-108), BNP(1-76) или BNP(77-108) либо пептидом YTLRAPRSPKMVQGSG (C13P30), которые адсорбировали при 1 мкг/мл.

На фиг.9 представлена фотография из 16% акриламидного геля, на котором разгоняли белки (1 мкг белка на каждой дорожке). Дорожка 1: маркеры молекулярного веса, 2 - проBNP(1-108)-GST, 3 - GST (отрицательный контроль), 4 - BNP(1-76)-GST, 5 - BNP(77-108).

На фиг.10 представлены результаты тестирования методом Вестерн-блоттинга антител, вырабатываемых гибридомой 3D4, на проBNP(1-108)-GST (дорожка 2), GST (отрицательный контроль) (дорожка 3), BNP(1-76)-GST (дорожка 4) и BNP(77-108) (дорожка 5), нанесенных на гель (1 мкг белка на гель), а затем перенесенных на нитро-целлюлозную мембрану.

На фиг.11 представлена стандартная кривая для определения проBNP(1-108) методом РИА.

На фиг.12 представлены результаты в cpm (импульсы за 1 мин) при определении проBNP(1-108) методом РИА в пробах крови из 14 здоровых лиц и 15 пациентов, страдающих сердечной недостаточностью.

На фиг.13 представлена корреляция между концентрациями проBNP(1-108) (в пг/мл) при определении радиоиммунометрическим методом по изобретению и концентрациями BNP(1-76) (в пг/мл) при определении на автоматизированном приборе Elecsys® фирмы Hoffman La Roche пробах крови из 14 пациентов, страдающих сердечной недостаточностью.

На фиг.14 представлена стандартная кривая для определения проBNP(1-108) методом ELISA по изобретению.

На фиг.15 представлена оценка перекрестной реакции в отношении BNP(1-76) и BNP(1-108), не подвергавшихся истощению поликлональных антител из кролика №046805, конъюгированных с биотином и используемых при определении проBNP(1-108) методом ELISA в сэндвич-формате вместе с поликлональными антителами к BNP(77-108).

На фиг.16 представлена оценка перекрестной реакции в отношении BNP(1-76) и BNP(77-108), не подвергавшихся истощению поликлональных антител из кролика №046 805, конъюгированных с биотином и используемых при определении проBNP(1-108) методом ELISA в сэндвич-формате вместе с поликлональными антителами к NT-проBNP(1-29).

Осуществление изобретения

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Синтез пептидов для иммунизации

Синтетические пептиды получают стандартными методами, хорошо известными в этой области. В качестве примера можно привести синтез по типу Memfield, который обладает преимуществом в легкости исполнения (Memfield, 1963; R.C. Sheppard, 1971; Atherton et al., 1989). Можно использовать автоматические синтезаторы типа синтезатора 9050 Plus Pep Synthesizer фирмы Millipore, Pioneer фирмы Perspective или синтезатор 433А фирмы АВ1. Пептиды также могут быть получены синтезом в гомогенной фазе.

Приведенные ниже синтезы выполнялись на синтезаторе Pioneer с применением химии Fmoc (9-фторенилметоксикарбонил): на каждой стадии реактивы (защищенные аминокислоты и активаторы присоединения TBTU (2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония тетрафторборат) и HOBt (N-гидроксибензотриазол) добавляются в избытке (в соотношении «моль реактива/моль замещаемых групп на носителе»=5). По окончании синтеза пептид отделяли от носителя с помощью раствора трифторуксусной кислоты (реактив К). После этого пептид осаждали раствором охлажденного эфира, а затем очищали методом ВЭЖХ.

Авторы изобретения приступили к синтезу следующих пептидов, содержащих аминокислотную последовательность из шарнирного участка R₇₆S₇₇:

SEQ ID No. 6:C-G-R-A-P-R-S-PSEQ ID No. 7:Ацетил-C-G-R-A-P-R-S-PSEQ ID No. 8:C-G-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No. 9:Ацетил-C-G-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No. 10:C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-VSEQ ID No. 11:C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-GSEQ ID No. 12:R-A-P-R-S-P-G-CSEQ ID No. 13:Ацетил-R-A-P-R-S-P-G-CSEQ ID No. 14:Ацетил-C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No. 15:C-H-R-K-M-V-L-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No. 16:C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G (пептид С 1 ЗРЗО)SEQ ID No. 17:C-F-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-GSEQ ID No. 18:C-F-S-I-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-GSEQ ID No. 19:C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-βASEQ ID No. 20:C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-A-T-βASEQ ID No. 21:C-F-S-I-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-A-T-βASEQ ID No. 22:C-F-S-I-R-A-P-R-S-P-A-L-A-S-G-T-βA,

а также:

SEQ ID No. 109:C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S (пептид CN32)SEQ ID No. 110:C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No. 111:C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-VSEQ ID No. 112:C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-QSEQ ID No. 113:C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-GSEQ ID No. 114:Ацетил-C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-QSEQ ID No. 115:C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-GSEQ ID No. 116:C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-SSEQ ID No. 117:C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-GSEQ ID No. 118:C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-VSEQ ID No. 119:C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-QSEQ ID No. 120:L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-CSEQ ID No. 121:C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-SSEQ ID No. 122:C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G.

Примечание: βA означает β-аланин.

Таким образом, предметом изобретения также являются любые пептиды из группы, состоящей из представленных выше последовательностей.

Пример 2. Конъюгирование пептидов с белком-носителем для иммунизации

Пептид конъюгируют с белком-носителем типа гемоцианина моллюска блюдечко (KLH, keyhole limpet hemocyanin), тироглобулина, бычьего сывороточного альбумина (БСА) через различные функциональные группы (тиол, амин, альдегид...) таким образом, чтобы сделать пептид более иммуногенным. Конъюгирующий реагент, используемый для соединения пептида с белком, может быть гетеро- или гомофункциональным. Чаще всего используются такие реагенты, как BS 3, sSMCC, SPDP, глутаральдегид ... В одном из методов, используемых для конъюгации, в качестве химического конъюгирующего реагента применяется глутаральдегид, а в качестве белка-носителя - KLH. Конъюгирование KLH с пептидом осуществляется через аминогруппы пептида (в основном, N-концевые и аминогруппы лизина).

Готовили раствор пептида С13Р30 с последовательностью CYTLRAPRSPKMVQGSG-NH₂ (SEQ ID No. 16) или пептида CN32 с последовательностью CYTLRAPRSPKMVQGS-NH₂ (SEQ ID No. 109) (5 мг/мл) в буфере PBS Dulbecco NaCl 0,15 M, pH 7,4. Во флакон, содержащий 20 мг лиофилизованного KLH в буфере PBS (Pierce #77600), добавляли 2 мл воды для инъекций, получая при этом раствор KLH 10 мг/мл в буфере PBS.

1 мл раствора пептида (т.е. 5 мг) смешивали с 1,25 мл раствора KLH (т.е. 12,5 мг). В эту смесь добавляли 2,25 мл свежеприготовленного 2% раствора глутаральдегида (из 25% глутаральдегида, Sigma #G-5882). Чтобы избежать образования комплексов KLH, 2% раствор глутаральдегида добавляли по каплям и с перемешиванием смеси. Реакцию конъюгирования проводили в течение 2 ч 30 мин при комнатной температуре. Реакцию конъюгирования останавливали добавлением раствора боргидрида натрия (100 мг/мл) таким образом, чтобы конечная концентрация составила 10 мг/мл. Смесь инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем раствор диализовали в течение ночи при 4°С против буфера PBS Dulbecco при pH 7,4. Наконец, раствор разделяли на аликвоты и хранили при - 80°С.

Пример 3. Иммунизация с помощью пептидов

Для получения поликлональных антител иммунизировали кроликов (самок породы New Zealand) с помощью пептида Cys-YTLRAPRSPKMVQGSG-NH₂, конъюгированного с KLH в соответствии с примером 2. При первой инъекции использовали эмульсию из 1,5 мл конъюгированного с KLH пептида с 1,5 мл полного адъюванта Фрейнда (Sigma # F-5881), причем кроликам вводили по 1 мл этой эмульсии (т.е. 200 мкг пептида) внутрикожно. Две повторные инъекции делали с интервалом в 20 дней, вводя внутрикожно 1 мл эмульсии конъюгированного с KLH пептида (т.е. 200 мкг пептида) вместе с неполным адъювантом Фрейнда (Sigma # F-5506). Через 20 дней после второго повтора делали третий повтор таким же образом, как и предыдущие, но путем подкожной инъекции. Через 20 дней после последнего повтора и после определения титра полученных антител кроликов обескровливали. В частности, для дальнейшей работы использовали поликлональные антитела кроликов №046 805 и №046 832, полученные при иммунизации конъюгированным с KLH пептидом C-YTLRAPRSPKMVQGSG-NH₂ (SEQ ID No. 16), и антитела кролика №L01235, полученные при иммунизации конъюгированным с KLH пептидом C-YTLRAPRSPKMVQGS-NH₂ (SEQ ID No. 109)

Пример 4. Получение и очистка антител

Перед очисткой сыворотку кроликов центрифугировали 30 мин при 4500 об/мин при 4°С. После этого сыворотку разбавляли наполовину 1,5 М глициновым буфером рН 8,0, содержащим 1 М NaCl.

