БИОСЕНСОР ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ И ЛАКТАТА В КРОВИ Российский патент 2019 года по МПК G01N33/50 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к электроаналитическим системам анализа и может быть использовано в медицинских диагностических центрах или машинах скорой помощи для определения концентраций глюкозы и лактата в разбавленной крови, а также сыворотке и плазме крови.

Уровень техники

Из уровня техники известны технические решения, обеспечивающие определение глюкозы или лактата.

Известно решение, представленное в статье [A. Karyakin, Е.A. et. al. Anal. Chem. 74 (2002) 1597], позволяющее с высокой чувствительностью и точностью определять концентрацию глюкозы в различных объектах. Для создания биосенсоров на глюкозу используются стеклоуглеродные электроды, модифицированные электрохимическим способом пленкой берлинской лазури (БЛ), поверх которой нанесена ферментсодержащая мембрана нафиона. Проточно-инжекционная система на основе биосенсора обладает следующими характеристиками: коэффициент чувствительности 50 мМ/Мсм², нижний предел определяемых концентраций 0,1 мкМ. Система позволяет проводить определение глюкозы в разбавленной крови с минимальной пробоподготовкой.

Из диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук [Прибиль М.М. Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. Москва. 2015] известно решение, позволяющее с высокой точностью определять лактат, в котором для создания биосенсоров использованы фермент-содержащие мембраны на основе геля силоксана, нанесенные на планарные электроды, модифицированные пленкой БЛ.

Однако ни одно из этих решений не позволяет проводить одновременное определение лактата и глюкозы в одной пробе. Кроме того, использованные в первом из решений стеклоуглеродные электроды и электрохимический способ синтеза БЛ не подходят для промышленного производства биосенсоров.

Из уровня техники известны также способы одновременного определения глюкозы и лактата.

Из статьи [J. Wang, М.Р. Chatrathi, G.E. Collins Anal. Chimica Acta 585 (2007) 11] известно решение, позволяющее проводить одновременное определение глюкозы и лактата в разбавленных образцах крови и сыворотки крови. Для проведения анализа использовали микрочипы, в которых совмещали электрофоретическое разделение глюкозы и лактата на колонке с последующим протеканием реакций с соответствующими ферментами и амперометрическим измерением полученных концентраций. Но такой способ требует использования сложного оборудования для разделения аналитов, а также обладает недостаточно высокими показателями чувствительности (5,1 мкА/М и 5,3 мкА/М для определения глюкозы и лактата, соответственно) и нижнего предела определяемых концентраций (30 мкМ для глюкозы и 45 мкМ для лактата), что не позволяет использовать разведение больше, чем в 20 раз (и сократить, таким образом, объем требуемого для анализа образца).

