БИОРЕАКТОР ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК НА МИКРОНОСИТЕЛЯХ Российский патент 1995 года по МПК C12M3/00 

Изобретение относится к аппаратуре для культивирования клеток животных и человека и может быть использовано в биологии, медицине, животноводстве.

Известен биореактор (Gelli Gen проспект фирмы New Brunswick Scientific CO), содержащий корпус с крышкой, перемешивающее устройство, рабочие штуцеры, систему жизнеобеспечения и контроля, перемешивающее устройство, выполненное в виде турбины с плосколопастными или винтовыми мешалками. При перемешивании питательного раствора с клетками такими мешалками клетки ударяются о вращающиеся части и травмируются. Кроме того, степень перемешивания питательной среды с клетками в вертикальном направлении этими устройствами мала, что приводит к неравномерной концентрации питательных продуктов по высоте и ухудшает условия культивирования. Носители, находящиеся в жидкой фазе, с иммобилизованными в них клетками вводят в биореактор с помощью шприца или микропипетки через одно из отверстий в крышке. Процесс этот малопроизводителен и может привести к нарушению стерильности среды. Кроме того, газовая смесь в таком устройстве подается через трубку непосредственно в питательную среду с находящимися в ней клетками, что ограничивает скорость подачи газа и не может обеспечить высокий коэффициент К_LA.

Наиболее близким к заявляемому решению является биореактор (Gellе Gen проспект фирмы Nen Brunswick Scientific CO), содержащий корпус с крышкой и рабочими штуцерами, систему жизнеобеспечения и контроля, центробежное перемешивающее устройство, устройство для пеногашения.

Наличие центробежного перемешивающего устройства обеспечивает интенсивное вертикальное перемешивание питательной среды. Газ подается в объем, заполненный питательной средой, но изолированный от основного объема с клетками сетчатой стенкой. С изолированным объемом связано пеногасящее устройство. Такая конструкция позволяет производить интенсивное насыщение газовой смесью питательной среды и иметь высокий К_LA.

Однако отсутствие автоматического каплеобразующего устройства, встроенного в биореактор, не позволит произвести заполнение биореактора носителями с иммобилизованными в них клетками за короткое время (1.2 мин), что важно для идентичного развития всех клеток. Кроме того, диаметр капель носителя, превращающихся при соприкосновении со средой в твердые гранулы, не может быть меньше 2.3 мм, в то время как для интенсивного питания клеток этот диаметр должен быть 0,5.1 мм.

Другим недостатком этого устройства является возможность травмирования клеток в суспензии или на носителях из-за эффекта "терки" вследствие соприкосновения с сетчатой стенкой, вращающейся со сравнительно большой окружной скоростью. Кроме того, наличие стреловидных трубок (импеллеров), выступающих за цилиндрическую поверхность центробежного перемешивающего устройства, из-за значительной круговой скорости перемешивающего устройства может способствовать травмированию клеток.

И, наконец, при периодическом насыщении среды газовой смесью в момент, когда значение давления в аэрационной трубке равно нулю, среда через отверстия попадает в трубку. При подаче в аэратор газа под давлением среда вытесняется из трубки, вызывая при этом интенсивное пенообразование.

Целью изобретения является повышение производительности труда при введении носителей с клетками в питательную среду, при одновременном уменьшении травматизма клеток в процессе выращивания и уменьшение степени пенообразования.

Это достигается тем, что биореактор для культивирования клеток на микроносителях, содержих блок управления, источник сжатого газа, корпус с термостатирующим устройством и магнитным приводом, крышку, на которой установлены датчики параметров жизнеобеспечения, пробоотборное устройство, конденсатор, а также смонтировано перемешивающее устройство, имеющее форму пустотелого цилиндра, закрепленного на полом валу, на котором установлены устройство пеногашения и система газообмена, изолированная от основного объема сетчатой стенкой, согласно предложенному изобретению снабжен герметично установленным на крышке каплеобразующим устройством, содержащим корпус с днищем и рабочими штуцерами, внутри которого расположена горизонтальная перегородка, делящая внутреннюю полость корпуса на две изолированные части, газопроводящей трубкой, соединяющей нижнюю часть корпуса с источником сжатого газа, и микропипетками, каждая из которых герметично установлена в горизонтальной перегородке и свободно с зазором проходит через днище устройства, соединяя верхнюю часть корпуса устройства с внутренней полостью биореактора.

Электропневмопреобразователь блока управления для регулирования подачи газовой смеси в среду культивирования связан с атмосферой посредством регулируемого пневмодросселя, соединенного пневматически с полостью электропневмодросселя, в которой размещен электромагнит, а система газообмена образована четырьмя цилиндрами, каждый из которых имеет сетчатую стенку, расположенными внутри перемешивающего устройства, в верхней части которого выполнено цилиндрическое утолщение, снабженное отверстиями, соединенными с полостью перемешивающего устройства касательно.