Пример 4а. Очистка IgG на белок А-сефарозе

Очистку поликлональных антител проводили методом аффинной хроматографии на геле белок А-сефарозы (Amersham Biosciences №17.1279.02). Полученный из Staphylococcus aureus белок А связывается специфическим образом с фрагментом Fc молекулы IgG. После этого IgG всех возможных типов элюируют при рН 3,0.

Все используемые буферы дегазировали в течение 15 мин в ультразвуковой бане перед нанесением на колонку, чтобы предотвратить образование пузырьков.

Колонку для хроматографии готовили с помощью 12 мл белок А-сефарозы. Колонку с гелем уравновешивали в течение 40 мин дистиллированной и дегазированной водой, затем на протяжении 40 мин буфером PBS Dulbecco рН 7,4, содержащим 0,5 М NaCl, а затем 1,5 М глициновым буфером рН 8,0, содержащим 1 М NaCl, вплоть до получения ровной базовой линии.

После этого на колонку наносили 10 мл кроличьей сыворотки, разбавленной наполовину 1,5 М глициновым буфером рН 8,0, содержащим 1 М NaCl, со скоростью 0,5 мл/мин. После появления пика альбумина элюировали IgG из сыворотки с помощью 0,1 М раствора лимонной кислоты, доведенного до рН 3,0 буфером трис-цитрат натрия 0,1 М. Содержащий IgG пик собирали и быстро помещали на диализ в буфере PBS Dulbecco, рН 7,4, в течение ночи при 4°С. Концентрацию IgG после диализа определяли по оптической плотности при 280 нм относительно буфера PBS.

После очистки на белке А активность поликлональных антител тестировали методом ELISA в лунках, покрытых проBNP(1-108), BNP(1-76) или BNP(77-108), которые адсорбировали при 0,25 мкг/мл. Полученные результаты для поликлональных антител кролика #046 805 представлены на фиг.1. Поликлональные антитела кролика #046 832 дали идентичные результаты. Поликлональные антитела кроликов #046 805 и #046 832 относительно специфичны к проBNP(1-108). В то же время отмечалось наличие слабой реактивности к BNP(77-108) при высоких концентрациях, которую удавалось подавить, делая Поликлональные антитела этих кроликов моноспецифичными путем истощения на BNP-K₃-NHS-серафарозе в соответствии с методикой, описанной в примере 4b.

Пример 4b. Истощение IgG на BNP-K₃-NHS-сефарозе

Целью этой операции является устранение перекрестной реактивности, наблюдавшейся в отношении BNP(77-108).

Поскольку перекрестная реактивность полученных поликлональных антител локализуется в N-концевом положении молекулы BNP(77-108), важно, чтобы этот участок BNP(77-108) был хорошо презентирован иммуноглобулинам, подлежащим устранению. С этой целью был синтезирован BNP(77-108) с удлинением на 3 остатка лизина в С-концевом положении (BNP-К₃), что способствует его конъюгации с NHS-сефарозой по С-концевому участку.

BNP-Кз: S-P-K-M-V-Q-G-S-G-C-F-G-R-K-M-D-R-I-S-S-S-S-G-L-G-C-K-V-L-R-R-H-К-К-К (SEQ ID No. 104) синтезировали на синтезаторе Pioneer с применением химии Fmoc (9-фторенилметоксикарбонил), как описано выше в примере 1.

Растворяли 5 мг BNP-К₃ в буфере 100 мМ NaHCO₃ при рН 8,3 с добавлением 0,5 М NaCl до концентрации в 10 мг/мл. Центрифугировали 2 мл NHS-сефарозы (NHS-активированная Sepharose 4 Fast Flow, Amersham Biosciences №17.0906.01) 30 сек при 1000 об/мин при 4°С. Смолу промывали 15 мл холодного раствора 1 мМ HCl. После центрифугирования и удаления раствора HCl смолу смешивали с лигандом BNP-К₃ при 10 мг/мл. Смесь инкубировали 1 час при комнатной температуре с медленным перемешиванием. После центрифугирования и удаления раствора лиганда непрореагировавшие группы смолы блокировали с помощью 5 мл 0,1 М глицинового буфера рН 8,0. Смесь инкубировали 1 час при комнатной температуре с медленным перемешиванием. После центрифугирования и удаления блокирующего буфера смолу суспендировали в 5 мл буфера 100 мМ NaHCO₃ при рН 8,3 с добавлением 0,5 М NaCl. Делали четыре промывки этим буфером. После последней промывки смесь вносили в колонку для хроматографии.

После подготовки колонки для хроматографии на нее наносили 10 мг IgG кролика #046 805 или кролика #046 832. С помощью перистальтического насоса через колонку пропускали IgG из кроличьей сыворотки в течение ночи при 4°С. На следующий день собирали раствор IgG (=фильтрат). Фракцию IgG, связавшегося с BNP-K₃, элюировали (=элюат) с помощью буфера 20 мМ трис рН 8,0, содержащего 5 М мочевину. После этого тестировали элюат и фильтрат для проверки эффективности истощения. На фиг.2 и 3 представлены результаты тестирования методом ELISA фильтрата поликлональных сывороток кроликов #046 805 и #046 832 соответственно. На фиг.4 и 5 представлены результаты тестирования методом ELISA элюата поликлональных сывороток кроликов #046 805 и #046 832 соответственно.

Как и ожидалось, фильтрат поликлональных сывороток кроликов #046 805 и #046 832 был специфичен к проBNP(1-108): не наблюдалось реактивности ни к BNP(1-76), ни к BNP(77-108). В элюате сохранялась значительная реактивность к проBNP(1-108), но также и реактивность к BNP(77-108). Эти результаты подтверждают эффективность истощения поликлональной сыворотки кроликов на ВМР-К₃-NH₃-сефарозе.

BNP(77-108) был получен от Sigma (№В-5900), тогда как проBNP(1-108) и BNP(1-76) получали в виде рекомбинантных белков, экспрессированных после клонирования в векторе pGEX-2T (Amersham Pharmacia Biotech) и трансфекции в Е.coli классическими методами, хорошо известными в этой области. Исходный вектор был получен от фирмы Berlex Biosciences (Richmond, CA, USA), а его получение описано в Yan et al. (PNAS, 2000, vol. 97, pp.8525-8529). Концентрации проBNP(1-108) и BNP(1-76) определяли методом колориметрического определения белка по Брэдфорду (Bradford M., Anal. Biochem. 1976, 72:248-54).

Пример 5. Определение перекрестной реакции (в %) антител к проBNP(1-108) кроликов #046 805 и #L01235 в отношении BNP(1-76) и BNP(77-108)

Материалы

1) Твердая фаза: микропланшеты Maxisorp с плоским дном, Nunc (Дания).

2) BNP(77-108) был получен от Sigma (№В-5900), тогда как проBNP(1-108) и BNP(1-76) получали в виде рекомбинантных белков. Концентрации этих растворов белков определяли методом колориметрического определения белка по Брэдфорду (Bradford M., Anal. Biochem. 1976, 72: 248-54).

3) Используемый конъюгат представляет собой поликлональные антитела против IgG кролика, конъюгированные с пероксидазой (Sigma №А-9169).

4) Буфер для блокировки: буфер PBS Dulbecco pH 7,4, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma №А-7888).

5) Буфер для разведения: буфер PBS Dulbecco pH 7,4, содержащий 0,1% BSA и 0,1% Tween 20.

6) Раствор для промывки: буфер PBS Dulbecco pH 7,4, содержащий 0,1% Tween 20.

7) Раствор для проявления: раствор для проявления включает:

7а) субстратный буфер: раствор 0,01 М лимонной кислоты и 0,04 М тризамещенного цитрата натрия, содержащий 0,33% Н₂O₂, конечное значение pH 5,6, и

7b) хромоген: таблетки OPD (ортофенилендиамин). 1 таблетку OPD растворяют в 10 мл субстратного буфера.

8) Раствор для остановки реакции: 4 N H₂SO₄.

Методика

Определение заключается в оценке иммунореактивности поликлональных антител непосредственно к различным белкам, иммобилизованным в лунках микропланшета.

- Сначала готовят несколько растворов для сенсибилизации в буфере PBS Dulbecco рН 7,4: первый содержит BNP(77-108) при 0,25 мкг/мл, второй содержит проBNP(1-108) при 0,25 мкг/мл, третий содержит BNP(1-76) при 0,25 мкг/мл, а четвертый содержит GST (контрольный белок для определения фона) при 0,25 мкг/мл.

- По 100 мкл каждого из этих растворов вносят в лунки микропланшета.

- Микропланшет инкубируют в течение ночи при 4°С.

- После удаления растворов для сенсибилизации микропланшет промывают с помощью 300 мкл буфера PBS Dulbecco рН 7,4, содержащего 0,1% Tween 20, а затем блокируют добавлением 250 мкл буфера PBS Dulbecco рН 7,4, содержащего 1% BSA.

- Микропланшет затем инкубируют 1 час при 37°С.

- После этого микропланшет промывают (3 раза) раствором для промывки.