Из статьи [L.V. Shkotova, N.Y. Piechniakova et. al. Food Chemistry 197 (2016) 972] известен способ одновременного определения глюкозы и лактата в вине. Для определения аналитов использовали амперометрический мультибиосенсор с использованием тонких золотых пленок в качестве трансдьюсера и ферментов глюкозооксидазы (ГОД) и лактатоксидазы (ЛОД), «пришитых» к поверхности электрода химической связью. Датчик обладал следующими аналитическими характеристиками: коэффициент чувствительности 58,4 мМ/Мсм² и 37,1 мМ/Мсм² для глюкозы и лактата, соответственно; диапазон определяемых содержаний (ДОС) 5-800 мкМ и 5-1000 мкМ для глюкозы и лактата, соответственно. Однако не показана применимость данной системы для анализа крови, кроме того, результаты измерения изложенным в результате методом и методом сравнения в некоторых случаях отличаются в два раза.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению является электроаналитическая система, раскрытая в публикации [Н. Kanso, M.B.G. et. al. Electroanalysis 29 (2017) 87]. Для совместного определения глюкозы и лактата в вине использовали электроаналитическую систему со встроенным биосенсором, в качестве трансдьюсера использовали БЛ, в качестве биораспознающего элемента - ферменты целлобиозодегидрогеназу и лактатоксидазу. Конструкция системы представляла собой тонкослойную ячейку (толщина 0,4 мм) шириной 5 мм и протяженностью 50 мм, объемом 100 мкл, в нижней части которой находился планарный четырехэлектродный биосенсор на керамической основе, а по краям располагались вход и выход из ячейки диаметром 5 мм. При этом два рабочих электрода (площадью 2 мм²), выполненные из углерода, располагались посередине между входом и выходом у боковой поверхности ячейки, электрод сравнения (площадью 2 мм²), выполненный из серебра, располагается между рабочими электродами, а электрод сравнения (площадью 10 мм²), выполненный из углерода, является протяженным и располагается у боковой поверхности ячейки напротив трех других электродов, при этом центр ячейки остается свободным. Ввод аналита осуществлялся через встроенный инжекционный порт, находящийся непосредственно на входе в ячейку. Но такая конструкция обладает рядом недостатков. Во-первых, площадь вспомогательного электрода больше, чем суммарная площадь рабочих электродов, всего в 2,5 раза, а расстояние между вспомогательным и рабочими электродами в два раза больше, чем между рабочими электродами и электродом сравнения, что может приводить к протеканию тока между рабочими электродами и электродом сравнения и поляризации последнего. Во-вторых, объем ячейки составляет 100 мкл, а система инжекции предусматривает вкалывание аналита в поток движущегося фонового раствора через микрошприц, что может приводить к размытию фронта аналита и его разбавлению фоновым раствором, степень которого зависит от скорости ввода аналита и скорости потока фонового раствора. Для получения воспроизводимого результата, независимого от этих параметров, объем вводимого образца должен значительно превышать объем ячейки, что некритично в случае с анализом вина (для которого применяли данное решение), но является одним из важнейших критериев при анализе крови. В-третьих, пленка берлинской лазури, использованная в данной системе в качестве трансдьюсера, отличается невысокими характеристиками: большое расстояние между анодным и катодным пиками (130 мВ) на циклической вольтамперограмме свидетельствует о замедленном процессе переноса электронов, а большая полуширина анодного пика (150 мВ) свидетельствует о неравномерности покрытия. Все это приводит к недостаточно низкому пределу обнаружения (50 мкМ) сенсора на пероксид водорода, и к невысоким аналитическим характеристикам биосенсоров на его основе: коэффициенты чувствительности 0,51 мМ/Мсм² и 1,64 мМ/Мсм² для глюкозы и лактата, соответственно; ДОС 0,5-5 мМ для глюкозы и 0,25-5 мМ для лактата. Так как определяемое содержание глюкозы в крови составляет 0,5-30 мМ, лактата - 0,5-25 мМ, а стандартное разбавление образца крови - в 50 раз, то биосенсор для анализа крови должен обладать ДОС 0,01-1 мМ для глюкозы и 0,01-0,5 мМ для лактата, что система, представленная в данном примере, обеспечить не может. Авторы использовали данную систему в анализе вин.

Раскрытие изобретения

Технической проблемой заявленного изобретения является необходимость создания экспрессного биосенсора, обеспечивающего возможность одновременного определения глюкозы и лактата, а также точного и недорогого измерительного блока на его основе, подходящего для проведения рутинных анализов крови (определения концентраций глюкозы и лактата) в медицинских диагностических лабораториях.

Технический результат изобретения заключается в повышении аналитических характеристик биосенсора и измерительного блока на его основе, в частности, достигаемый технический результат заключается в повышении чувствительности биосенсора и обеспечении возможности более точного одновременного определения глюкозы и лактата в образце за счет исключения их взаимного влияния при одновременном определении. Технический результат заявляемого изобретения также заключается в повышения точности анализа крови с использованием заявляемого биосенсора в составе электроаналитической системы, за счет исключения систематической погрешности, которая, как правило, присутствует при измерении известными анализаторами.

