ПАСТА, ПРИГОДНАЯ ДЛЯ ТРАФАРЕТНОЙ ПЕЧАТИ, ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОРИСТОЙ ПОЛИМЕРНОЙ МЕМБРАНЫ ДЛЯ БИОСЕНСОРА Российский патент 2004 года по МПК B01D71/10 B01D71/16 B01D69/12 B01D69/14 

Данное изобретение касается пасты, пригодной для трафаретной печати, для получения пористой полимерной мембраны, которая может быть использована в электрохимических сенсорах, особенно в электрохимических биосенсорах, предпочтительно для интегральной подготовки проб цельной крови.

Биосенсоры уже находят применение в большом количестве диагностических методов, например при определении концентрации различных веществ в потоках жидкостей организма, таких как кровь. При этом стремятся к созданию сенсоров, которые не требуют больших затрат крови при обработке пробы, а уже посредством одного нанесения жидкости организма на тестовую полоску дают быстрый результат. При этом протекает специфическая биохимическая реакция, как, например, ферментативное превращение определенных компонентов, вызывающая затем перенос электронов между различными электродами (рабочим электродом и электродом сравнения), который может быть количественно определен.

Недостатком большинства известных электрохимических биосенсоров является то, что при нанесении крови на предусмотренную для этого область тестовой полосы на протекающую биохимическую реакцию оказывают влияние другие содержащиеся в крови компоненты, прежде всего красные кровяные тельца (эритроциты). Так, например, при высоких значениях гематокрита или гематокритного числа (т.е. объемной доле эритроцитов в общем количестве крови в об. %) с помощью традиционных сенсоров глюкозы в крови измеренное значение содержания глюкозы ниже фактического значения. Этот недостаток возникает от того, что эритроциты посредством адсорбции на реакционном слое биосенсора влияют на диффузию глюкозы в него и к электродам и уменьшают измерительный сигнал.

Решению этой проблемы способствуют различные мембраны, которые наносят на слой фермента тестовой полосы, расположенный на электродах, для отделения от него эритроцитов.

Так, например, в патенте US 5658444 описана отделяющая эритроциты мембрана для сенсора, которая состоит из одного нерастворимого в воде гидрофобного полимера, одного растворимого в воде гидрофильного полимера и одного агента агрегации эритроцитов и которую получают посредством напыления на поверхность тестовой полосы.

Недостатком этой мембраны является то, что диаметр пор мембраны изменяется в зависимости от расстояния распыления и давления напыления. Кроме того, напыление мембраны при изготовлении тестовой полосы является дополнительной операцией, которая отличается от получения обычной тестовой полосы и связана с дополнительными затратами, что усложняет и тем самым удорожает производственный процесс.

Поэтому задачей данного изобретения было разработать пасту для получения пористой мембраны, не имеющую названных недостатков, с тем, чтобы она экономически выгодно могла быть нанесена во время процесса получения биосенсора с помощью способа, включаемого в обычный ход процесса, и предоставить мембрану с постоянным и равномерным размером пор.

Эта задача решается посредством пасты для пористой полимерной мембраны согласно пункту 1. Предпочтительные формы выполнения приведены в пунктах 2-18.

Ниже изобретение поясняется с помощью чертежей, где
на фигуре 1 схематически показана структура тестовой полосы с мембраной согласно изобретению;
на фигуре 2 показана реологическая характеристика пасты согласно изобретению;
на фигуре 3а показана фотография в электронном микроскопе полимерной мембраны с недостаточно развитой структурой пор;
на фигуре 3b показана фотография в электронном микроскопе полимерной мембраны согласно изобретению с хорошо развитой структурой пор;
на фигуре 4 показаны сравнительные результаты измерений двух биосенсоров при увеличении значений гематокрита, причем один из них снабжен мембраной согласно изобретению;
на фигурах 5а - 5d показаны сравнительные клинические показания четырех сенсоров глюкозы в крови.