- В каждую лунку вносят 100 мкл раствора поликлональных антител, предварительно разведенных до 2 и 1 мкг/мл в случае поликлональной сыворотки кролика #046 805 и в разведении 1/2500 и 1/5000 в случае поликлональной сыворотки кролика #L01235.

- Реакционную среду инкубируют 2 часа при комнатной температуре.

- После этого микропланшет промывают 3 раза раствором для промывки по 300 мкл.

- В каждую лунку микропланшета добавляют 100 мкл конъюгата из конъюгированных с пероксидазой поликлональных антител против IgG кролика, разведенного 1/8000 буфером для разведения.

- Реакционную среду инкубируют 1 час при комнатной температуре.

- Планшет затем промывают (5 промывок) раствором для промывки по 300 мкл. В каждую лунку вносят 100 мкл раствора для проявления. Оставляют для проявления в темноте на 20 мин при комнатной температуре (18-24°С).

- После этого в каждую лунку добавляют 50 мкл раствора для остановки реакции.

- После остановки реакции измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при 490/620 нм.

Таблица I. Результаты определения перекрестной реакции (в %) поликлональных антител кроликов #046 805 и #L01235 в отношении BNP(1-76) и BNP(77-108)

Для данных антител к проBNP(1-108) при тестировании на BNP(77-108), адсорбированном при 0,25 мкг/мл, на проBNP(1-108), адсорбированном при 0,25 мкг/мл, и на GST, адсорбированном при 0,25 мкг/мл, процент перекрестной реакции этих антител с BNP(77-108) рассчитывали по следующей формуле:

Для данных антител к проBNP(1-108) при тестировании на BNP(1-76), адсорбированном при 0,25 мкг/мл, на проBNP(1-108), адсорбированном при 0,25 мкг/мл, и на GST, адсорбированном при 0,25 мкг/мл, процент перекрестной реакции этих антител с BNP(1-76) рассчитывали по следующей формуле:

 Перекрестная реакция в%поликлональная сыворотка #046 805 при 1 мкг/млполиклональная сыворотка #046 805 при 2 мкг/млполиклональная сыворотка #L 01235 в развед.1/5000поликлональная сыворотка #L 01235 в развед. 1/2500BNP(77-108) при 0,25 мкг/мл1,44%2,13%3,55%4,3%BNP(1-76) при 0,25 мкг/мл1,00%1,29%0,21%0,00%

Вывод: перекрестная реакция поликлональных антител из этих сывороток составляет менее 2% в отношении BNP(1-76) и менее 5% в отношении BNP(77-108). Перекрестная реакция в отношении BNP(77-108) может быть устранена по методике истощения, описанной в примере 4b. В то же время, как описано в примерах 19 и 20, в условиях иммуноферментного определения проBNP(1-108) и при тех концентрациях BNP(77-108) и BNP(1-76), которые обычно встречаются у пациентов, эти поликлональные антитела могут применяться в не подвергавшемся истощению варианте, не вызывая появления перекрестной реакции.

Пример 6. Идентификация эпитопа, распознаваемого поликлональными сыворотками кроликов #046 805 и #046 832 до и после истощения на BNP-K₃-NHS-сефарозе

Поликлональные сыворотки кроликов #046 805 и #046 832 до и после истощения на ВНР-К₃-NHS-сефарозе тестировали методом пятен (spot) с целью идентификации эпитопа, распознаваемого этими поликлональными сыворотками. Этот метод, описанный в работе Frank (Tetrahedron, 1992, 48: 9217-32), позволяет быстро синтезировать на нитроцеллюлозной мембране большое число пептидов с заданными последовательностями. Использовали методики, описанные Molina et al. (Pept. Res., 1996, 9: 151-5). На листе бумаги создаются круглые зоны (пятна) диаметром около 5 мм, содержащие функциональную аминогруппу, которые служат для прикрепления С-концевой аминокислоты синтезируемого пептида. Наращивание пептидной цепи осуществляется путем поочередного добавления активированных Fmoc аминокислот. Боковые цепи аминокислот блокируют соответствующими химическими группами. Все пептиды синтезируются с N-ацетилированными N-концевыми остатками. По завершении синтеза боковые цепи деблокируют под действием трифторуксусной кислоты. Такая обработка не влияет на связь между пептидом и целлюлозным носителем, поэтому реактивность пептидов можно оценивать колориметрически.

Серия пептидов, синтезированных на мембране, состояла из 32 пентадекапептидов со сдвигом на 3 аминокислотных остатка, представляющих всю последовательность проBNP(1-108).

Таблица IIАнализ методом пятен на мембране 32 пентадекапептидов со сдвигом на 3 аминокислотных остатка, представляющих всю последовательность проBNP(1-108)Последовательность№ пятнаПоследовательность№ пятнаHPLGSPGSASDLETS (SEQ ID No. 23)1GVWKSREVATEGIRG (SEQ ID No. 39)17GSPGSASDLETSGLQ (SEQ ID No. 24)2KSREVATEGIRGHRK (SEQ ID No. 40)18GSASDLETSGLQEQR (SEQ ID No. 25)3EVATEGIRGHRKMVL (SEQ ID No. 41)19SDLETSGLQEQRNHL (SEQ ID No. 26)4TEGIRGHRKMVLYTL (SEQ ID No. 42)20ETSGLQEQRNHLQGK (SEQ ID No. 27)5IRGHRKMVLYTLRAP (SEQ ID No. 43)21GLQEQRNHLQGKLSE (SEQ ID No. 28)6HRKMVLYTLRAPRSP (SEQ ID No. 44)22EQRNHLQGKLSELQV (SEQ ID No. 29)7MVLYTLRAPRSPKMV (SEQ ID No. 45)23NHLQGKLSELQVEQT (SEQ ID No. 30)8YTLRAPRSPKMVQGS (SEQ ID No. 46)24QGKLSELQVEQTSLE (SEQ ID No. 31)9RAPRSPKMVQGSGCF (SEQ ID No. 47)25LSELQVEQTSLEPLQ (SEQ ID No. 32)10RSPKMVQGSGCFGRK (SEQ ID No. 48)26LQVEQTSLEPLQESP (SEQ ID No. 33)11KMVQGSGCFGRKMDR (SEQ ID No. 49)27EQTSLEPLQESPRPT (SEQ ID No. 34)12QGSGCFGRKMDRISS (SEQ ID No. 50)28SLEPLQESPRPTGVW (SEQ ID No. 35)13GCFGRKMDRISSSSG (SEQ ID No. 51)29PLQESPRPTGVWKSR (SEQ ID No. 36)14GRKMDRISSSSGLGC (SEQ ID No. 52)30ESPRPTGVWKSREVA (SEQ ID No. 37)15MDRISSSSGLGCKVL (SEQ ID No. 53)31RPTGVWKSREVATEG (SEQ ID No. 38)16ISSSSGLGCKVLRRH (SEQ ID No. 54)32

После блокирования мембраны с помощью 30 мл буфера TBS (физраствор на трис-буфере) рН 7,0 с добавлением 0,1% Tween 20, 5% буфера Blocking buffer (Euromedex №SU-07-250) и 5% сахарозы тестировали реактивность поликлональной сыворотки кролика (20 мл), разведенной до 10 мкг/мл (инкубировали 1 ч 30 мин при 37°С с перемешиванием). После промывки буфером TBS рН 7,0 с добавлением 0,1% Tween 20 вносили 20 мл конъюгата анти-IgG кролика со щелочной фосфатазой (Sigma #A-8025) и инкубировали 1 час при комнатной температуре с перемешиванием. Наконец, после последней серии промывок с помощью 30 мл раствора для промывки выполняли проявление пятен добавлением 30 мл раствора субстрата (раствор из 30 мл буфера CBS (физраствор на цитратном буфере) рН 7,0, содержащего 120 мкл 0,15 М BCIP (5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфат), 150 мкл 1 М MgCl₂ и 180 мкл 0,1 М МТТ (тиазолилтетразолия синего бромид). После сканирования мембраны определяли интенсивность пятен на мембране (в относительных единицах интенсивности) с помощью программы для обработки изображений. Уровень фона рассчитывали по пятнам, не выявляемым антисывороткой. Результаты анализа эпитопов в поликлональной сыворотке кролика #046 805 до истощения представлены на фиг.6. Поликлональная сыворотка детектировала пять пептидов (пятна 22-26), причем последовательность, общая для этих пяти пептидов, - R₇₆S₇₇P. В то же время реактивность весьма повышалась при добавлении мотива RAP в N-концевое положение мотива R₇₆S₇₇P. Результаты анализа эпитопов в поликлональной сыворотке кролика #046 805 после истощения на BNP-K₃-NHS-сефарозе представлены на фиг.7. Поликлональная сыворотка детектировала четыре пептида (пятна 22-25), причем последовательность, общая для этих 4 пептидов, - RAPR₇₆S₇₇P. В отличие от того, что наблюдалось с поликлональной сывороткой до истощения, только к мотиву R₇₆S₇₇P (пятно 26) не наблюдалось реактивности. Этим объясняется то, что после истощения на BNP-Кз-NHS-сефарозе поликлональная сыворотка больше не выявляет BNP(77-108) [напомним, что мотив S77P соответствует двум первым аминокислотам последовательности BNP(77-108)]. Итак, эпитоп, распознаваемый поликлональной сывороткой кролика #046 805 после превращения ее в моноспецифическую, представлен RAPR₇₆S₇₇P.