Известные анализаторы при определении концентрации глюкозы и лактата используют реакцию электроокисления пероксида водорода - продукта ферментативных реакций, катализируемых ГОД и ЛОД, - что требует использования высоких потенциалов (+ 0,4 - 0,6 В относительно хлорид-серебряного электрода сравнения (ХСЭ), в дальнейшем все потенциалы приводятся относительно ХСЭ). Это приводит к завышению отклика анализатора (на 5%) за счет присутствия в образцах крови заранее неизвестного количества восстановителей (урат, аскорбат, парацетамол и др.), которые также окисляются при этом потенциале.

Технический результат достигается за счет использования при проведении анализа реакции электровосстановления пероксида водорода, селективно катализируемой БЛ и протекающей при относительно низком потенциале (- 0,05 - 0,05 В), при котором окисления присутствующих в крови восстановителей не происходит.

Поставленная задача решается тем, что планарный биосенсор для определения глюкозы и лактата в жидкой пробе включает размещенные на подложке хлоридсеребряный электрод сравнения, два рабочих электрода и вспомогательный электрод, размещенный между рабочими электродами. При этом на один из рабочих электродов нанесена пленка БЛ и мембрана, содержащая фермент - ГОД, а на второй рабочий электрод нанесена пленка БЛ и мембрана, содержащая фермент - ЛОД, электрод сравнения расположен на одинаковом расстоянии от рабочих электродов с обеспечением возможности задания постоянного нулевого потенциала на рабочих электродах, а вспомогательный электрод имеет площадь, превышающую суммарную площадь рабочих электродов, для уменьшения влияния протекающих на вспомогательном электроде процессов на измеряемый сигнал; при этом все электроды выполнены с возможностью подключения к потенциостату, а электрод с мембраной, содержащей ГОД, расположен перед электродом с мембраной, содержащей ЛОД, по ходу движения жидкой пробы. Пленка БЛ может иметь толщину 60-80 нм, поликристаллическую структуру, и покрывает поверхность рабочего электрода сплошным однородным слоем.

Мембрана, содержащая фермент - ЛОД, получена из мембранообразующей смеси с концентрацией у-аминопропилтриэтоксисилана 0,1-3 _об. %, ЛОД - 1 мг/мл и воды - 10 _об. % в изопропиловом спирте, а мембрана, содержащая фермент - ГОД получена из мембранообразующей смеси с концентрацией перфторсульфонированного полимера (ПФС) 0,1-1,5 _об. %, ГОД - 1,5 мг/мл и воды - 15 _об. % в изопропиловом спирте. Рабочие электроды выполнены диаметром 0,8-1 мм. Рабочие электроды расположены на расстоянии от электрода сравнения не более 2 мм. Заявляемый биосенсор может быть изготовлен методом трафаретной печати и может иметь толщину 0,22-0,35 мм. Электрод сравнения выполнен протяженным от одного рабочего электрода до другого шириной не менее 0,5 мм. Поставленная задача также решается тем, что блок для измерения глюкозы и лактата в растворе он включает герметично соединенные между собой нижнюю и верхнюю части, между которыми закреплен биосенсор, выполненный по п. 1, при этом между биосенсором и верхней частью измерительного блока сформирована тонкослойная объемная ячейка толщиной менее 0,3 мм, имеющая основание в форме овала с утолщением вдоль длинного диаметра овала в виде протяженного капилляра шириной менее 1 мм и толщиной менее 0,3 мм, проходящим через все электроды биосенсора, при этом капилляр имеет вход, расположенный со стороны рабочего, электрода с мембраной, содержащей глюкозооксидазу, и выход - со стороны рабочего электрода с мембраной, содержащей лактатоксидазу, при этом вход и выход соединены с каналами подвода и отвода жидкой пробы или фонового буферного раствора.

