АППАРАТ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ Российский патент 2004 года по МПК C12M1/04 C12M3/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а конкретно к аппаратам для культивирования клеток и вирусов человека или животных в суспензии и/или на микроносителях, и может быть использовано при изготовлении вакцин и других биологических объектов.

Известен аппарат [1], в котором аэрирование с целью насыщения культуральной питательной среды осуществляется путем подачи воздушно-газовой смеси над поверхностью среды. Однако для удовлетворения потребности растущих клеток в кислороде при достаточной их концентрации в таком аппарате необходимо активное перемешивание среды, в результате чего значительная часть клеток в суспензии может быть травмирована и погибает. В случае культивирования клеток на микроносителях активное перемешивание создает высокий гидродинамический сдвиг, превышающий силы адгезии клеток на микроносителях, в результате чего клетки отделяются от поверхности микроносителей ("сползают"), прекращают деление и гибнут.

Известен также аппарат [2] для суспензионного культивирования клеток тканей или микроорганизмов, содержащий цилиндрическую емкость с крышкой и патрубками для подвода и отвода газа и устройство для аэрации и перемешивания среды. Устройство для аэрации и перемешивания содержит горизонтальное лопастное кольцо, укрепленное на вертикальном приводном валу, размещенное в верхней части емкости непосредственно под крышкой, и расположенную под ним кольцевую пластину с центральным отверстием для отвода газа, прикрепленную по периферии к стенке емкости с образованием кольцевой полости вокруг колеса для подвода и отвода газа. В кольцевой перегородке выполнены щелевые отверстия для прохода газа, расположенные равномерно по окружности под наклоном к горизонтальной плоскости. Патрубок для подвода газа установлен в крышке соосно лопастному колесу, а патрубок для отвода газа подключен к указанной кольцевой полости и размещен на краю крышки.

Недостатком этого аппарата является то, что формирование ассиметричного вихревого движения жидкости (потенциальный вихрь с осевым противотоком) в таком аппарате достигается при высоких скоростях движения газа (свыше 15-18 м/с) над поверхностью этой жидкости, т.е. связано с большими энергозатратами. При этом происходит захват капель жидкости с поверхности суспензии клеток с последующим выбросом их на стенку емкости. Клетки в каплях жидкости травмируются от удара о стенку аппарата, т.е. имеет место массовая гибель клеток. При снижении скорости движения газа до 6-8 м/с над поверхностью суспензии клеток наблюдается неустойчивое течение жидкости, т.е. периодическая смена режима ассиметричного вихревого движения жидкости на режим автоколебания жидкости, при котором возникает бегущая вдоль стенки емкости волна. Поверхность жидкости искривляется и представляет собой ассиметричный параболоид вращения. Вся жидкость в аппарате колеблется как единое целое, раскачивая весь аппарат, что неблагоприятно сказывается на процессе культивирования клеток. Кроме того, конструкция аппарата позволяет культивировать клетки при высоте заполнения емкости, равной или менее одного диаметра этой емкости. Если высота заполнения емкости суспензией клеток более одного диаметра этой емкости, то у дна ее образуется застойная зона. При культивировании клетки неизбежно оседают в эту зону и гибнут от недостатка кислорода.

Ближайшим аналогом [3] заявляемого аппарата является биореактор для культивирования клеток на микроносителях, включающий корпус, снабженный крышкой, технологическими патрубками и теплообменной рубашкой, установленное в корпусе перемешивающее устройство и барботер, размещенный внутри сетчатой цилиндрической емкости для аэрации питательной среды в ней. Насыщение кислородом питательной среды культивирования производят через разделительные мембраны.

Недостатком такого аппарата для культивирования является быстрое оседание клеток (в том числе и на микроносителях) на поверхности мембраны (сетки) и закупоривание пор (ячеек) мембраны (сетки), что не позволяет в дальнейшем эффективно поддерживать необходимую концентрацию растворенного кислорода в культуральной питательной среде и соответственно размножение клеток и вирусов.

Технический результат предлагаемого аппарата для культивирования биологических объектов заключается в увеличении выхода клеток, вирусов и продуктов клеточного синтеза, а также в обеспечении наиболее приемлемых гидродинамических условий процесса, исключающих формирование зон застоя и оседания клеток и/или микроносителей с клетками, в обеспечении благоприятных условий массообмена в аппарате, исключающих ограничение использования аппарата как по объему заполнения емкости, так и по степени чувствительности клеток к насыщению среды кислородом и травмированию.