Совершенно идентичные результаты были получены с поликлональной сывороткой кролика #046 832: эпитоп, распознаваемый поликлональной сывороткой этого кролика после превращения ее в моноспецифическую, также представлен RAPR₇₆S₇₇P.

Пример 7. Идентификация методом Ala-сканирования минимального эпитопа для поликлональных сывороток кроликов #046 805 и #046 832 до и после истощения

Поликлональные сыворотки кроликов #046 805 и #046 832 до и после истощения на ВМР-К₃-NHS-сефарозе тестировали методом пятен (описанным в примере 6) с целью идентификации минимального эпитопа в шарнирном пептиде, позволяющего специфическое распознавание только проBNP(1-108) поликлональными сыворотками. Синтезировали мембрану, содержащую 16 пентадекапептидов, повторяющих последовательность шарнирного пептида YTLRAPRSPKMVQGS и несущих поочередно замену одной аминокислоты остатком аланина (Ala-сканирование) или глицина, причем каждый раз замена смещается вправо на один аминокислотный остаток (табл.III). Результаты анализа методом Ala-сканирования поликлональных сывороток кроликов #046 805 и #046 832 до и после истощения на ВНР-К₃-NHS-сефарозе представлены в табл.III.

Таблица III. Анализ методом пятен на мембране 16 пентадекапептидов на основе YTLRAPRSPKMVQGS, несущих поочередно замену одной аминокислоты остатком аланина или глицина. Реактивность поликлональных сывороток кроликов #046 805 и #046 832 до и после истощения на BNP-K₃-NHS-сефарозе

SEQ IDПоследовательностьNs пятнаРеактивность (в относ. ед. интенсивности) поликлон. сыворотки кролика #046 805 до истощенияРеактивность (в относ. ед. интенсивности) поликлон. сыворотки кролика #046 805 после истощенияРеактивность (в относ. ед. интенсивности) поликлон. сыворотки кролика #046 832 до истощенияРеактивность (в относ. ед. интенсивности) поликлон. сыворотки кролика #046 832 после истощенияSEQ ID No. 46YTLRAPRSPKMV QGS7168469151132SEQ ID No. 55ATLRAPRSPKMV QGS7179068148130SEQ ID No. 56YALRAPRSPKMV QGS71810171154130SEQ ID No. 57YTARAPRSPKMV QGS71910877152133SEQ ID No. 58YTLAAPRSPKMV QGS72010139148106SEQ ID No. 59YTLRGPRSPKMV QGS7219339156132SEQ ID No. 60YTLRAARSPKMV QGS7221039613748SEQ ID No. 61YTLRAPASPKMV QGS7235023150116SEQ ID No. 62YTLRAPRAPKMV QGS7245844148113SEQ ID No. 63YTLRAPRSAKMV QGS72574418567SEQ ID No. 64YTLRAPRSPAMV QGS726138118157148SEQ ID No. 65YTLRAPRSPKAV QGS7279877150130SEQ ID No. 66YTLRAPRSPKMA QGS72810068138130SEQ ID No. 67YTLRAPRSPKMV AGS7299571142133SEQ ID No. 68YTLRAPRSPKMV QAS73010778143134SEQ ID No. 69YTLRAPRSPKMV QGA73111268153132

Примечание: подчеркнуты остатки аланина или глицина (А и G), заменяющие исходные аминокислоты.

Аминокислоты, важные для распознавания эпитопа, распознаваемого поликлональной сывороткой кролика #046 805 до истощения, - это R₇₆S₇₇P, тогда как после истощения поликлональной сыворотки кролика #046 805 на ВМР-К₃-NHS-сефарозе, наряду с мотивом R₇₆S₇₇Р, вносит вклад и мотив RA. В случае поликлональной сыворотки кролика #046 832 до истощения вклад вносит только пролин P₇₈, тогда как после истощения поликлональной сыворотки кролика #046 832 на BNP-К₃-NHS-сефарозе вносит вклад мотив R-PR₇₆S₇₇P. Так что эти результаты показывают, что минимальный эпитоп, необходимый для специфического распознавания проBNP(1-108) поликлональными антителами кроликов #046 805 и #046 832, представлен RAPR₇₆S₇₇P.

Пример 8. Идентификация минимального эпитопа для поликлональной сыворотки кролика #L01235 методом Ala-сканирования

Поликлональную сыворотку кролика #L01235, изначально специфичную к проBNP(1-108) (истощение не нужно), тестировали методом пятен (описанным в примере 6) с целью идентификации минимального эпитопа в шарнирном пептиде, позволяющего специфическое распознавание только проBNP(1-108) поликлональной сывороткой. Использовали мембрану, описанную в примере 7. Результаты анализа методом Ala-сканирования поликлональной сыворотки кролика #L01235 представлены в табл.IV.

Анализ методом пятен на мембране 16 пентадекапептидов на основе YTLRAPRSPKMVQGS, несущих поочередно замену одной аминокислоты остатком аланина или глицина. Реактивность поликлональной сыворотки кролика #L01235Таблица IVSEQ IDПоследовательностьРеактивность (в относ. ед. интенсивности) поликлональной сыворотки кролика #L01235SEQ ID No. 46YTLRAPRSPKMVQGS94SEQ ID No. 55ATLRAPRSPKMVQGS91SEQ ID No. 56YALRAPRSPKMVQGS84SEQ ID No. 57YTARAPRSPKMVQGS92SEQ ID No. 58YTLAAPRSPKMVQGS66SEQ ID No. 59YTLRGPRSPKMVQGS71SEQ ID No. 60YTLRAARSPKMVQGS67SEQ ID No. 61YTLRAPASPKMVQGS71SEQ ID No. 62YTLRAPRAPKMVQGS47SEQ ID No. 63YTLRAPRSAKMVQGS53SEQ ID No. 64YTLRAPRSPAMVQGS102SEQ ID No. 65YTLRAPRSPKAVQGS73SEQ ID No. 66YTLRAPRSPKMAQGS70SEQ ID No. 67YTLRAPRSPKMVAGS70SEQ ID No. 68YTLRAPRSPKMVQAS83SEQ ID No. 69YTLRAPRSPKMVQGA80

Примечание: подчеркнуты остатки аланина или глицина (А и G), заменяющие исходные аминокислоты.

Как и в случае поликлональных сывороток кроликов #046 805 и #046 832 (пример 7), эти результаты показывают, что минимальный эпитоп, необходимый для специфического распознавания проBNP(1-108) поликлональными антителами кролика #L01235, представлен RAPR₇₆S₇₇P.

Пример 9. Иммунизация мышей рекомбинантным белком проBNP(1-108)

Иммунизировали мышей линии BALB/c (самки 6-недельного возраста) с помощью рекомбинантного проBNP(1-108), описанного в примере 4b, классическими методами, хорошо известными в этой области. При первой инъекции использовали эмульсию из 1 мл проBNP(1-108) с 1 мл полного адъюванта Фрейнда (Sigma № F-5881), причем мышам вводили по 300 мкл этой эмульсии (т.е. 100 мкг белка) подкожно. Две повторные инъекции делали с интервалом в 15 дней, вводя внутрибрюшинно по 300 мкл эмульсии проBNP(1-108) (т.е. 100 мкг белка) вместе с неполным адъювантом Фрейнда (Sigma №F-5506). Через 15 дней после второго повтора делали третий повтор таким же образом, как и предыдущие, но путем подкожной инъекции. Наконец, через 15 дней после последнего повтора делали забор крови из мышей для анализа иммунного ответа методом пятен. Иммунный ответ мыши №12 оказался особенно интересным для дальнейшей работы.

Пример 10. Идентификация эпитопов, распознаваемых поликлональными антителами мыши №12 в последовательности проBNP(1-108)

Метод пятен, применявшийся для идентификация эпитопов, распознаваемых поликлональными антителами мыши №12 в последовательности проBNP(1-108), описан в примере 6.

Серия пептидов, синтезированных на мембране, состояла из 94 пентадекапептидов со сдвигом на 1 аминокислотный остаток, представляющих всю последовательность проBNP(1-108). Реактивность поликлональной сыворотки мыши №12, разведенной 1/500, тестировали на этой мембране, как описано в примере 6. После сканирования мембраны определяли интенсивность пятен на мембране (в относительных единицах интенсивности) с помощью программы для обработки изображений. Уровень фона, рассчитанный по пятнам, не выявляемым антисывороткой, составил 30 относительных единиц интенсивности.

При этом антитела из антисыворотки мыши №12 особенно хорошо детектировали три участка, расположенные в N-концевом положении последовательности проBNP(1-108): последовательность H₁PLGSPGSASDLETS₁₅ (SEQ ID No. 23) (пятна 1-12), последовательность L₁₇QEQRNHLQGK₂₇ (SEQ ID No. 123) (пятна 17-27) и последовательность L₃₈EPLQESPRPTG₄₉ (SEQ ID No. 124) (пятна 38-49).