Тонкослойная ячейка может быть снабжена по периметру уплотнительным элементом, обеспечивающим герметизацию биосенсора.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами, где

на фиг. 1 представлена схема биосенсора для совместного определения глюкозы и лактата,

на фиг. 2 представлена схема действия сенсорного материала,

на фиг. 3 - чувствительность определения глюкозы для рабочего электрода с пленкой, содержащей ГОД, и различными концентрациями перфторсульфонированного полимера в мембранообразующей смеси,

на фиг. 4 - чувствительность определения лактата для рабочего электрода с пленкой, содержащей ЛОД, и различными концентрациями γ-аминопропилтриэтоксисилана в мембранообразующей смеси,

на фиг. 5 - верхняя часть измерительного блока с отверстиями повода и отвода жидкой пробы,

на фиг. 6 - градуировочные зависимости для заявляемого биосенсора,

на фиг. 7 - зависимость чувствительности и времени отклика от скорости потока фонового буферного электролита,

на фиг. 8 - влияние эквимолярных добавок лактата на определение глюкозы при обратном положении,

на фиг. 9 - влияние эквимолярных добавок лактата на определение глюкозы при прямом положении,

на фиг. 10 - влияние эквимолярных добавок глюкозы на определение лактата при обратном положении и

на фиг. 11 - влияние эквимолярных добавок глюкозы на определение лактата при прямом положении.

Позициями на фигурах обозначены:

1 - первый рабочий электрод (с пленкой БЛ и мембраной, содержащей ГОД),

2 - вспомогательный электрод,

3 - электрод сравнения,

4 - фотоотверждаемый изолятор, ограничивающий рабочие электроды,

5 - второй рабочий электрод (с пленкой БЛ и мембраной, содержащей ЛОД),

6 - термоотверждаемый изолятор для изоляции контактов,

7 - контакты,

8 - мембрана, содержащая фермент,

9 - пленка БЛ,

10 - поверхность рабочего электрода,

11 - выемка для герметизирующего кольца,

12 - протяженный капилляр,

13 - корпус верхней части измерительного блока,

14 - канал подвода жидкой пробы в ячейку,

15 - канал отвода жидкой пробы из ячейки,

Е - фермент (ГОД или ЛОД),

S - субстрат ферментативной реакции (глюкоза или лактат),

Р - продукт ферментативной реакции (глюконолактон или пируват).

Осуществление изобретения

Заявляемый биосенсор включает электрод сравнения, вспомогательный электрод, и два рабочих электрода, модифицированных сенсорными покрытиями, позволяющими селективно определять целевые аналиты - глюкозу и лактат. Сенсорное покрытие включает пленку электрокатализатора восстановления пероксида водорода (БЛ) и биораспознающий элемент (полимерную мембрану, содержащую фермент - ГОД или ЛОД).

На первый рабочий электрод последовательно нанесены пленка БЛ и мембрана на основе ПФС (структурного аналога нафиона), содержащая фермент - ГОД для получения сенсорного покрытия для определения глюкозы. Сплошная однородная пленка БЛ толщиной 60-80 нм нанесена по методике [Borisova A.V., Karyakina Е.Е., Cosnier S., Karyakin A.A. // Electroanalysis. 2009. Vol. 21 P. 409]. Мембрана, содержащая фермент - ГОД, получена из мембранообразующей смеси с концентрацией ПФС 0,1-1,5 _об. %, ГОД - 1,5 мг/мл и воды - 15 _об. % в изопропиловом спирте, по методике [Karyakin А.А., Е.A., Lukachova L.V., Karyakina Е.Е., Wang J. // Anal. Chem. 2002. Vol. 74. P. 1597].

На второй рабочий электрод последовательно нанесены пленка БЛ и мембрана на основе силоксана, содержащая фермент - ЛОД для получения сенсорного покрытия для определения лактата. Сплошная однородная пленка БЛ толщиной 60-80 нм нанесена по методике [Borisova A.V., Karyakina Е.Е., Cosnier S., Karyakin A.A. // Electroanalysis. 2009. Vol. 21 P. 409]. Мембрана, содержащая фермент - ЛОД, получена из мембранообразующей смеси с концентрацией γ-аминопропилтриэтоксисилана 0,1-3 _об. %, ЛОД - 1 мг/мл и воды - 10 _об. % в изопропиловом спирте, по методике [Pribil М.М., F., Andreyev E.A., Lesch A., Karyakina E.E., Voronin O.G., Girault H.H., Karyakin A.A. // J. of Electroanal. Chem. 2014. Vol. 731. P. 112].