Оснащение биореактора каплеобразующим устройством, корпус которого герметично закреплен на крышке реактора, позволяет сохранить стерильность в процессе работы при введении носителей с клетками в питательную среду. Конструкция каплеобразующего устройства дает возможность получить минимальный диаметр эжектируемых капель до 0,5 мм, что важно для интенсивного питания клеток. С помощью такого устройства можно вводить суспензию клеток с носителями с частотой до 80.100 капель/с, при диаметре капли 0,5 мм из одной микропипетки, т. е. практически одновременно вводится необходимая доза суспензии, что важно для идентичного развития клеток.

Подача газовой смеси в реактор осуществляется через электропневмопреобразователь, который соединен с регулируемым пневмодросселем. Это позволяет подавать газ импульсно, не снижая при этом нижний уровень давления газа до нуля. Газ, находящийся в барботажных трубках при минимальном давлении, не дает попасть питательному раствору внутрь трубки через ее барботажные отверстия, что снижает степень пенообразования при подаче верхнего значения давления газовой смеси. То, что газ из барботажных трубок попадает сначала в изолированный от носителей с клетками объем, образованный цилиндрами с сетчатой стенкой, дает возможность значительно увеличивать давление подаваемого газа. Газ растворяется в питательной среде, лишенной клеток, и среда легко проходит через сетку.

Конструкция предлагаемой мешалки такова, что, обеспечивая равномерное разбрасывание клеток по всему корпусу, она позволяет уменьшить травматизм клеток за счет отсутствия резко выступающих деталей конструкции.

Уменьшению травматизма клеток способствует и то, что сетчатые цилиндры газообмена размещены во внутренней полости мешалки. Проходя в этой полости, клетки двигаются с меньшей примерно в 2 раза круговой скоростью, чем снаружи, следовательно, клетки меньше "трутся" о сетку и меньше травмируются.

На фиг. 1 изображена конструкция биореактора для культивирования клеток на микроносителях; на фиг. 2 сечение А-А на фиг. 1, сечение верхней части мешалки.

Устройство состоит из следующих основных частей:
электронного блока 1 управления, стеклянного корпуса 2, крышки 3.

Электронный блок управления содержит магнитный привод 4, стойку с термостатирующим устройством (нагревателем) 5, устройство (систему) 6 для периодической подачи газовой смеси, содержащее электропневмопреобразователь 7, регулируемый пневмодроссель 8 и источник 9 сжатого газа. Через штуцер 10, установленный на крышке 3, сжатый газ через систему 6 по- дачи газа попадает в корпус 2.

На крышке 3 установлены конденсатор 11, датчики 12 параметров жизнеобеспечения (рН, РО₂, t,^оС), пробоотборное устройство 13, каплеобразующее устройство 14, сферический подшипник 15 с валом, на котором смонтировано перемешивающее устройство 16 с системой 17 газообмена и устройство 18 пеногашения, и штуцер 19 для подачи и забора питательной среды.

Каплеобразующее устройство 14 содержит корпус 20 с днищем и термостатирующей рубашкой 21, охлаждаемой водой, которую подают перистальтическим насосом (не показан), микропипетки 22, выполненные из полипропилена с оттянутыми кончиками до внутреннего диаметра 0,15 мм, горизонтальную перегородку 23, которая делит корпус 20 на две части нижнюю 24 для прохода газа и верхнюю 25 для смеси носителей с клетками, газоподающую трубку 26, сосуд 27 со смесью и рабочие штуцеры 28 и 29.

Каждая микропипетка 22 установлена без зазора в горизонтальной перегородке и проходит через отверстие в днище корпуса, причем для каждой микропипетки в соответствующем отверстии днища предусмотрен зазор 0,5.0,6 мм.

Перемешивающее устройство 16 состоит из фторопластового корпуса 30 с вклеенными магнитами 31. В верхней части корпуса 30 выполнены отверстия 32 (фиг. 2), которые соединены с внутренней полостью 33 корпуса 30 по касательной. С корпусом 30 перемешивающего устройства 16 соединено пеногасящее устройство 18.

Система 17 газообмена содержит канал 34 для подачи газа, камеру 35 для распределения газа, каналы 36 для подачи газа в барботажные трубки 37, заключенные в цилиндры 38 с сетчатой стенкой, каналы 39 для отвода истощенного газа.

Биореактор работает следующим образом.

Стеклянный корпус 2 через штуцеры 19 заполняют питательной средой. Включают электронный блок управления. Вращение магнитного привода 4 передается перемешивающему устройству 16 через магниты 31. Включается термостатирующее устройство (нагреватель) 5.

В стеклянном корпусе 2 устанавливается температура питательной среды 37^оС.

Верхняя полость 25 каплеобразующего устройства 14 заполняется жидкой смесью носителей с клетками из сосуда 27 со смесью через штуцер 28.

Термостатирующая рубашка 21 поддерживает температуру смеси в корпусе 10. 15^оС с помощью циркуляции воды, подаваемой перистальтическим насосом (на фиг. 1 не показано). Через штуцер 29 и газоподающую трубку 26 от источника сжатого газа (на фиг. 2 не показано) в импульсном режиме газ подают в нижнюю часть 24 корпуса 20.