На фигуре 1 представлена структура тестовой полосы с полимерной мембраной согласно изобретению. На полиэфирном материале-носителе 1 располагаются электроды 2 в форме слоя углерода, который, со своей стороны, частично покрыт изоляцией 3. Слой фермента и медиатора 4 расположен в области электродного слоя, освобожденного от изоляции. В случае сенсора глюкозы в крови этот слой содержит, например, фермент глюкозооксидазу и медиатор Fe³⁺. Полимерная мембрана 5 согласно изобретению расположена над слоем фермента и медиатора 4. В целом все покрыто слоем клея 6 и защитной пленкой 7.

При массовом изготовлении биосенсоров для печатания различных слоев, таких как слой электродов, изоляции и ферментов, используют способ трафаретной печати. Данное изобретение представляет мембрану, которая может быть нанесена с помощью той же технологии. С одной стороны, это имеет преимущество, поскольку при печатании мембраны и тем самым в течение всего процесса получения сенсора может быть использовано одно и то же устройство, что при массовом производстве дает огромные экономические преимущества. С другой стороны, с помощью трафаретной печати можно воспроизводимо получать мембрану с одинаковой плотностью и размером пор, что не обеспечивается другими методами, такими как нанесение прядением, погружение или напыление.

Для того чтобы пасту, используемую для получения полимерной мембраны, можно было нанести посредством трафаретной печати, растворитель или растворители полимера, содержащиеся в ней, должны характеризоваться возможно более высокой температурой кипения (выше 100^oС), чтобы избежать преждевременного высыхания материала в печатной машине. Кроме того, паста содержит вещество, не растворяющее полимер, которое действует как порообразователь и характеризуется более высокой температурой кипения, чем используемый или используемые растворители.

Кроме того, паста должна обладать подходящей вязкостью (30000-50000 сП) (cpi), чтобы обеспечивать равномерное течение через сетку (трафарет) во время печатания. Предпочтительно вязкость пасты уменьшается при воздействии сдвиговых усилий, как показывает реологическая характеристика на фигуре 2.

В качестве полимера в пасте согласно изобретению предпочтительно используют ацетат целлюлозы (50 кДа). Он содержится в пасте, пригодной для трафаретной печати, предпочтительно в количестве около 8 вес.%. Кроме того, в качестве другого полимера может содержаться нитрат целлюлозы в количестве вплоть до 10 вес.%.

В качестве растворителя полимера могут быть использованы, например, 1,4-диоксан (температура кипения 102^oС) и/или 4-гидроксиметилпентанон (температура кипения 165^oС). Предпочтительная композиция содержит 0-20 вес. %, предпочтительно 20 вес.% 1,4-диоксана и 0-70 вес.%, предпочтительно 56 вес.% 4-гидроксиметилпентанона, причем 4-гидроксиметилпентанон альтернативно может быть заменен этилацетатом или диацетатом этиленгликоля.

Было установлено, что в качестве порообразователя пасты, пригодной для трафаретной печати и используемой в качестве мембраны, пригодны длинноцепочечные спирты с температурой кипения >150^oС; предпочтительно используют н-октанол, характеризующийся температурой кипения 196^oС, и/или 2-метил-2,4-пентандиол (МПД) или (MPD), характеризующийся температурой кипения 197^oС.

При использовании 2-метил-2,4-пентандиола (МПД) в качестве порообразователя паста является несколько менее восприимчивой по отношению к испарению диоксана. Также ацетат целлюлозы дольше остается в растворе, благодаря чему удлиняется период времени, в который паста остается в пригодном для печати состоянии. Это удлиненное "потенциальное время" (от нем.) "Potzeit" делает возможным производство больших партий с одинаковым качеством.

Доля порообразователя должна составлять 5-20 вес.%, предпочтительно 12-15 вес.%.

В качестве модификатора вязкости используют, например, гидрофильные кремниевые ксерогели или эквивалентные им плавленый кварц ("Fumed Silicas", бентонитовый клей, натрозол или сажу. Они должны добавляться к пасте, пригодной для трафаретной печати, в количестве от 1 до 10 вес.%. Предпочтительно используют гидрофильные Cab-O-Sile (торговое название кремниевых ксерогелей, реализуемых предприятием Cabot), такие как Cab-O-Sil М5, Cab-O-Sil Н5, Cab-O-Sil LM150, Cab-O-Sil LM130, в количестве 4 вес.%.