Рабочий электрод с мембраной, содержащей ГОД, расположен перед рабочим электродом с мембраной, содержащей ЛОД, по ходу движения жидкой пробы, для избежания взаимного влияния при совместном определении глюкозы и лактата.

Электрод сравнения расположен на равном расстоянии (не более 2 мм) от рабочих электродов с обеспечением возможности задания постоянного нулевого потенциала на рабочих электродах.

Вспомогательный электрод имеет площадь, превышающую суммарную площадь рабочих электродов, для уменьшения влияния процессов, протекающих на вспомогательном электроде, на измеряемый сигнал.

Все электроды выполнены с возможностью подключения к потенциостату.

Толщина биосенсора составляет 0,22-0,35 мм.

Биосенсор закреплен между герметично соединенными между собой нижней и верхней частей измерительного блока, при этом между биосенсором и верхней частью измерительного блока сформирована тонкослойная ячейка толщиной менее 0,3 мм. Ячейка представляет собой полость в виде объемной фигуры, в основании которой находится овал, с утолщением вдоль длинного диаметра овала в виде протяженного капилляра шириной менее 1 мм и толщиной менее 0,3 мм, проходящего через все электроды биосенсора. Капилляр имеет вход, расположенный со стороны рабочего электрода с пленкой, содержащей глюкозооксидазу, и выход - со стороны рабочего электрода с пленкой, содержащей лактатоксидазу, при этом вход и выход соединены с каналами подвода и отвода жидкой пробы или фонового буферного раствора. Тонкослойная ячейка снабжена по периметру уплотнительным элементом, обеспечивающим герметизацию биосенсора.

Для совместного определения глюкозы и лактата используется биосенсор на основе четырехэлектродной печатной системы (ЧПС) (фиг. 1). ЧПС изготавливается методом трафаретной печати на пластиковой основе из полиэтилентерефталата (ПЭТФ). Изготовление печатной системы включает несколько этапов: на пластиковую подложку наносят слой серебросодержащей пасты, служащей в качестве токопроводящих контактов, а также материала электрода сравнения; далее наносят слой углеродной пасты, служащей материалом вспомогательного и рабочих электродов, затем наносят слой фотоотверждаемого изолятора, отделяющего рабочие электроды от электрода сравнения и вспомогательного электрода и на последнем этапе наносят слой термоотверждаемого изолятора, закрывающего токопроводящие контакты от соприкосновения с раствором в ячейке. Способ изготовления сенсорного покрытия биосенсора включает химическую модификацию поверхности рабочих электродов пленкой БЛ с последующей иммобилизацией ферментов (ГОД или ЛОД) в полимерную мембрану на поверхности модифицированного электрода. Полимерная мембрана состоит из ПФС с включенным в него ферментом - ГОД для сенсорного покрытия для определения глюкозы или из силоксана, полученного полимеризацией γ-аминопропилтриэтоксисилана, с включенным в него ферментом - ЛОД для сенсорного покрытия для определения лактата. Принцип действия сенсорного покрытия основан на селективном электрокаталитическом восстановлении пероксида водорода, выделяющегося в процессе катализируемой ферментом (ГОД или ЛОД) реакции, на поверхности электрода с нанесенной пленкой БЛ (фиг. 2). Мембрана, содержащая фермент - ГОД, получена путем нанесения капли мембранообразующей смеси, содержащей ПФС с концентрацией 0,1-1,5 _об. % (фиг. 3), ГОД - 1,5 мг/мл и воду - 15 _об. % в изопропиловом спирте, на поверхность рабочего электрода и последующего высушивания при температуре 4°С в течение 1 часа. Мембрана, содержащая фермент - ЛОД, получена путем нанесения капли мембранообразующей смеси, содержащей γ-аминопропилтриэтоксисилан с концентрацией 0,1-3,0 _об. % (фиг. 4), ЛОД - 1,0 мг/мл и воду - 10 _об. % в изопропиловом спирте, на поверхность рабочего электрода и последующего высушивания при температуре 4°С в течение 1 часа.