Неожиданно оказалось, что антисыворотка мыши №12 также содержит антитела, способные распознавать пятна, у которых последовательность пептида содержит мотив RAPR₇₆S₇₇P: пятна 64-68. Последовательности пептидов из этих пятен приведены в табл.V.

Таблица V. Эпитопы из шарнирного участка, распознаваемые по методу пятен антисывороткой мыши №12

№ пятнаПоследовательность пептида в детектированном пятнеРеактивность в относ. ед. интенсивности№ пятнаПоследовательность пептида в детектированном пятнеРеактивность в относ. ед. интенсивности1HPLGSPGSASDLETS (SEQ ID No. 23)177,038LEPLQESPRPTGVW К (SEQ ID No. 88)177,02PLGSPGSASDLETSG (SEQ ID No. 70)170,039EPLQESPRPTGVWK S (SEQ ID No. 89)188,03LGSPGSASDLETSGL (SEQ ID No. 71)145,740PLQESPRPTGVWKS R (SEQ ID No. 90)109,04GSPGSASDLETSGLQ (SEQ ID No. 24)166,341LQESPRPTGVWKSR E (SEQ ID No. 91)166,05SPGSASDLETSGLQE (SEQ ID No. 72)185,042QESPRPTGVWKSRE V (SEQ ID No. 92)164,06PGSASDLETSGLQEQ (SEQ ID No. 73)169,343ESPRPTGVWKSREV A (SEQ ID No. 93)147,07GSASDLETSGLQEQ R (SEQ ID No. 25)155,244ESPRPTGVWKSREV A (SEQ ID No. 93)149,08SASDLETSGLQEQR N (SEQ ID No. 74)176,545SPRPTGVWKSREVA Т (SEQ ID No. 94)175,09ASDLETSGLQEQRN H (SEQ ID No. 75)108,046PRPTGVWKSREVAT E (SEQ ID No. 95)186,010SDLETSGLQEQRNH L (SEQ ID No. 76)118,347RPTGVWKSREVATE G (SEQ ID No. 16)171,011DLETSGLQEQRNHL Q (SEQ ID No. 77)121,048PTGVWKSREVATEG I (SEQ ID No. 96)148,012LETSGLQEQRNHLQ G (SEQ ID No. 78)101,049TGVWKSREVATEGI R (SEQ ID No. 97)72,017LQEQRNHLQGKLSE L (SEQ ID No. 79)99,061IRGHRKMVLYTLRA P (SEQ ID No. 98)105,818QEQRNHLQGKLSEL Q (SEQ ID No. 80)179,862RGHRKMVLYTLRAP R (SEQ ID No. 99)97,719EQRNHLQGKLSELQ V (SEQ ID No. 29)189,663GHRKMVLYTLRAPR S (SEQ ID No. 100)95,920QRNHLQGKLSELQV E (SEQ ID No. 81)211,864HRKMVLYTLRAPRS P (SEQ ID No. 53)92,821RNHLQGKLSELQVE Q (SEQ ID No. 82)219,065RKMVLYTLRAPRSP К (SEQ ID No. 101)48,022NHLQGKLSELQVEQ Т (SEQ ID No. 30)213,366KMVLYTLRAPRSPK M (SEQ ID No. 102)48,023HLQGKLSELQVEQT S (SEQ ID No. 83)202,667MVLYTLRAPRSPKM V (SEQ ID No. 45)42,124LQGKLSELQVEQTS L (SEQ ID No. 84)189,568VLYTLRAPRSPKMV Q (SEQ ID No. 103)38,425QGKLSELQVEQTSL E (SEQ ID No. 85)187,3   26GKLSELQVEQTSLEP (SEQ ID No. 86)36,6   27KLSELQVEQTSLEPL (SEQ ID No. 87)69,9   

Пример 11. Получение моноклональных антител, специфически распознающих проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108)

Отобранную для выработки моноклональных антител мышь (самка BALB/c, 5-недель) иммунизировали пептидом SEQ ID No. 16: C-YTLRAPRSPKMVQGSG-NH₂ (C13P30), конъюгированным с KLH (гемоцианином моллюска блюдечко), по следующей методике: вводили подкожно 100 мкг конъюгированного с KLH пептида, разведенного равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Делали четыре повтора с интервалом в 3 недели, вводя подкожно 100 мкг конъюгированного с KLH пептида, разведенного равным объемом неполного адъюванта Фрейнда.

За три дня до проведения слияния с лимфоцитами делали гипериммунизацию мыши по следующей методике: полную дозу иммуногена, т.е. 100 мкг конъюгированного с KLH пептида C-YTLRAPRSPKMVQGSG-NH₂ в стерильном буфере PBS, разделяли на 4 инъекции. Первая и вторая инъекции каждая соответствуют 1/10 полной дозы. Эти инъекции делали подкожно в разные места с интервалом в 45 мин. Третью инъекцию, которая соответствует 2/10 полной дозы, делали через 45 мин после второй инъекции, подкожно. Через 30 мин после третьей инъекции вводили внутрибрюшинно 100 мкл раствора прометазина 1 мг/мл в стерильном PBS (2,5% Phenergan, Laboratoires Medeva Parma) для предупреждения анафилактического шока. Еще через 15 мин делали внутрибрюшинно последнюю инъекцию, соответствующую 6/10 полной дозы.

Слияние с лимфоцитами осуществляли согласно методу, описанному Kohler et Milstein (Nature, 1975, 256: 495-97). Его выполнение начинается с клеток лимфоцитов, выделенных из селезенки мышей, и клеток миеломы (P3-X63-Ag8.653), заранее подвергнутых культивированию в среде RPMI 1640 (Bio-Whittaker №BE12-167F) с добавлением смеси L-глутамина, пенициллина и стрептомицина (Sigma № G-6784), а также 10% телячьей фетальной сыворотки, лишенной комплемента (Bio-Whittaker №ВЕ 02701Е), и 8-азагуанина (Sigma № А-8526). Клетки лимфоцитов и клетки миеломы, предварительно помещенные в среду RPMI 1640 (Bio-Whittaker № BE 12-167F) с добавлением смеси L-глутамина, пенициллина и стрептомицина (Sigma № G-6784) без добавления телячьей сыворотки, смешивали в соотношении 5 клеток лимфоцитов на 1 клетку миеломы. После центрифугирования смеси 7 мин при 900 об/мин при комнатной температуре и ресуспендирования осадка клеток добавляли 1 мл полиэтиленгликоля Hybri-Max (Sigma №Р-7777). После инкубации в течение 1 мин на водяной бане при 37°С клетки центрифугировали 1 мин 30 сек при 1000 об/мин при комнатной температуре. Затем после инкубации 2 мин на водяной бане при 37°С осадок ресуспендировали и добавляли 6 мл среды RPMI 1640 (Bio-Whittaker №BE12-167F) с добавлением смеси L-глутамина, пенициллина и стрептомицина (Sigma №G-6784), предварительно доведенной до 37°С, по 100 мкл каждые 5 секунд, и добавляли 9 мл той же среды однократно. После центрифугирования 10 мин при 900 об/мин при комнатной температуре и удаления супернатанта осадок ресуспендировали в среде RPMI 1640 (Bio-Whittaker №BE12-167F) с добавлением смеси L-глутамина, пенициллина и стрептомицина (Sigma №G-6784), а также 15% телячьей фетальной сыворотки, лишенной комплемента (Bio-Whittaker №ВЕ02701Е), и смеси HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин, Sigma №Н-0262), таким образом, чтобы вносить 120 000 клеток на 1 лунку в объеме 100 мкл. Раствор по 100 мкл вносили в лунки 96-луночного планшета для культивирования, предварительно заполненные макрофагами мышей. После этого планшеты помещали в инкубатор с СО₂. Через 15 дней после слияния с лимфоцитами определяли число клонов на планшетах и выражали в процентах развитие гибридом.

Селекцию гибридом осуществляли методом ELISA на проBNP(1-108), BNP(1-76), BNP(77-108) и пептиде, несущем последовательность RAPR76S7?P (C13P30). Отбирали только гибридомы, секретирующие антитела, способные обнаружить проBNP(1-108) и пептид C13P30, несущий последовательность RAPR₇₆S₇₇P, и практически не распознающие ни BNP(1-76), ни BNP(77-108). Отобранные гибридомы поддерживали в культуре и клонировали методом предельного разведения. Клонированные при этом гибридомы можно использовать для продукции моноклональных антител в асцитной жидкости.

Именно таким образом авторы изобретения получили гибридому мыши - клон 3D4, секретирующий иммуноглобулин изотипа IgG_1K, проявляющий характеристики антител по изобретению. Эта гибридома была депонирована 31 июля 2003 г. в CNCM (Национальная коллекция культур микроорганизмов, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75 724 Париж, Cedex 15, Франция) под регистрационным номером CNCM 1-3073.

Итак, предметом изобретения также является гибридома 3D4, депонированная в CNCM под регистрационным номером CNCM 1-3073, и секретируемые ею моноклональные антитела.

Пример 12. Проверка методом ELISA специфичности антител, продуцируемых гибридомой 3D4

Материалы

1) Твердая фаза: микропланшеты Maxisorp с плоским дном, Nunc (Дания).