Кроме того, к пасте согласно изобретению могут быть добавлены другие добавки, такие как Tween 20, Triton X, Silvet 7600 или 7280, лаурилсульфат (SDS), другие детергенты, а также полиолы, такие как глицерин, или гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон (ПВП или PVP) или сополимер винилпирролидона и винилацетата (ПВП/ВА или PVP/VA).

Добавление одной или нескольких таких добавок является не обязательным для получения мембраны; однако было показано, что они улучшают смачивание мембраны и могут ускорять ответ сенсора. Предпочтительно в пасте, пригодной для трафаретной печати, используют ПВП/ВА или ПВП в количестве 0,1 вес.%.

Кроме того, добавка аддитивных биотергов (Bioterge), полиэтиленимина, БСА (BSA), декстрана, дициклогексилфталата, желатины, сахарозы и/или биурета улучшает разделение эритроцитов и плазмы.

К тому же, непосредственно к пасте из ацетата целлюлозы можно добавлять фермент, например глюкозооксидазу, так что в процессе получения биосенсора печатание слоя фермента можно исключить.

После нанесения равномерного слоя пасты, пригодной для трафаретной печати, на пригодный субстрат в процессе сушки образуется мембрана. При этом образуется пористый слой, а не закрытая пленка, так как используемые растворители обладают более низкой температурой кипения, чем порообразователь; соответственно, растворители испаряются быстро, и полимер ацетата целлюлозы высаживается на оставшуюся пленку порообразователя.

Однако для биосенсора не может быть использована произвольная повышенная температура, так как при высоких температурах используемые ферменты/протеины денатурируются. Для биосенсора для определения глюкозы в цельной крови лучших результатов достигали при температуре сушки около 70^oС. Соответственно должны выбираться температуры кипения используемых растворителей и порообразователей.

Решающим фактором для порообразования является используемый модификатор вязкости, который вместе с порообразователем образует гель, чтобы стабилизировать структуру полимера. У используемых веществ гель возникает посредством взаимодействия между ОН-группами кремниевого ксерогеля и длинноцепочечного спирта (например, октанола). Количество и распределение геля, возникающего во время процесса сушки, в конце концов, является решающим для размера и формы образующихся пор.

Без добавления модификатора вязкости из растворителя и порообразователя образуется эмульсия, так как один порообразователь не в состоянии стабилизировать полимерный скелет. В результате получают белую, гладкую и неструктурированную пленку с заключенным в ней порообразователем, в которой не происходит латерального, т.е. поперечного перемещения жидкости. Сравнимо с этим получают прозрачную пленку, если в пасте не используют порообразователь.

При использовании малых количеств модификатора вязкости (< 1 вес.%) получают мембрану лишь с недостаточно развитой структурой пор, как это приведено на фигуре 3а.

Так как разные пригодные модификаторы вязкости характеризуются различными поверхностными свойствами, модификатор вязкости может быть выбран в зависимости от желаемой мембраны или желаемого биосенсора. Например, Cab-O-Sil Н5 "растирают" при высокой механической нагрузке, например, при длительном времени печати или при печатании очень тонких слоев с высоким давлением ракли. В этом случае поверхность имеет микроскопические тонкие канты или грани, которые могут приводить к электролитическому разрушению (утрате) красных кровяных телец.

Для сенсора сахара в крови это является нежелательным свойством, так как вследствие этого повышается основной ток сенсора. С другой стороны, этот эффект можно оптимизировать, и плазма телец непосредственно в сенсоре используется для электрохимического обнаружения. Практическим примером было бы определение гемоглобина в эритроцитах. В этом случае медиатор биосенсора, например гексацианоферрат(III) калия, реагирует с Fe(II)-группой гемоглобина, вследствие чего образуется гексацианоферрат(II) калия, который может быть определен непосредственно на электроде биосенсора. Фермент, как и в случае определения глюкозы, здесь не является необходимым, так как медиатор реагирует непосредственно с гемоглобином. На практике так можно проводить определение значения гематокрита пациента похожим измерительным прибором, как и при контроле сахара в крови, благодаря чему экономятся затраты времени на использование капилляров и центрифуги.

Cab-O-Sil LM150 состоит из более мелких частиц, чем Н5, которые поэтому являются более устойчивыми и не повреждаются посредством механических воздействий в процессе печати. Поэтому этот модификатор вязкости лучше всего пригоден для получения мембраны для сенсоров сахара в крови.