Биосенсор встроен в тонкослойную ячейку (ТЯ), вырезанную в измерительном блоке и ограниченную резиновым кольцом для обеспечения герметичности (фиг. 5). Через всю длину ТЯ проходит протяженный капилляр таким образом, что поток жидкости протекает через все 4 электрода биосенсора. ТЯ при помощи системы тонких шлангов соединяется с насосом, обеспечивающим постоянный поток фонового буферного раствора через систему. Непосредственно перед ячейкой в систему шлангов встроен шестиходовой инжектор для ввода пробы. Биосенсор посредством коннектора подсоединен к бипотенциостату, который используется для обеспечения постоянного потенциала и измерения тока в системе и имеет возможность передачи данных на персональный компьютер. Аналитический сигнал биосенсора регистрируется методом амперометрии при приложении потенциала 0 В (относительно хлорид-серебряного электрода сравнения, в дальнейшем - ХСЭ) по увеличению тока в присутствии аналита(ов) - глюкозы и лактата.

Определение концентраций глюкозы и лактата осуществляется следующим образом:

- На первом этапе через электроаналитическую систему, включающую заявляемый измерительный блок на основе заявляемого биосенсора, пропускают фоновый буферный раствор (50 мМ КН₂РО₄/К₂НРО₄, 0,1 М KCl, pH 6.0), одновременно измеряя ток на обоих рабочих электродах при потенциале 0 мВ относительно внутреннего хлорид-серебряного электрода сравнения. Данный этап заканчивается установлением постоянного фонового тока на обоих рабочих электродах.

- На втором этапе в петлю инжектора (в закрытом положении) вводится анализируемый раствор (объем петли инжектора 50 мкл, объем образца - 300 мкл, избыток образца выливается через слив петли). После этого инжектор устанавливают в открытое положение и часть введенного образца из петли (50 мкл) по системе шлангов поступает в тонкослойную ячейку. При этом бипотенциостат измеряет изменение катодного тока на рабочих электродах, выражающееся в появлении пиков на экспериментальных кривых зависимостей тока от времени. Высота пиков пропорциональна концентрации аналитов в исследуемом растворе. После измерения образец вымывается из ячейки фоновым буферным раствором через слив ячейки.

- Этапы 1 и 2 повторяют для ряда модельных растворов с концентрациями аналитов 1 мкМ - 1 мМ. Каждую концентрацию необходимо определить, по меньшей мере, три раза. По результатам измерений строится градуировочная зависимость. Далее в качестве анализируемого раствора используют образцы крови (разбавленные фоновым буферным раствором в 100 раз). Концентрацию глюкозы и лактата в образцах крови находят по построенной ранее градуировочной зависимости. После проведения 100 измерений разбавленных образцов крови построение градуировочной зависимости требуется повторить.

Сенсорные материалы, биосенсор на их основе, измерительный блок и электроаналитическая система позволяют селективно различать сигнал, обусловленный присутствием аналитов (глюкозы и лактата) в образце крови на фоне всех прочих компонентов образца. Коэффициент чувствительности биосенсора составляет более 20 мА⋅М^-1⋅см^-2 при определении глюкозы и более 85 мА⋅M^-1⋅см^-2 - для лактата; ДОС - от 5 до 1000 мкМ при определении глюкозы и от 1 до 500 мкМ - для лактата (фиг. 6). Электроаналитическая система обладает высокой воспроизводимостью (систематическая погрешность не превышает 3%), операционной стабильностью (свыше 600 измерений без необходимости перекалибровки при определении концентрации глюкозы и свыше 100 - при определении лактата) и может работать при скоростях потока фонового буферного раствора от 0,25 до 1,75 мл/мин (фиг. 7). ДОК биосенсора полностью перекрывает диапазон физиологических концентраций глюкозы и лактата в крови как в норме, так и в патологии или при интенсивной физической нагрузке. Объем пробы крови, необходимый для измерений, составляет всего 10 мкл, что в 2 раза меньше, чем для аналогов. Время анализа для биосенсора не превышает одной минуты.