Этот результат достигается тем, что в заявляемом аппарате для культивирования биологических объектов, содержащем корпус, снабженный крышкой, технологическими патрубками и термостатирующей рубашкой, установленное в корпусе перемешивающее устройство и барботер, размещенный внутри сетчатой цилиндрической емкости для аэрации питательной среды в ней, указанная емкость установлена по оси корпуса с возможностью вращения одновременно с валом перемешивающего устройства и служит для отделения объема корпуса с биологическими объектами от объема аэрации питательной среды, при этом снаружи емкости с зазорами и внутри нее укреплены вертикальные пластины разной высоты для циркуляции суспензии и предотвращения забивания отверстий сетки емкости биологическими объектами.

Изобретение поясняется чертежами, на которых на фиг.1 схематично изображен продольный разрез аппарата; на фиг.2 - разрез по сечению А-А.

Аппарат состоит из корпуса 1 из нержавеющей стали с днищем и термостатирующей рубашкой 2, охлаждаемой водой и нагреваемой паром, которые подают через патрубки 3 и 4 и сливают через патрубок 5 крышки 6, на которой смонтированы патрубки для загрузки 7 и выгрузки компонентов питательной среды и культуральной жидкости 8, пробоотборника 9, патрубков для ввода датчиков температуры 10, порциального давления растворенного в среде кислорода (рО₂) 11, рН 12, окислительно-восстановительного потенциала (еН) 13, смонтированного на крышке и установленного в корпусе перемешивающего устройства с магнитным приводом 14 и барбатером для аэрации культуральной жидкости 15, размещенном внутри сетчатой цилиндрической емкости 16, установленной по оси корпуса с возможностью вращения одновременно с валом перемешивающего устройства, прикрепленной плотно без зазора в своей нижней части к валу втулкой с болтом 17, которая отделяет объем корпуса с культуральной средой от объема аэрации питательной среды, снаружи и внутри сетчатой цилиндрической емкости укреплены вертикальные пластины разной высоты 18, 19 на всю длину и ³/₄ длины цилиндра, угол наклона и величину зазора между пластинами и сеткой регулируют за счет крепления болт-гайками 20 (фиг.2) для обеспечения циркуляции суспензии и предотвращения забивания отверстий сетки биологическим материалом (микроносители, компоненты питательной среды, клетки).

Аппарат работает следующим образом.

Для проведения культивирования биологических объектов (например, клеток животных) в суспензии и на микроносителях с корпуса 1 аппарата снимают крышку 6 и на вал перемешивающего устройства 14 устанавливают механический пеногаситель (на схеме не показан) и сетчатую цилиндрическую емкость 16 с размерами ячеек 25-50 мкм для культивирования клеток в суспензии, или 130-180 мкм для культивирования на микроносителях, или другими размерами в зависимости от вида биологических объектов с наружными 18 и внутренними вертикальными пластинами 19 на всю длину и ³/₄ длины сетчатой цилиндрической емкости, в которую вводят барботер 15.

Сетчатую цилиндрическую емкость 16 в нижней части плотно без зазора крепят к валу перемешивающего устройства 14 посредством втулки с болтом 17. Перед установкой сетчатой цилиндрической емкости на вал перемешивающего устройства регулируют угол наклона и угол зазора внешних пластин 18 между пластинами и сеткой за счет крепления болт-гайкой 20.

После окончания монтажа одевают крышку, заполняют аппарат питательной средой и производят засев через штуцер 7, подсоединяют датчики параметров и двигатель привода перемешивающего устройства 14 к пульту автоматического управления (на схеме не показан), подключают к барботеру 15 сжатый воздух или смесь газов и устанавливают расход газа на аэрацию в зависимости от требуемого значения рО₂, включают мешалку и проводят культивирование.

Для взятия проб на биологический анализ в процессе культивирования используют пробоотборник 9. По завершении культивирования проводят слив культуральной жидкости через патрубок 8 для дальнейшей обработки.

