СПОСОБ ЦИТОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ И ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ОПУХОЛИ ВИЛЬМСА У ДЕТЕЙ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии. В настоящее время существуют два подхода к тактике лечения больных нефробластомой. Один из них поддерживается Национальной группой по исследованию опухолей Вильмса (NWTSG, США) и заключается в том, что начальным этапом лечения больных является оперативное удаление опухоли и лишь после установления стадии заболевания и гистологической формы опухоли назначается последующая химиотерапия и лучевое лечение. Второй подход, поддерживаемый Международным обществом педиатрической онкологии (SIOP), предполагает предоперативное лечение детей с опухолью Вильмса с помощью лучевой или химиотерапии без гистологического подтверждения диагноза до лечения с последующим оперативным удалением опухоли и продолжением лучевой или химиотерапии. Основанием для такого подхода является возможность значительного уменьшения размера опухоли до операции, что облегчает ее удаление, снижает риск разрыва капсулы опухоли во время операции, риск повреждения прилежащих органов, осложнений и уменьшает частоту рецидивов. Однако при таком подходе отсутствует морфологическая верификация опухолевого поражения, что может привести к неадекватному назначению лучевой или химиотерапии при доброкачественных опухолях или опухолях другого гистогенеза, при гистологическом исследовании удаленной опухоли отмечаются явления лекарственного патоморфоза вплоть до тотального некроза. В то же время получение материала для гистологического исследования с помощью биопсии до предоперационной лучевой и химиотерапии противопоказано из-за высокого риска диссеминации опухоли и ухудшения результатов лечения.

За последние 12 лет в литературе появились отдельные сообщения о возможности использования цитологического метода исследования материала, полученного с помощью пункции тонкой иглой, для диагностики опухоли Вильмса (Akhtar M. et al., 1989. Day P. еt al., 1993. Hazarika D. et al., 1994. Л.А. Красильникова, Ю.А. Пунанов, 1998 и др.). Описаны особенности цитологических картин при этих опухолях, приведены критерии дифференциальной цитологической диагностики опухоли Вильмса с другими новообразованиями у детей.

При использовании современных методов хирургического, лекарственного и лучевого лечения примерно у 80% детей с опухолью Вильмса отмечаются удовлетворительные отдаленные результаты лечения. Прогностическими факторами течения и исхода заболевания являются стадия, гистологическая форма опухоли, ее размер, возраст пациентов. Гистологически неблагоприятным типом является анапластический тип опухоли Вильмса, при котором отмечается выраженный клеточный и ядерный полиморфизм, наличие в препаратах очень крупных гиперхромных ядер и большого количества атипических митозов.

Исследования, проводившиеся с целью определить возможность использования плоидности ДНК опухолевых клеток для установления прогноза опухоли Вильмса и выполненные как с помощью проточной цитофотометрии, так и анализа изображения, дали противоречивые результаты. Одни авторы (Kumar еt al., 1989, Layfield et al. , 1989) не нашли корреляции между плоидностью ДНК, выживаемостью больных и гистологической формой опухоли Вильмса, другие (Rainwater at al., 1987) нашли, что плоидность ДНК и стадия заболевания были прогностически значимыми как независимо, так и в сочетании друг с другом.

В качестве прототипа предлагаемого изобретения можно рассматривать использование цитологического исследования материала тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ) и определения плоидности ДНК с помощью анализа изображения в установлении прогноза опухоли Вильмса (V.K. Lyer еt al.: Wilms' tumor. Role of fine needle aspiration and DNA ploidy by image analysis in prognostication // Analyt Quant Cytol Histol, 1999, 21, 5, р. 505-511). Авторы показали, что неблагоприятная цитология и анэуплоидия/тетраплоидия в мазках, взятых с помощью ТАБ опухоли Вильмса до лечения, связаны с плохим прогнозом. Следует, однако, отметить, что, по словам самих авторов, указанное сообщение является предварительным и выполнено на сравнительно небольшом материале. Вызывает сомнение деление больных на группы с хорошим и плохим прогнозом в зависимости от выживания или смерти в течение 2 лет. В указанном сообщении проводилось только однократное исследование до лечения и не учитывалась реакция опухоли на проводимую предоперационную лучевую и химиотерапию, т.е. не определялся патоморфоз опухоли.

Технический результат настоящего изобретения состоит в верификации клинического диагноза и уточнения прогноза течения опухоли Вильмса у детей.