В тонкослойной ячейке размещены одновременно 2 рабочих электрода (с мембраной, содержащей ГОД и с мембраной, содержащей ЛОД). Особенностью тонкослойной ячейки, однако, является экспонирование рабочего электрода с мембраной, содержащей один фермент, расположенного ниже по течению, пероксидом водорода от «верхнего» рабочего электрода с мембраной, содержащей второй фермент. Так как рабочие электроды в ячейке расположены последовательно друг за другом, поток фонового буферного раствора направлен от одного электрода ко второму. Расположение рабочих электродов, при котором первый рабочий электрод располагается перед вторым по направлению потока, мы будем называть прямым, а расположение, при котором первый рабочий электрод расположен после второго - обратным.

Исследовано взаимное влияние лактата и глюкозы на отклики рабочих электродов с мембранами, содержащими фермент, при совместном определении глюкозы и лактата в одной ТЯ. Для этого готовили модельные растворы, содержащие смесь эквимолярных концентраций глюкозы и лактата, а также модельные растворы индивидуальных аналитов. Отклики рабочего электрода с мембраной, содержащей фермент, на целевой аналит сравнивали с его откликами на раствор аналита, содержащий также эквимолярную концентрацию мешающего аналита.

Заметное мешающее влияние наблюдается только для рабочего электрода с мембраной, содержащей ГОД, в обратном потоке, т.к. выделяющийся при этом на втором рабочем электроде в ферментативной реакции, катализируемой ЛОД, пероксид водорода вызывает дополнительный мешающий отклик (фиг. 8).

В прямом потоке данный эффект не наблюдается (фиг. 9). Глюкоза не оказывает мешающего влияния на определение лактата независимо от направления потока фонового буферного раствора (фиг. 10, 11). Таким образом, расположение рабочего электрода с мембраной, содержащей ГОД, перед рабочим электродом с мембраной, содержащей ЛОД, в потоке фонового буферного раствора позволяет избежать мешающего влияния аналитов при их совместном определении.

Пример 1. Проведена проверка правильности работы биосенсора путем анализа стандартизованных образцов сыворотки крови с известной концентрацией аналитов с нормальным и патологическим их содержанием.

После измерения серии откликов на образцы проводили измерение отклика на модельные растворы аналитов, при этом изменения откликов на модельные растворы после измерения образцов замечено не было. Данные по определенным концентрациям глюкозы и лактата представлены в табл. 1. Они не отличались от данных, представленных в паспорте образцов. Таким образом, разработанный мультибиосенсор может быть использован для анализа образцов разбавленной крови.

Пример 2. При помощи биосенсора определена концентрация глюкозы и лактата в разбавленных образцах крови доноров (табл. 2). Процедура пробоподготовки сводилась к разбавлению образцов крови в 100 раз фоновым буферным раствором.

Полученные результаты находятся в пределах нормы. Таким образом, технический результат заявляемого изобретения заключающийся в повышении чувствительности анализа и обеспечении возможности определения глюкозы и лактата с исключением их взаимного влияния при одновременном определении, достигается. В частности, коэффициент чувствительности увеличен относительно прототипа в 40 и в 50 раз для глюкозы и лактата, соответственно. Кроме того, достигается повышение точности анализа крови с использованием заявляемого биосенсора в составе электроаналитической системы, за счет исключения систематической погрешности, которая, как правило, присутствует при измерении известными анализаторами.

Группа изобретений относится к области определения концентраций глюкозы и лактата в разбавленной крови, а также сыворотке и плазме крови. Планарный биосенсор для определения глюкозы и лактата в жидкой пробе включает размещенные на подложке хлоридсеребряный электрод сравнения, два рабочих электрода и вспомогательный электрод, размещенный между рабочими электродами. При этом на один из рабочих электродов нанесена пленка берлинской лазури и мембрана, содержащая фермент - глюкозооксидазу, а на второй рабочий электрод нанесена пленка берлинской лазури и мембрана, содержащая фермент – лактатоксидазу. Электрод сравнения расположен на одинаковом расстоянии от рабочих электродов с обеспечением возможности задания постоянного нулевого потенциала на рабочих электродах, а вспомогательный электрод имеет площадь, превышающую суммарную площадь рабочих электродов, при этом все электроды выполнены с возможностью подключения к потенциостату, а электрод с мембраной, содержащей глюкозооксидазу, расположен перед электродом с мембраной, содержащей лактатоксидазу, по ходу движения жидкой пробы. Также раскрывается блок для измерения глюкозы и/или лактата в растворе. Группа изобретений обеспечивает повышение чувствительности биосенсора и обеспечение возможности более точного одновременного определения глюкозы и лактата в образце за счет исключения их взаимного влияния при одновременном определении. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 табл., 2 пр.