2) BNP(77-108) был получен от Sigma (№В-5900), тогда как проBNP(1-108) и BNP(1-76) получали в виде рекомбинантных белков. Концентрации этих растворов белков определяли методом колориметрического определения белка по Брэдфорду (Bradford М., Anal. Biochem. 1976, 72: 248-54).

3) Используемый конъюгат представляет собой поликлональные антитела против IgG кролика, конъюгированные с пероксидазой (Jackson Immunoresearch №715-035-150).

4) Буфер для блокировки: буфер PBS Dulbecco pH 7,4, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma №А-7888).

5) Буфер для разведения: буфер PBS Dulbecco pH 7,4, содержащий 0,1% BSA и 0,1% Tween 20.

6) Раствор для промывки: буфер PBS Dulbecco pH 7,4, содержащий 0,1% Tween 20.

7) Раствор для проявления: раствор для проявления включает:

7а) субстратный буфер: раствор 0,01 М лимонной кислоты и 0,04 М тризамещенного цитрата натрия, содержащий 0,33% Н₂O₂, конечное значение pH 5,6, и

7b) хромоген: таблетки OPD (ортофенилендиамин). 1 таблетку OPD растворяют в 10 мл субстратного буфера.

8) Раствор для остановки реакции: 4 N H₂SO₄.

Методика

Определение заключается в оценке иммунореактивности супернатанта культуры гибридомы 3D4 непосредственно к различным белкам, иммобилизованным в лунках микропланшета.

- Сначала готовят несколько растворов для сенсибилизации в буфере PBS Dulbecco pH 7,4: первый содержит BNP(77-108) при 1 мкг/мл, второй содержит проBNP(1-108) при 1 мкг/мл, а третий содержит BNP(1-76) при 1 мкг/мл.

- По 100 мкл каждого из этих растворов вносят в лунки микропланшета.

- Микропланшет инкубируют в течение ночи при 4°С.

- После удаления растворов для сенсибилизации микропланшет промывают буфером PBS Dulbecco pH 7,4, содержащим 0,1% Tween 20, а затем блокируют добавлением 250 мкл буфера PBS Dulbecco pH 7,4, содержащего 1% BSA.

- Затем микропланшет инкубируют 1 час при 37°С.

- После этого микропланшет промывают (3 раза) раствором для промывки по 300 мкл.

- В каждую лунку вносят 100 мкл супернатанта гибридомы 3D4, предварительно разведенного 1/2 буфером для разведения.

- Реакционную среду инкубируют 2 часа при комнатной температуре.

- После этого микропланшет промывают 3 раза раствором для промывки по 300 мкл.

- В каждую лунку микропланшета добавляют 100 мкл конъюгата из конъюгированных с пероксидазой поликлональных антител против IgG мыши, разведенного 1/2000 буфером для разведения.

- Реакционную среду инкубируют 1 час при комнатной температуре.

- Планшет затем промывают (5 промывок) раствором для промывки по 300 мкл. В каждую лунку вносят 100 мкл раствора для проявления. Оставляют для проявления в темноте на 20 мин при комнатной температуре (18-24°С).

- После этого в каждую лунку добавляют 50 мкл раствора для остановки реакции.

- После остановки реакции измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при 490/620 нм.

На фиг.8 представлены результаты этого тестирования: антитела, продуцируемые в супернатанте гибридомы 3D4, способны обнаруживать исключительно проBNP(1-108) и иммунизационный пептид С13РЗО, не проявляя реактивности к BNP(1-76) и BNP(77-108). Эти результаты подтверждают специфичность продуцируемых гибридомой 3D4 антител к проBNP(1-108) при исключении BNP(1-76) и BNP(77-108).

Таким образом, антитела по изобретению, полученные из гибридомы 3D4, специфически распознают проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108).

Пример 13. Проверка методом Вестерн-блоттинга специфичности антител, продуцируемых гибридомой 3D4

Материалы

1) Прибор для стандартного электрофореза SDS-PAGE.

2) Концентрирующий гель: 5% акриламид.

3) Разделяющий гель: 16% акриламид.

4) Анодный буфер: 0,2 М трис, рН 8,9.

5) Катодный буфер: 0,1 М трис-трицин, 0,1% SDS.

6) Буфер для образцов: 0,5 М трис, рН 6,8, 25% глицерин, 2% SDS, 14,4 мМ (3-меркаптоэтанол, 0,1% бромфеноловый синий.

7) Прибор для электрофоретического переноса.

8) Буфер для переноса: 25 мМ трис-основание, 190 мМ глицин, 20% метанол, 0,05% SDS.

9) BNP(77-108) был получен от Sigma (№В-5900), тогда как проBNP(1-108)-GST, BNP(1-76)-GST и GST (используется в качестве отрицательного контроля) получали в виде рекомбинантных белков. Концентрации этих растворов белков определяли методом колориметрического определения белка по Брэдфорду (Bradford M., Anal. Biochem. 1976, 72: 248-54).

10) Используемый конъюгат представляет собой поликлональные антитела осла против IgG мыши, конъюгированные с пероксидазой (Jackson Immunoresearch №715-035-150).

11) Набор ECL для проявления Вестерн-блотов (Amersham Biosciences №RPN2106).

Методика

Проведение этого теста включает три основные стадии: электрофоретическое разделение различных белков в 16% акриламидном геле, затем перенос этих белков на нитроцеллюлозную мембрану, а затем Вестерн-блоттинг.

- Готовят несколько растворов в буфере для образцов в конечном объеме 35 мкл: первый содержит 1 мкг проBNP(1-108)-GST, второй содержит 1 мкг GST, третий содержит 1 мкг BNP(1-76)-GST, а четвертый содержит 1 мкг BNP(77-108).

- Каждый раствор инкубируют на водяной бане 5 мин при 100°С, а затем вносят в лунки геля. Разделение в акриламидном геле проводится при постоянном напряжении 120 В в течение 1 ч 30 мин. Фиг.9 соответствует фотографии полученного акриламидного геля. Отложенные белки окрашиваются красителем кумасси синим.

- После разделения белки из геля переносят на нитроцеллюлозную мембрану в течение 1 часа при 120 мА.

- Затем нитроцеллюлозную мембрану промывают буфером PBS+0,1% Tween и блокируют в течение 30 мин при комнатной температуре в буфере PBS+0,1% Tween+2% обезжиренное молоко.

- После 3 промывок буфером PBS+0,1% Tween мембрану инкубируют 1 час при 37°С со встряхиванием в присутствии 5 мл супернатанта гибридомы 3D4.

- После 3 промывок буфером PBS+0,1% Tween мембрану инкубируют 1 час при комнатной температуре со встряхиванием в присутствии 10 мл конъюгированных с пероксидазой антител против IgG мыши, разбавленных 1/2000 буфером PBS+0,1% Tween+2% обезжиренное молоко.

- После 3 промывок буфером PBS+0,1% Tween мембрану погружают в реактив для проявления ECL, а затем экспонируют на фотопленке в течение 4 мин.

Как видно из фиг.10, соответствующей сканированному изображению полученной фотографии, антитела, продуцируемые в супернатанте гибридомы 3D4, способны обнаруживать исключительно полосу, соответствующую проBNP(1-108). BNP(1-76) и BNP(77-108), а также GST не обнаруживаются антителами гибридомы 3D4. Эти результаты также подтверждают специфичность продуцируемых гибридомой 3D4 антител к проBNP(1-108).

Таким образом, именно антитела по изобретению, полученные из гибридомы 3D4, специфически распознают проBNP(1-108), практически исключая BNP(1-76) и BNP(77-108).

Пример 14. Идентификация методом пятен эпитопа, распознаваемого антителами, продуцируемыми гибридомой 3D4

Супернатант гибридомы 3D4 тестировали методом пятен (описанным в примере 6) с целью идентификации эпитопа, распознаваемого антителами гибридомы 3D4. Полученные результаты показывают, что антитела 3D4 эффективно распознают последовательности пептидов, содержащих мотив RAPR₇₆S₇₇P.

Эти результаты согласуются с данными, полученными методами ELISA (пример 12) и Вестерн-блоттинга (пример 13), подтверждая специфичность антител 3D4 к проBNP(1-108).

Пример 15. Определение проBNP(1-108) методом радиоиммуноанализа

Материалы

1) Твердая фаза: микропланшеты Maxisorp с плоским дном и съемными лунками, Nunc (Дания).

2) Захватывающие антитела представляют собой поликлональные антитела, полученные из сыворотки кролика #046 805 без истощения.

3) Используемый конъюгат представляет собой антитела к BNP(77-108), меченные с помощью ¹²⁵I (анти-BNP-I¹²⁵). Это индикаторные антитела из набора BNP Shionoria фирмы Shionogi.

4) Буфер для блокировки: буфер PBS Dulbecco pH 7,4, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma №А-7888).

5) Буфер для разведения: буфер PBS Dulbecco pH 7,4, содержащий 0,1% BSA и 0,1% Tween 20 (Sigma №P-1379).

6) Буфер для промывки: буфер PBS Dulbecco pH 7,4, содержащий 0,1% Tween 20.