Соответственно, в вышеупомянутом варианте воплощения наряду со стабилизацией полимерной цепи с помощью модификатора вязкости имеет значение разница между температурами кипения растворителя и порообразователя для образования пригодной мембраны. При этом разница должна составлять около 30^oС, чтобы в процессе сушки образовалась пленка, содержащая достаточно высокую концентрацию порообразователя, на которую может высадиться (выпасть) полимер мембраны. При незначительной разнице температур кипения порообразователь начинает испаряться прежде, чем достигается критическое соотношение между растворителем и порообразователем, вызывающее осаждение полимера мембраны.

После печатания пригодной для трафаретной печати пасты описанного ранее состава и испарения растворителя посредством осаждения сложного эфира целлюлозы образуется мембрана со средним размером пор от 0,1 до 2 мкм, причем используемое количество длинноцепочечного спирта может оказывать влияние на размер пор. Фотография мембраны в электронном микроскопе представлена на фигуре 3b. Так как эритроциты характеризуются средним размером от 8 до 10 мкм, с помощью мембраны они удерживаются вдали от слоя фермента, в то время как плазма может проходить беспрепятственно. Дополнительно мембрана способствует механической стабильности слоя фермента и препятствует тому, что фермент при нанесении пробы крови отслаивается от электрода и затем больше не может принимать участие в электрохимической реакции.

На фигуре 4 посредством ряда измерений показано, что при постоянной концентрации глюкозы тестовая полоса, снабженная мембраной согласно изобретению, в противоположность тестовой полосе без мембраны при повышении значения гематокрита дает постоянные результаты, в то время как у тестовой полосы без мембраны при возрастающей концентрации эритроцитов результат снижается. Благодаря повышенному диффузионному барьеру между слоем фермента и пробой крови результат у сенсора с мембраной в целом несколько снижен.

Изобретение поясняется с помощью следующих примеров.

Получение пасты для печати.

Соответственно количественным соотношениям, приведенным в следующих примерах, получают смесь из растворителя (например, гидроксиметилпентанона, диоксана) и порообразователя (например, октанола, МПД) и обеспечивают равномерное распределение обоих веществ. На следующей стадии вводят (присоединяют) все добавки (например, ПВП/ВА) и, если необходимо, растворяют с помощью ультразвука. Затем полимер мембраны (ацетат целлюлозы, 50 кДа) непрерывно смешивают с (примешивают к) полученным прежде растворителем до возникновения равномерной суспензии. Эту суспензию 48 часов вращают (размешивают) в закрытой емкости до возникновения прозрачного геля, к которому может быть добавлен модификатор вязкости (например, Cab-O-Sil). Готовую пасту для печати вращают (размешивают) еще 24 часа, чтобы обеспечить равномерное распределение модификатора вязкости.

Пример 1.

Полимер(ы):
Ацетат целлюлозы (М.в. 30000) - 7,5 вес.%
Растворитель:
Диацетат этиленгликоля (Т.кип. 186^oС) - 65,5 вес.%
Порообразователь:
Н-деканол (Т.кип. 231^oС) - 25,0 вес.%
Модификатор вязкости:
Cab-O-Sil М5 - 2,0 вес.%
Пример 2.

Полимер(ы):
Ацетат целлюлозы (М.в. 50000) - 8,0 вес.%
Растворители:
1,4-диоксан (Т.кип. 102^oС) - 35,0 вес.%
Этилацетат (Т.кип. 154^oС) - 35,0 вес.%
Порообразователь:
Н-октанол (Т.кип. 196^oС) - 18,0 вес.%
Модификатор вязкости:
Cab-O-Sil М5 - 4,0 вес.%
Пример 3.

Полимер(ы):
Ацетат целлюлозы (М.в. 50000) - 8,0 вес.%
Растворители:
1,4-диоксан (Т.кип. 102^oС) - 20,0 вес.%
4-гидроксиметилпентанон (Т.кип. 165^oС) - 55,9 вес.%
Порообразователь:
Н-октанол (Т.кип. 196^oС) - 12,0 вес.%
Модификатор вязкости:
Cab-O-Sil М5 - 4,0 вес.%
Добавка:
ПВП/ВА - 0,1 вес.%
Пример 4.