Это достигается проведением цитологического исследования мазков, полученных с помощью пункции тонкой иглой опухоли до лечения, а также мазков-отпечатков с поверхности разреза опухоли после ее удаления. Мазки, окрашенные по Лейшману, оцениваются опытным цитологом визуально, после этого наиболее информативные из них обесцвечиваются и переокрашиваются по методу Фельгена и исследуются с помощью анализатора микроизображений. При визуальной оценке проводится дифференциальная цитологическая диагностика опухоли Вильмса с другими новообразованиями и с помощью полуколичественного метода определяется наличие клеток бластемы, эпителиального и соединительно-тканного компонентов опухоли, а также полиморфных клеток опухоли с крупными гиперхромными ядрами и укрупненными ядрышками, характеризующими неблагоприятный морфологический тип опухоли Вильмса. Применение анализатора микроизображений позволяет объективизировать цитологические данные путем определения морфометрических параметров ядер опухолевых клеток и оценки гистограммы распределения ДНК.

При благоприятном прогнозе опухоли Вильмса цитологическая картина мазков ТАБ характеризуется высокой клеточностью с преобладанием элементов бластемы; в меньшем количестве в мазках присутствуют соединительно-тканные и эпителиальные компоненты опухоли (стандартный тип цитограммы опухоли Вильмса). Клетки бластемы округлой или овальной формы, ядра однотипные, в некоторых из них видны мелкие ядрышки, встречаются фигуры митозов. В большинстве случаев определяется диплоидное распределения ядерной ДНК, иногда со смещением гистограммы влево за счет гаплоидных клеток (с=1). После предоперационной лучевой и химиотерапии в мазках-отпечатках с поверхности опухоли в большинстве случаев отмечается умеренное или значительное уменьшение количества клеток бластемы (от 3 до 1 балла), появление или усиление в них признаков дистрофии (вакуолизация ядер и цитоплазмы), обнаруживаются поля некроза ткани.

При неблагоприятном прогнозе заболевания во многих случаях цитологическая картина материала, полученного при ТАБ, не отличается от таковой при благоприятном прогнозе, однако в ряде случаев в мазках выявляются полиморфные клетки опухоли с крупными неправильной формы ядрами, неравномерной структурой хроматина и укрупненными, часто множественными, ядрышками. В большинстве случаев, даже при стандарнтом типе цитограммы опухоли, гистограмма распределения ядерной ДНК характеризуется сдвигом вправо с наличием того или иного количества анэуплоидных клеток (5с, 6с и более). В мазках-отпечатках удаленной опухоли после проведения предоперационной терапии во многих случаях цитологическая картина по сравнению с цитограммой пунктата остается без изменений; в некоторых случаях появляются анаплазированные опухолевые клетки, которые отсутствовали в пункционном материале.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Больная Ксенофонтова Н. , 6 лет. И/б 3088 от 10.09.85. При цитологическом исследовании материала ТАБ до лечения ( 114045 от 12.09.85) диагностирована опухоль Вильмса с большим количеством клеток бластемы (3+) и небольшим количеством соединительно-тканных клеток (1+). Отмечено диплоидное распределение ядерной ДНК со сдвигом гистограммы влево (см. фиг.1). Больной проведено 2 курса предоперационной полихимиотерапии и 1 курс лучевой терапии (18 Гр) с хорошим результатом: по данным УЗИ размер опухоли уменьшился с 15•10 см до 45 мм в диаметре. 30.01.86 произведена нефрэктомия с удалением опухоли. Установлена II стадия заболевания. Гист. исследование 172540 от 30.01.86 - нефробластома, мезенхимный тип с обширными некрозами. В мазках-отпечатках с поверхности разреза опухоли отмечено значительное уменьшение количества клеток опухолевой бластемы (1+), в этих клетках имелись выраженные дистрофические изменения, были видны поля некрозов. Проведены курсы послеоперационной химио- и лучевой терапии. Больная жива и чувствует себя хорошо на январь 2001 года (более 15 лет от начала лечения).

Пример 2. Больная Туман Е., 5 лет. И/б 5214 от 02.12.93 г. При цитологическом исследовании материала ТАБ до лечения ( 206264 от 03.12.93) диагностирована опухоль Вильмса с большим количеством клеток бластемы (3+), среди которых в значительном количестве (2+) были видны анаплазированные клетки с очень крупными уродливыми ядрами с увеличенными ядрышками в отдельных клетках. Отмечено анэуплоидное распределение ДНК опухолевых клеток с пиком в области 3с и сдвигом гистограммы вправо; до 10% от общего количества составляли клетки с плоидностью 5с, 6с, 7с и 8с (см. фиг.2). Больной проведено 2 курса предоперационной полихимиотерапии с плохим эффектом; по данным УЗИ размер опухоли уменьшился примерно на 15% (с 700 до 576 см³). 25.01.94 г. произведена нефрэктомия со спленэктомией. Процесс расценен как III стадия (поражены парааортальные лимфатические узлы). Гист. исследование 211649 от 25.01.04 - нефробластома с фокусами анаплазии опухоли. Проводилась послеоперационная химиотерапия, однако 09.04.94 г. наступила смерть на фоне прогрессирования процесса (через 4 мес. после начала лечения).