Заполнив верхнюю часть 25 корпуса, жидкая смесь попадает в микропипетки, образуя на оттянутых кончиках капли, которые эжектируются газом, проходящим в зазоры между пипеткой и днищем корпуса 20. При соприкосновении с питательной средой при температуре 37^оС капля носителей с клетками затвердевают, образуя твердые гранулы, что защищает клетки от травмирования в процессе культивирования.

Для обогащения питательной среды газ от источника 9 сжатого газа через систему 6 для периодической подачи газа и штуцер 10 подают в систему 17 газообмена. При этом газ через канал 34 для подачи газа попадает в камеру 35 для распределения газа, откуда через каналы 36 распределится по четырем барботажным трубкам 37, через отверстия в которых выходит в питательную среду. Также барботажные трубки 37 изолированы от основного объема цилиндрами 38 с сетчатой стенкой, внутри которых образуется аэрационная полость, лишенная клеток с носителями, газ растворяется в среде, которая легко проходит через сетку, чтобы среда не попадала в барботажные трубки 37, давление газа при периодической подаче газа не снижается до нуля. Это происходит за счет того, что электропневмопреобразователь 7 системы 6 для подачи газа связан с атмосферой посредством регулируемого пневмодросселя 8, соединенного пневматически с полостью электропневмопреобразователя 7, в которой размещен электромагнит. Регулировкой пневмодросселя 8 устанавливают минимальное давление газа в системе 6 подачи газа. Истощенный газ по каналам 39 поступает в устройство 18 пеногашения, жестко установленное на перемешивающем устройстве 16. В устройстве 18 пеногашения пена "схлопывается" при соприкосновении с сеткой устройства, переходя в жидкое состояние.

Вращение перемешивающего устройства 16 вызывает подъем питательной среды, в которой находятся носители с клетками, снизу, по внутренней полости 33 корпуса 30, вверх и выброс через верхние отверстия 32. Подъем происходит за счет небольшого перепада давления во внутренней полости 33, создаваемого вращением четырех отверстий 32. Подъем и выброс через отверстия питательной среды образуют непрерывный циркуляционный контур. Такое движение осуществляет равномерное разбрасывание клеток по всему рабочему объему биореактора и их перемещение не только в горизонтальных, но и вертикальных плоскостях.

Продукты испарения из биореактора переходят в конденсатор 11, где, охлаждаясь, конденсируются и возвращаются уже в жидкой фазе в стеклянный корпус 2. Этот процесс уменьшает потери при испарении среды. Контроль за насыщением газом питательной среды с клетками проводят датчиками 12 параметров жизнеобеспечения.

Использование: культивирование клеток животных и человека в суспензиях на микроносителях. Сущность изобретения: биореактор содержит корпус с магнитным приводом и перемешивающим устройством в виде пустотелого цилиндра, при этом биореактор снабжен герметично установленным на крышке каплеобразующим устройством, содержащим корпус, внутри которого расположена горизонтальная перегородка, разделяющая полость корпуса на две части. Нижняя часть корпуса соединена трубкой с источником сжатого газа. В указанной перегородке герметично установлены микропипетки, при этом биореактор также снабжен электропневмопреобразователем блока управления для регулирования подачи газа в среду, связанным с атмосферой через пневмодроссель. Система газообмена образована четырьмя цилиндрами с сетчатыми стенками, и цилиндры расположены внутри перемешивающего устройства, в верхней части которого выполнено утолщение с отвертиями, сообщенными с полостью перемешивающего устройства по касательной. 2 ил.

БИОРЕАКТОР ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК НА МИКРОНОСИТЕЛЯХ, содержащий блок управления, источник сжатого газа, корпус с термостатирующим устройством и магнитным приводом, крышку, на которой установлены датчики параметров жизнеобеспечения, пробоотборное устройство, конденсатор и перемешивающее устройство в виде пустотелого цилиндра, закрепленного на полом валу с установленными на нем устройствами пеногашения и системой газообмена, изолированной от основного объема сетчатой стенкой, отличающийся тем, что биореактор снабжен герметично установленным на крышке каплеобразующим устройством, содержащим корпус с днищем и рабочими штуцерами, внутри которого расположена горизонтальная перегородка, разделяющая внутреннюю полость корпуса на две изолированные части, газопроводящей трубкой, соединяющей нижнюю часть корпуса с источником сжатого газа, и микропипетками, каждая из которых герметично установлена в указанной горизонтальной перегородке с возможностью свободного с зазором прохода через днище устройства для каплеобразования и соединения верхней части корпуса устройства с внутренней полостью биореактора, при этом биореактор также снабжен электропневмопреобразователем блока управления для регулирования подачи газовой смеси в среду культивирования, связанным с атмосферой посредством пневмодросселя, соединенного пневматически с полостью электропневмопреобразователя, в которой размещен электромагнит, а система газообмена образована четырьмя цилиндрами, каждый из которых имеет сетчатую стенку, причем цилиндры расположены внутри перемешивающего устройства, в верхней части которого выполнено цилиндрическое утолщение с отверстиями, сообщенными с полостью перемешивающего устройства по касательной.