Полимер(ы):
Ацетат целлюлозы (М.в. 50000) - 7,4 вес.%
Растворители:
1,4-диоксан (Т.кип. 102^oС) - 18,5 вес.%
4-гидроксиметилпентанон (Т.кип. 165^oС) - 55,5 вес.%
Порообразователь:
2-метил-2,4-пентандиол - 14,8 вес.%
Модификатор вязкости:
Cab-O-Sil М5 - 3,7 вес.%
Добавка:
ПВП/ВА - 0,1 вес.%
На фигуре 5 показаны клинические показания сенсоров глюкозы в крови:
a) без полимерной мембраны;
b) с полимерной мембраной (композиция согласно примеру 2);
c) с полимерной мембраной (композиция согласно примеру 3);
d) с полимерной мембраной (композиция согласно примеру 4).

Для сравнения клинических исследований сопоставляли результаты измерения различных типов сенсоров с результатами измерений метода сравнения (YSI Model 2300 Stat Plus) и наносили процентное отклонение в зависимости от значений гематокрита отдельных проб крови. В идеальном случае получалась прямая измерений, горизонтальная по отношению к оси х. Наклон этих прямых, который приведен в таблице (см. в конце описания), разъясняется посредством интерференции гематокрита используемой сенсорной системы.

Данные позволяют отчетливо видеть превосходные характеристики сенсорной системы с предпочтительной мембраной (композиция согласно примеру 4). Это улучшение достигается посредством разделения цельной крови и плазмы непосредственно перед электродами, так как диффузионный слой Нернста перед электродами больше не распространен в области, содержащей эритроциты, и поэтому также не может больше оказывать влияние посредством различных значений гематокрита.

В следующих сравнительных примерах описаны пасты для печати, у которых не наблюдается пригодного соответствия между порообразователем, растворителями и модификатором вязкости.

Сравнительный пример 1.

Полимер(ы):
Ацетат целлюлозы (М.в. 50000) - 8,0 вес.%
Растворитель:
Диацетат этиленгликоля (Т.кип. 186^oС) - 75,9 вес.%
Порообразователь:
Н-октанол (Т.кип. 196^oС) - 12,0 вес.%
Модификатор вязкости:
Cab-O-Sil М5 (гидрофильный) - 4,0 вес.%
Добавка:
ПВП/ВА - 0,1 вес.%
Сравнительный пример 2.

Полимер(ы):
Ацетат целлюлозы (М.в. 50000) - 8,0 вес.%
Растворители:
1,4-диоксан (Т.кип. 102^oС) - 20,0 вес.%
4-гидроксиметилпентанон (Т.кип. 165^oС) - 55,9 вес.%
Порообразователь:
Н-октанол (Т.кип. 196^oС) - 12,0 вес.%
Модификатор вязкости:
Cab-O-Sil TS720 (гидрофобный) - 4,0 вес.%
Добавка:
ПВП/ВА - 0,1 вес.%
Сравнительный пример 3.

Полимер(ы):
Ацетатпропионат целлюлозы (М.в. 75000) - 8,0 вес.%
Растворители:
1,4-диоксан (Т.кип. 102^oС) - 20,0 вес.%
4-гидроксиметилпентанон (Т.кип. 165^oС) - 55,9 вес.%
Порообразователь:
Н-октанол (Т.кип. 196^oС) - 12,0 вес.%
Модификатор вязкости:
Cab-O-Sil М5 (гидрофильный) - 4,0 вес.%
Добавка:
ПВП/ВА - 0,1 вес.%
В сравнительном примере 1 из-за незначительной разницы температуры кипения растворителя (диацетата этиленгликоля) и порообразователя (н-октанола), используемых в пасте для печати, не образуется пористая мембрана. Напротив, если в качестве порообразователя используют н-деканол (как описано в примере 1), после процесса сушки получают пористую мембрану, так как разница между температурой кипения растворителя и порообразователя достаточно велика.

В сравнительном примере 2 вследствие использования гидрофобного Cab-O-Sil, который не в состоянии реагировать с ОН-группами порообразователя, имеет место лишь незначительное гелеобразование между порообразователем и модификатором вязкости, и поэтому нет достаточной стабилизации полимерной цепи. Это препятствует образованию пористой мембраны.