1. Планарный биосенсор для определения глюкозы и лактата в жидкой пробе, характеризующийся тем, что он включает размещенные на подложке хлоридсеребряный электрод сравнения, два рабочих электрода и вспомогательный электрод, размещенный между рабочими электродами, при этом на один из рабочих электродов нанесена пленка берлинской лазури и мембрана, содержащая фермент - глюкозооксидазу, а на второй рабочий электрод нанесена пленка берлинской лазури и мембрана, содержащая фермент - лактатоксидазу, электрод сравнения расположен на одинаковом расстоянии от рабочих электродов с обеспечением возможности задания постоянного нулевого потенциала на рабочих электродах, а вспомогательный электрод имеет площадь, превышающую суммарную площадь рабочих электродов, при этом все электроды выполнены с возможностью подключения к потенциостату, а электрод с мембраной, содержащей глюкозооксидазу, расположен перед электродом с мембраной, содержащей лактатоксидазу, по ходу движения жидкой пробы.

2. Биосенсор по п. 1, характеризующийся тем, что пленка берлинской лазури имеет поликристаллическую структуру, выполнена толщиной 60-80 нм, и покрывает поверхность рабочего электрода сплошным однородным слоем.

3. Биосенсор по п. 1, характеризующийся тем, что мембрана, содержащая фермент - лактатоксидазу, получена из мембранообразующей смеси с концентрацией γ-аминопропилтриэтоксисилана 0,1-3 _об.%, лактатоксидазы - 1 мг/мл и воды - 10 _об.% в изопропиловом спирте, а мембрана, содержащая фермент - глюкозооксидазу получена из мембранообразующей смеси с концентрацией перфторсульфонированного полимера 0,1-1,5 _об.%, глюкозоксидазы - 1,5 мг/мл и воды - 15 _об.% в изопропиловом спирте.

4. Биосенсор по п. 1, характеризующийся тем, что рабочие электроды выполнены диаметром 0,8-1 мм.

5. Биосенсор по п. 1, характеризующийся тем, что рабочие электроды расположены на расстоянии от электрода сравнения не более 2 мм.

6. Биосенсор по п. 1, характеризующийся тем, что он изготовлен методом трафаретной печати.

7. Биосенсор по п. 1, характеризующийся тем, что электрод сравнения выполнен протяженным от одного рабочего электрода до другого, шириной не менее 0,5 мм.

8. Биосенсор по п. 1, характеризующийся тем, что он имеет толщину 0,22-0,35 мм.

9. Блок для измерения глюкозы и/или лактата в растворе, характеризующийся тем, что он включает герметично соединенные между собой нижнюю и верхнюю части, между которыми закреплен биосенсор, выполненный по п. 1, при этом между биосенсором и верхней частью измерительного блока сформирована тонкослойная объемная ячейка толщиной менее 0,3 мм, имеющая основание в форме овала с утолщением вдоль длинного диаметра овала в виде протяженного капилляра шириной менее 1 мм и толщиной менее 0,3 мм, проходящим через все электроды биосенсора, при этом капилляр имеет вход, расположенный со стороны рабочего электрода с мембраной, содержащей глюкозооксидазу, и выход - со стороны рабочего электрода с мембраной, содержащей лактатоксидазу, при этом вход и выход соединены с каналами подвода и отвода жидкой пробы или фонового буферного раствора.

10. Блок по п. 9, характеризующийся тем, что тонкослойная ячейка снабжена по периметру уплотнительным элементом, обеспечивающим герметизацию биосенсора.