7) Стандарт проBNP(1-108): получен в виде рекомбинантного белка.

Методика

Принцип определения основан на радиоиммунологическом методе типа "сэндвич", который выполняется в микропланшетах с плоским дном и съемными лунками. Определение состоит из одной стадии, в которой образец (или стандартный раствор проBNP(1-108) и индикатор добавляют один за другим без промежуточной промывки.

- Сначала готовят раствор для сенсибилизации с поликлональными антителами кролика #046 805, разведенными буфером PBS Dulbecco pH 7,4 до 40 мкг/мл. По 300 мкл этого раствора вносят в лунки микропланшета.

- Микропланшет инкубируют в течение ночи при 4°С.

- После удаления раствора для сенсибилизации микропланшет промывают с помощью 300 мкл буфера PBS Dulbecco pH 7,4, содержащего 0,1% Tween 20, а затем блокируют добавлением 300 мкл буфера PBS Dulbecco pH 7,4, содержащего 1% BSA.

- Затем микропланшет инкубируют 1 час при 37°С.

- После этого микропланшет промывают (3 раза) раствором для промывки (буфер PBS Dulbecco pH 7,4 с добавлением 0,1% Tween 20) по 300 мкл.

- В каждую лунку вносят 100 мкл стандартного раствора проBNP(1-108), сыворотки или плазмы. ПроВМР(1-108), если он есть, связывается с захватывающими антителами, осевшими на твердой фазе,

- В каждую лунку добавляют 200 мкл готового к употреблению индикатора анти-BNP-I¹²⁵ (взятого из набора BNP Shionoria фирмы Shionogi).

- Реакционную среду инкубируют в течение ночи (18-22 ч) при 4°С.

- На следующий день микропланшет промывают (3 раза) раствором для промывки по 300 мкл. При последней промывке и после удаления раствора для промывки каждую лунку переносят в заранее подписанную пробирку.

- Радиоактивность в каждой лунке, которая пропорциональна количеству фиксированного в ней индикатора и тем самым количеству проBNP(1-108), находящегося в образце, измеряют на γ-счетчике.

На фиг.11 представлены результаты, полученные с помощью стандартного ряда проBNP(1-108).

Пример 16. Результаты определения в образцах человека

При помощи определения проBNP(1-108) методом РИА по изобретению, описанным в примере 15, и определения BNP(1-76) по методике фирмы Roche на автоматизированном приборе Elecsys, протестировали 14 проб крови здоровых лиц и 15 проб крови пациентов, страдающих сердечной недостаточностью. Пробы крови отбирали в пробирки, содержащие ЭДТА.

На фиг.12 представлены результаты в cpm (импульсы в мин) тестирования этих образцов при определении проBNP(1-108) методом РИА по изобретению. Результаты, полученные на пробах крови пациентов, страдающих сердечной недостаточностью, значительно более высокие, чем те, которые получены на пробах крови здоровых лиц. Эти результаты свидетельствуют о присутствии проBNP(1-108) в пробах крови пациентов, страдающих сердечной недостаточностью, и впервые показывают, что проBNP(1-108) в сыворотке крови является прогностическим маркером сердечной недостаточности. На фиг.13 представлена корреляция между концентрацией проBNP(1-108) (в пг/мл) при определении методом РИА по изобретению и концентрацией BNP(1-76) (пг/мл) при определении по методике фирмы Roche на автоматизированном приборе Elecsys в пробах крови из 14 пациентов, страдающих сердечной недостаточностью. Наблюдавшаяся корреляция статистически значима с коэффициентом R²=0,85.

Пример 17. Конъюгирование поликлональных антител кролика #046 805 с биотином

В этом методе конъюгирования используется N-гидроксисукцинимидное (NHS) производное биотина, которое реагирует с первичными аминами IgG с образованием амидной связи.

Раствор N-сукцинимидилового эфира (+)-биотина (Fluka #14405) в концентрации 100 мМ готовили растворением этого биотина в диметилформамиде. Биотинилирование проводили в стеклянном флаконе. Во флакон вносили 500 мкг предварительно очищенных, но не истощенных поликлональных антител кролика #046 805 вместе с 17 мкл 100 мМ раствора биотина (молярное отношение биотин/антитела равно 500). Реакцию проводили в буфере PBS Dulbecco pH 7,4. Реакционную смесь инкубировали 1 ч 30 мин при комнатной температуре с медленным перемешиванием. После конъюгирования биотин инактивировали добавлением одного объема 2 М глицинового буфера. Смесь инкубировали 10 мин при комнатной температуре с медленным перемешиванием. Затем смесь ставили на диализ в течение ночи при 4°С против буфера PBS Dulbecco pH 7,4. На следующий день добавляли раствор азида натрия до конечной концентрации 0,02%. Конъюгат хранили при 4°С.

Пример 18. Определение проBNP(1-108) иммуноферментным методом

Было также разработано иммуноферментное определение по изобретению.

Материалы

1) Твердая фаза: микропланшеты Maxisorp с плоским дном, Nunc (Дания).

2) Захватывающие антитела представляют собой поликлональные антитела к BNP(77-108) фирмы Strategic Biosolution (№B9105RAOO-AO).

3) Используемый конъюгат представляет собой поликлональные антитела кролика #046 805 без истощения, конъюгированные с биотином по методике, описанной в примере 17.

4) Конъюгат стрептавидин-пероксидаза (Amersham Pharmacia Biotech № RPN-1231V).

5) Буфер для блокировки: буфер PBS Dulbecco pH 7,4, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma №А-7888).

6) Буфер для разведения: буфер PBS Dulbecco pH 7,4, содержащий 0,1% BSA и 0,1% Tween 20.

7) Раствор для промывки: буфер PBS Dulbecco pH 7,4, содержащий 0,1% Tween 20.

8) Стандарт проBNP(1-108): рекомбинантный белок.

9) Раствор для проявления: раствор для проявления включает:

9а) субстратный буфер: раствор 0,01 М лимонной кислоты и 0,04 М тризамещенного цитрата натрия, содержащий 0,33% Н₂O₃, конечное значение pH 5,6, и

9b) хромоген: таблетки OPD (ортофенилендиамин). 1 таблетку OPD растворяют в 10 мл субстратного буфера.

10) Раствор для остановки реакции: 4 N H₂SO₄.

Методика

Принцип определения основан на иммуноферментном методе типа "сэндвич", который выполняется в микропланшетах с плоским дном. Определение состоит из двух стадий, в которых образец (или стандартный раствор) сначала инкубируют с захватывающими антителами, а затем после инкубации и промывки добавляют детектирующие антитела.

- Сначала готовят раствор для сенсибилизации с поликлональными антителами к BNP(77-108), разведенными буфером PBS Dulbecco pH 7,4 до 10 мкг/мл. По 100 мкл этого раствора вносят в лунки микропланшета.

- Микропланшет инкубируют в течение ночи при 4°С.

- После удаления раствора для сенсибилизации микропланшет промывают с помощью 300 мкл буфера PBS Dulbecco pH 7,4, содержащего 0,1% Tween 20, а затем блокируют добавлением 250 мкл буфера PBS Dulbecco pH 7,4, содержащего 1% BSA.

- Затем микропланшет инкубируют 1 час при 37°С.

- После этого микропланшет промывают (3 раза) раствором для промывки.

- В каждую лунку вносят 100 мкл стандартного раствора проBNP(1-108), сыворотки или плазмы. ПроВМР(1-108), если он есть, связывается с захватывающими антителами, осевшими на твердой фазе.

- Реакционную среду инкубируют 2 часа при комнатной температуре.

- После этого микропланшет промывают (5 промывок) раствором для промывки по 300 мкл.

- В каждую лунку микропланшета добавляют 100 мкл биотинилированных поликлональных антител кролика #046 805 (в концентрации 6 мкг/мл).

- Реакционную среду инкубируют 2 часа при комнатной температуре.

- После этого микропланшет промывают (5 промывок) раствором для промывки по 300 мкл.

- В каждую лунку микропланшета добавляют 100 мкл конъюгата стрептавидин-пероксидаза, разведенного 1/1000.

- Реакционную среду инкубируют 1 ч 30 мин при комнатной температуре.

- Затем планшет промывают (5 промывок) раствором для промывки по 300 мкл. В каждую лунку вносят 100 мкл раствора для проявления. Оставляют для проявления в темноте на 20 мин при комнатной температуре (18-24°С).

- После этого в каждую лунку добавляют 50 мкл раствора для остановки реакции.

- После остановки реакции измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при 490/620 нм.

На фиг.14 представлены результаты, полученные с помощью стандартного ряда проBNP(1-108).