Конструкция предлагаемой системы аэрации и перемешивания в процессе культивирования клеток и вирусов или других биологических объектов позволяет реализовать нестационарный процесс перемешивания среды, обеспечивающий приближенные к оптимальным гидродинамические условия, условия массообмена, что обеспечивает уменьшение продолжительности производственного процесса и производства биологических препаратов, повышает производительность процесса, снижает себестоимость продукта. Предлагаемый аппарат для культивирования биологических объектов обеспечивает максимальный выход клеточной массы как в суспензии, так и на микроносителях, соответственно максимальное накопление клеточных метаболитов, продуктов клеточного синтеза (вирусного материала, биологически активных веществ, моно- или поликлональных антител) и т.д. Эффект достигается, во-первых, за счет возможности обеспечить оптимальную концентрацию растворенного кислорода на любом этапе культивирования, во-вторых, в результате создания благоприятных условий перемешивания культуральной среды, при которых исключается или минимизируется травмирование клеток в суспензии и на микроносителях, соответственно гибель клеток в суспензии или отделение клеток с поверхности микроносителей и последующая гибель клеток.

При использовании предлагаемого аппарата для культивирования биологических объектов эффективность культивирования повышается.

Предлагаемый аппарат использовали при отработке технологии вакцины против болезни Марека на основе культивирования клеток перепелиных эмбрионов на микроносителях. За один технологический цикл в аппарате объемом 0,025 м³ можно получить до 1,8 млн доз вакцины, что в несколько раз выше по сравнению с использованием других аппаратов. Предлагаемый аппарат для культивирования биологических объектов позволяет обеспечить оптимальное насыщение культуральной питательной среды растворенным кислородом, массообмен необходимой интенсивности, приемлемые для клеток в суспензии или на микроносителях условия перемешивания, максимально исключающие травмирование клеток, что, в свою очередь, позволяет культивировать первичные клетки тканей или органов, клетки перевиваемых линий, гибридные и гибридомные клетки, чувствительные к механическому повреждению и имеющие различную потребность в кислороде, получать более высокие концентрации любых типов клеток. Аппарат легко масштабируется от 0,005 до 0,25 м³, причем в большем масштабе соотношение объема среды культивирования клеток и изолированного объема аэрирования питательной среды более эффективно. Заявляемый аппарат может широко использоваться в биологической, медицинской и пищевой промышленности.

Источники информации
1. Биотехнология клеток животных. /Под ред. Р.Е.Спиера и Дж.Гриффитса. - М.: ВО "Агропромиздат", 1989, стр.294. Л.Л.Ван Везель. Системы выращивания в монослое: гомогенные процессы в единичном оборудовании.

2. Аппарат для суспензионного культивирования клеток тканей или микроорганизмов WO 92/05245 А1, С 12 М 1/04, 02.04.1992.

3. Биореактор для культивирования клеток на микроносителях. Максимов М. Г. , Попов Ю.А., Хохлов А.М., Швяков А.А., Шишков М.И. Патент RU 2050415 C1, 6 C 12 М 3/00 от 20.12.1995 - прототип.

Изобретение относится к биотехнологии, а конкретно к аппаратам для культивирования клеток и вирусов человека или животных в суспензии и/или на микроносителях, и может быть использовано при изготовлении вакцин и других биологических препаратов. Аппарат для культивирования биологических объектов содержит корпус, снабженный крышкой, технологическими патрубками и термостатирующей рубашкой, установленное в корпусе перемешивающее устройство и барботер, размещенный внутри сетчатой цилиндрической емкости для аэрации питательной среды в ней. Указанная емкость установлена по оси корпуса с возможностью вращения одновременно с перемешивающим устройством и служит для отделения объема корпуса с биологическими объектами от зоны аэрации питательной среды. Снаружи емкости с зазорами и внутри нее укреплены вертикальные пластины разной высоты для циркуляции суспензии и предотвращения забивания отверстий сетки емкости биологическими объектами. Изобретение обеспечивает увеличение выхода клеток, вирусов и продуктов клеточного синтеза путем улучшения гидродинамических условий процесса и массообмена в аппарате. 2 ил.

Аппарат для культивирования биологических объектов, содержащий корпус, снабженный крышкой, технологическими патрубками и термостатирующей рубашкой, установленное в корпусе перемешивающее устройство и барботер, размещенный внутри сетчатой цилиндрической емкости для аэрации питательной среды в ней, отличающийся тем, что сетчатая цилиндрическая емкость установлена по оси корпуса с возможностью вращения одновременно с валом перемешивающего устройства и служит для отделения объема корпуса с биологическими объектами от объема аэрации питательной среды, при этом снаружи емкости с зазорами и внутри нее укреплены вертикальные пластины разной высоты для циркуляции суспензии и предотвращения забивания отверстий сетки емкости биологическими объектами.