Пример 3. Больная Воробьева Л., 3 г. И/б 4785 от 30.12.86. При цитологическом исследовании материала ТАБ до лечения ( 129731 от 04.01.87) диагностирована опухоль Вильмса с большим количеством клеток бластемы (3+) и умеренным количеством соединительно-тканных клеток (2+). Отмечено диплоидное распределение ДНК ядер опухолевых клеток со значительным сдвигом влево за счет гаплоидных ядер (см. фиг. 3). Больной проведено 3 курса предоперационной полихимиотерапии и лучевая терапия (18 Гр); размер опухоли (клинически 20•15 см) уменьшился очень незначительно. 31.03.87 г. произведена нефрэктомия, установлена III стадия заболевания. Гист. исследование 179040 от 31.03.87 - опухоль Вильмса с саркоматозной стромой и рабдоидным компонентом. В мазках-отпечатках с поверхности разреза опухоли ( 132985) отмечено уменьшение клеток бластемы (до 1+), однако в умеренном количестве (2+) были видны отсутствующие при исследовании материала ТАБ полиморфные анапластические клетки. При анализе гистограммы распределения ДНК отмечен сдвиг гистограммы вправо и появление небольшого количества анэуплоидных клеток (3,3% клеток с плоидностью 5с; см. фиг.4). Проводились 3 курса послеоперационной химиотерапии и курсы лучевой терапии на парааортальные лимфатические узлы и ложе опухоли, однако 26.10.87 г., через 9 месяцев после начала лечения больная умерла.

Предлагаемый способ разработан при ретроспективной оценке клинических данных, данных цитологического и гистологического исследований, а также анализа гистограмм распределения ядерной ДНК у 29 больных детей с опухолью Вильмса. В соответствии с данными прослеживания больных выделены 2 группы: 1) с хорошим прогнозом заболевания (все дети живы в период наблюдения от 4 до 15 лет - 17 человек) и 2) с плохим прогнозом (все дети умерли в течение от 4 месяцев до 4 лет - 12 человек). У всех 29 больных произведено цитологическое исследование материала ТАБ до лечения, у 22 из них параллельно исследованы мазки-отпечатки с поверхности разреза удаленной опухоли. Результаты сравнения цитограмм и характера распределения ядерной ДНК у больных с хорошим и плохим прогнозом представлены в таблице (статистическая достоверность вычислялась по методу хи-квадрат).

Способ по сравнению с известными имеет преимущество, заключающееся в том, что производится комплексная оценка цитологических картин до предоперационного лечения и в динамике после него, что повышает возможности предварительного определения прогноза опухоли Вильмса.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. Сущность способа состоит в проведении цитологического исследования мазков пунктата из опухоли до и мазков-отпечатков после предоперационного лечения и при определении стандартного типа цитограммы опухоли Вильмса, диплоидного типа гистограммы распределения ядерной ДНК и выраженного лекарственного патоморфоза предполагают благоприятный прогноз заболевания. При выявлении в мазках пунктата анапластических клеток, сдвиге гистограммы распределения ДНК вправо и наличии анэуплоидных клеток с плоидностью 5с и более и отсутствии лекарственного патоморфоза или проявлении признаков анаплазии опухоли в мазках-отпечатках при первоначально стандартном типе цитограммы опухоли Вильмса предполагают неблагоприятный прогноз заболевания. Техническим результатом является верификация клинического диагноза и уточнение прогноза течения опухоли Вильмса у детей. 1 табл., 4 ил.

Способ цитологической диагностики и прогнозирования течения опухоли Вильмса у детей, включающий цитологическое исследование материала тонкоигольной аспирационной биопсии и определение плоидности ДНК с помощью анализа изображения, отличающийся тем, что проводят цитологическое исследование мазков пунктата из опухоли до и мазков-отпечатков после предоперационного лечения и при определении стандартного типа цитограммы опухоли Вильмса, диплоидного типа гистограммы распределения ядерной ДНК и выраженного лекарственного патоморфоза предполагают благоприятный прогноз заболевания; при выявлении в мазках пунктата анапластических клеток, сдвиге гистограммы распределеия ДНК вправо и наличии анэуплоидных клеток с плоидностью 5с и более и отсутствии лекарственного патоморфоза или проявлении признаков анаплазии опухоли в мазках-отпечатках при первоначально стандартном типе цитограммы опухоли Вильмса предполагают неблагоприятный прогноз заболевания.