Пример 19. Оценка перекрестной реакции в отношении BNP(1-76) и BNP(77-108) поликлональных антител кролика #046 805 без истощения, конъюгированных с биотином, применяемых при определении проBNP(1-108) сэндвич-методом ELISA вместе с поликлональными антителами к BNP(77-108)

При помощи определения проBNP(1-108) методом ELISA, описанным в примере 18, оценивали перекрестную реакцию антител к проBNP(1-108) по изобретению (кролик #046805), без истощения, биотинилированных, в отношении BNP(1-76) и BNP(77-108). Составляли стандартные ряды концентраций от 5 нг/мл до 100 нг/мл проBNP(1-108), BNP(1-76) и BNP(77-108) и тестировали при помощи определения проBNP(1-108) методом ELISA, описанным в примере 18. Результаты изменения оптической плотности при 490 нм в зависимости от концентрации представлены на фиг.15 для каждого белка. Никакой перекрестной реакции в отношении BNP(1-76) или BNP(77-108) не наблюдалось: полученный сигнал не отличался от фона независимо от исследуемой концентрации. При концентрациях BNP(1-76) и BNP(77-108), обычно встречающихся у пациентов (порядка нг/мл при самых высоких концентрациях), поликлональные антитела кролика #046 805 могут применяться в варианте без истощения, не вызывая появления перекрестной реакции.

Пример 20. Оценка перекрестной реакции в отношении BNP(1-76) и BNP(77-108) поликлональных антител кролика #046 805 без истощения, конъюгированных с биотином, применяемых при определении проBNP(1-108) сэндвич-методом ELISA вместе с поликлональными антителами к NT-проBNP(1-29)

При помощи определения проBNP(1-108) методом ELISA, используя методику и реагенты, описанные в примере 18, за исключением того, что поликлональные антитела к проBNP(1-108) заменили поликлональными антителами к NT-проBNP(1-29), оценивали перекрестную реакцию поликлональных антител кролика #046 805 без истощения, биотинилированных, в отношении BNP(1-76) и BNP(77-108).

Поликлональные антитела к NT-проBNP(1-29) получали по методике, описанной в примере 3, за исключением того, что в качестве иммуногена использовали пептид NT-проBNP(1-29), конъюгированный с KLH. Составляли стандартные ряды концентраций от 5 нг/мл до 100 нг/мл проBNP(1-108), BNP(1-76) и BNP(77-108) и тестировали при помощи определения проBNP(1-108) методом ELISA. Результаты изменения оптической плотности при 490 нм в зависимости от концентрации представлены на фиг.16 для каждого белка. Никакой перекрестной реакции поликлональных антител кролика #046 805 по изобретению в отношении BNP(1-76) или BNP(77-108) не наблюдалось: полученный сигнал не отличался от фона независимо от исследуемой концентрации. При концентрациях BNP(1-76) и BNP(77-108), обычно встречающихся у пациентов (порядка нг/мл), поликлональные антитела кролика #046 805 могут применяться в варианте без истощения, не вызывая появления перекрестной реакции.

Подводя итоги, из предшествующего изложения четко следует, что настоящее изобретение сделало возможным открытие нового эпитопа - RAPR₇₆S₇₇P, расположенного в шарнирном участке проBNP(1-108) человека, получение содержащих его иммуногенных пептидов и получение антител, специфичных к проBNP(1-108) и не распознающих BNP(1-76) и BNP(77-108), причем некоторые из них обладают способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека.

Также очевидно и то, что настоящее изобретение сделало возможной разработку метода определения циркулирующего проBNP(1-108), тем самым позволяя проводить диагностику сердечной недостаточности простым, имеющим рутинное применение и надежным способом.

Список последовательностей приведен в конце описания.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предложены варианты антител, специфичных к пептидному домену, расположенному по обе стороны шарнирного участка R₇₆S₇₇ в проBNP(1-108). Указанные антитела также специфически распознают циркулирующий проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека и практически не распознают пептиды BNP(1-76) или BNP(77-108). Описаны варианты пептидов, используемых для получения антител. Аминокислотная последовательность в описании. Раскрыты также способы получения указанных антител, в том числе с использованием указанных пептидов. Описаны способы получения гибридомы, секретирующей антитела, и раскрыта гибридома, полученная указанным способом. Описано моноклональное антитело, секретируемое гибридомой 3D4, депонированной под номером CNCM I-3073. Раскрыты варианты способа диагностики in vitro сердечной недостаточности с использованием антител по изобретению. Описан набор для обнаружения проBNP(1-108) в биологическом образце. Использование изобретения упрощает обнаружение циркулирующего в образцах сыворотки или плазмы человека проBNP(1-108) и делает обнаружение проBNP(1-108) более специфичным, что может найти применение в ранней диагностике сердечной недостаточности человека. 14 н. и 10 з.п. ф-лы, 16 ил., 5 табл.

1. Антитело к проBNP(1-108) (пропептиду натриуретического пептида мозга), отличающееся тем, что, с одной стороны, оно распознает специфическим образом последовательность RAPR₇₆S₇₇P (SEQ ID No. 5) проBNP(1-108) и практически не распознает пептиды BNP(1-76) и BNP(77-108), а, с другой стороны, обладает способностью к специфическому распознаванию циркулирующего проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека.2. Антитело к проBNP(1-108) по п.1, распознающее специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSG₈₅ (SEQ ID No. 4) проBNP(1-108).3. Антитело к проBNP(1-108) no п.1, распознающее специфическим образом последовательность Y₇₀TLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGS₈₄ (SEQ ID No. 108) проBNP(1-108).4. Пептид, предназначенный для получения антитела, распознающего специфическим образом последовательность RAPRSP (SEQ ID No. 5) проBNP(1-108) и циркулирующий проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека и практически не распознающего пептиды BNP(1-76) или BNP(77-108), имеющий формулу

где a₁ означает Н или функциональную группу или химическую группировку, выбранную из тиоловой, спиртовой, аминоокси-функциональных групп, первичного или вторичного амина, аминокарбоксильной группы, биотинильной группы и ацетильной группы,

X₁ означает пептидную последовательность из 0-3 аминокислот, происходящую или не происходящую из природной последовательности проBNP(1-108),

Х₂ означает пептидную последовательность из 0-7 аминокислот, происходящую или не происходящую из природной последовательности проBNP(1-108),

a₂ означает функциональную группу ОН, NH₂ или алкоксильную группу.

где Х означает Н или ацетильную группу либо 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108), a Z означает группу ОН или 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108).

где X означает Н или ацетильную группу либо 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108), a Z означает группу ОН или 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108).

9. Пептид, предназначенный для получения антитела, распознающего специфическим образом последовательность RAPRSP (SEQ ID No. 5) проBNP(1-108) и циркулирующий проBNP(1-108) в образцах сыворотки или плазмы человека и практически не распознающего пептиды BNP(1-76) или BNP(77-108), содержащий последовательность, происходящую из последовательности или из последовательности путем замены одной или нескольких аминокислот из числа Y₇₀, T₇₁, L₇₂, К₇₉, M₈₀, V₈₁, Q₈₂, G₈₃, S₈₄ и G₈₅, причем Х может означать ацетильную группу либо 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108), a Z может представлять собой группу ОН либо 1-3 аминокислоты, не принадлежащие к последовательности проBNP(1-108).

SEQ ID No. 16: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G (пептид С13Р30)

SEQ ID No. 109: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S (пептид CN32)

SEQ ID No. 6: C-G-R-A-P-R-S-P

SEQ ID No. 7: Ацетил-C-G-R-A-P-R-S-P

SEQ ID No. 8: C-G-R-A-P-R-S-P-K

SEQ ID No. 9: Ацетил-C-G-R-A-P-R-S-P-K

SEQ ID No. 10: C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-V

SEQ ID No. 11: C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G

SEQ ID No. 12: R-A-P-R-S-P-G-C

SEQ ID No. 13: Ацетил-R-A-P-R-S-P-G-C

SEQ ID No. 110: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K

SEQ ID No. 111: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V

SEQ ID No. 112: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q

SEQ ID No. 113: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G

SEQ ID No. 19: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-βA

SEQ ID No. 20: C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-A-T-βA

SEQ ID No. 114: Ацетил-C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q

SEQ ID No. 115: C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G

SEQ ID No. 116: C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S

SEQ ID No. 117: C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G

SEQ ID No. 118: C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V

SEQ ID No. 119: C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q

SEQ ID No. 120: L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-C

SEQ ID No. 121: C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S

SEQ ID No. 122: C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G

животное иммунизируют пептидом, выбранным из пептида по любому из пп.4-10, и

выделяют из этого животного лимфоциты, секретирующие иммуноглобулины, и

осуществляют слияние лимфоцитов с клетками миеломы для получения, по меньшей мере, одной гибридомы, секретирующей иммуноглобулин.

a) приведение биологического образца в контакт с антителом к проBNP(1-108), охарактеризованным в любом из пп.1, 2, 3 15, 20 и 21;

b) инкубацию этой смеси в условиях, способствующих образованию комплексов антиген-антитело;

c) обнаружение образовавшихся комплексов антиген-антитело, при необходимости, с помощью детектирующих меченых антител, способных к специфическому связыванию с проBNP(1-108), присутствующим в первичном комплексе, либо с помощью детектирующего меченого антигена, способного к связыванию с антителом к указанному проBNP(1-108), присутствующим в первичном комплексе, и

d) коррелирование количества обнаруженных комплексов антиген-антитело с клиническим состоянием субъекта.

(i) в одной емкости, по меньшей мере, одно антитело, охарактеризованное в любом из пп.1, 2, 3, 15, 20, 21;

(ii) в другой емкости, по меньшей мере, один пептид, выбранный из пептида по любому из пп.4-10.