Также в сравнительном примере 3, где используемый полимер (ацетатпропионат целлюлозы) характеризуется высокой растворимостью в порообразователе, пористая мембрана не образуется.

Изобретение относится к пасте, пригодной для трафаретной печати, для получения пористой полимерной мембраны, которая может быть использована в электрохимических сенсорах, особенно в биосенсорах, предпочтительно для интегральной подготовки проб цельной крови. Паста для мембраны содержит по меньшей мере один полимер, один или несколько растворителей с температурой кипения больше 100^oС, один или несколько порообразователей, имеющих более высокую температуру кипения, чем растворитель, и один гидрофильный модификатор вязкости. Способ получения пасты включает получение смеси одного или нескольких растворителей и одного или несколько порообразователей, после чего подмешивают полимер до возникновения равномерной суспензии, затем суспензию вращают до возникновения прозрачного геля. После этого добавляют гидрофильный модификатор вязкости и вращают до равномерного распределения модификатора. Мембрана получается из вышеуказанной пасты. Изобретение позволяет получить пасту экономически выгодным способом и получить мембрану с постоянным и равномерным размером пор. С помощью мембраны можно более точно измерить содержание глюкозы в крови. 3 с. и 14 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 ил.

1. Паста, пригодная для трафаретной печати, для получения пористой полимерной мембраны, содержащая по меньшей мере один полимер, один или несколько растворителей полимера с температурой кипения >100°С, один или несколько порообразователей для полимера, имеющий(х) более высокую температуру кипения, чем растворитель(и), и один гидрофильный модификатор вязкости.2. Паста по п.1, отличающаяся тем, что разница в температурах кипения растворителя и порообразователя составляет по меньшей мере 30°С.3. Паста по п.1 или 2, отличающаяся тем, что в качестве полимера паста содержит ацетат целлюлозы.4. Паста по п.3, отличающаяся тем, что в качестве растворителя паста содержит 1,4-диоксан, и/или 4-гидроксиметилпентанон, и/или этилацетат.5. Паста по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что в качестве порообразователя паста содержит длинноцепочечный спирт.6. Паста по п.5, отличающаяся тем, что в качестве порообразователя паста содержит н-октанол и/или 2-метил-2,4-пентандиол.7. Паста по п.6, отличающаяся тем, что содержание н-октанола и/или 2-метил-2,4-пентандиола составляет 5-20 вес.%.8. Паста по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что в качестве модификатора вязкости паста содержит гидрофильный кремниевый ксерогель.9. Паста по п.8, отличающаяся тем, что содержание кремниевого ксерогеля составляет 1-10 вес.%.10. Паста по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что паста дополнительно содержит сополимер винилпирролидона и винилацетата и/или поливинилпирролидон.11. Паста по п.10, отличающаяся тем, что содержание сополимера винилпирролидона и винилацетата или поливинилпирролидона составляет 0,1 вес.%.12. Паста по любому из пп.1-11, отличающаяся тем, что паста дополнительно содержит один или несколько ферментов.13. Способ получения пасты, пригодной для трафаретной печати, в котором получают смесь из одного или нескольких растворителей полимера и одного или нескольких порообразователей для полимера, подмешивают полимер до возникновения равномерной суспензии, суспензию вращают до возникновения прозрачного геля, добавляют гидрофильный модификатор вязкости и в целом вращают до равномерного распределения модификатора вязкости, причем указанный(е) растворитель(и) имеет(ют) температуру кипения >100°С, а указанный(е) порообразователь(и) имеет(ют) солее высокую температуру кипения, чем указанный(е) растворитель(и).14. Пористая полимерная мембрана, полученная из пасты, пригодной для трафаретной печати, по любому из пп.1-12.15. Мембрана по п.14, отличающаяся тем, что приспособлена для использования в тестовой полоске биосенсора.16. Мембрана по п.15, отличающаяся тем, что указанный биосенсор предназначен для измерения концентрации глюкозы в крови.17. Мембрана по п.15, отличающаяся тем, что указанный биосенсор предназначен для определения значения гематокрита.