КАРДИОПЛЕГИЧЕСКИЙ РАСТВОР "ИНФУЗОЛ" Российский патент 2004 года по МПК A61K9/08 A61K31/47 A61K31/133 A61K31/195 A61K33/14 

Изобретение относится к области медицины и предназначено для использования при операциях на “открытом” сердце в условиях искусственного кровообращения.

Традиционно применяемые в кардиохирургии кардиоплегические растворы не полностью предотвращают метаболические и структурные изменения, развивающиеся в миокарде при ишемии и последующей реперфузии. Следствием этого является сниженное восстановление насосной функции сердца при возобновлении кровообращения, которое осложняется возникновением реперфузионных аритмий и развитием сердечной недостаточности. Поэтому разработка препаратов, способных уменьшить риск кардиохирургических вмешательств, является актуальной задачей современной молекулярной кардиологии.

В настоящее время эта задача решается введением в состав кардиоплегических растворов природных антиоксидантов, естественных метаболитов, улучшающих энергетический обмен и стабилизирующих сарколемму кардиомиоцитов, а также оптимизацией ионного состава и рН растворов [1-3]. В последние годы в различных лабораториях было обнаружено, что добавление к стандартным кардиоплегическим растворам аспарагиновой кислоты или ее солей снижает развитие ишемической и реперфузионной контрактуры и улучшает восстановление работы сердца после нормотермической или гипотермической ишемии [4]. Эти полезные эффекты связаны со способностью аспарагиновой кислоты включаться в реакции образования энергии в анаэробных и аэробных условиях и таким образом улучшать энергетическое состояние ишемизированного сердца. Результатом этого является снижение потерь АТФ и накопления АМФ в ишемическом сердце и увеличение ресинтеза адениннуклеотидов и фосфокреатина при реперфузии [5, 6]. К числу наиболее изученных антиоксидантов, используемых в магний-калиевой кристаллоидной кардиоплегии, относится маннит. Его применяют как скавенджер для снижения повреждения миокарда, вызванного образованием свободных радикалов кислорода, и для обеспечения необходимой осмолярности растворов [7, 8]. Принципиально важным показателем при разработке кардиоплегических растворов является сохранение их рН и буферной емкости. Экспериментальные работы, выполненные в ряде ведущих лабораторий, продемонстрировали перспективность использования трисамина по сравнению с применением бикарбоната натрия, гистидина или имидазола для создания буферных систем в диапазоне рН 7,1-8,0 при 10-14°С [9]. Кардиоплегические растворы с трисамином предупреждают развитие внутриклеточного ацидоза и снижают нарушения ион-транспортной функции мембран ишемизированных кардиомиоцитов [10]. К числу недостатков вышеперечисленных растворов, которые отмечены в литературе, следует отнести 1) трудности, связанные с их приготовлением; 2) нестабильность химического состава и рН при длительном хранении; 3) недостаточно эффективное восстановление сократительной и насосной функции сердца после кардиоплегии; 4) ненадежную защиту ультраструктуры кардиомиоцитов.

Наиболее близким по составу, осмолярности и рН к кардиоплегическому раствору “Инфузол” является модифицированный раствор госпиталя Св. Томаса, содержащий трисамин [11]. Он содержит эквимолярные концентрации ионов К⁺ и Mg²⁺ (16 мМ), низкую концентрацию ионов Са²⁺ (1,2 мМ), близкие к физиологическим концентрации ионов Na⁺ и Сl^- (120 мМ и 153 мМ соответственно) и трисамин (15 мМ) для обеспечения оптимальной буферной емкости. В опытах на изолированном сердце крысы, перфузируемом по методу Лангендорфа, оценивали эффективность кардиоплегической защиты сердца с помощью этого кардиоплегического раствора, используя в качестве критериев следующие показатели: 1 - показатель изоволюмической работы сердца, выраженный произведением максимального систолического давления на частоту сердечных сокращений; 2 - выведение МВ-фракции креатинкиназы в миокардиальный отток при реперфузии; 3 - содержание высокоэнергетических фосфатов и лактата в миокарде в конце реперфузии. Использование этого раствора для остановки сердца приводило к незначительному, хотя и достоверному, улучшению показателя работы сердца (на (23±4)% по сравнению с контрольным гиперкалиевым кардиоплегическим раствором, содержащим 25 мМ хлорида калия) и не снижало выведение МВ-креатинкиназы в перфузат при реперфузии. В конце реперфузии содержание АТФ, общего фонда адениннуклеотидов, фосфокреатина и лактата в сердцах, защищенных модифицированным раствором госпиталя Св. Томаса, не отличалось от контрольных значений. Эти данные показывают, что применение модифицированного раствора госпиталя Св. Томаса в качестве кардиоплегического средства недостаточно эффективно защищает функцию и метаболизм миокарда от ишемических и реперфузионных повреждений.

Несмотря на обилие экспериментальных данных, указывающих на целесообразность включения перечисленных соединений в солевые кардиоплегические растворы, оптимальное соотношение этих добавок и необходимость их одновременного использования остаются невыясненными.

Задачей настоящего изобретения является решение проблемы адекватной защиты сердца во время кардиоплегической остановки при проведении операций. Для этого нами разработан солевой кардиоплегический раствор оригинального состава “Инфузол” (Табл.1), способный существенно улучшить восстановление функции и метаболизм сердца при реперфузии после окончания искусственного кровообращения. В его состав входят компоненты, разрешенные к медицинскому применению Фармакологическим комитетом РФ.

Кардиоплегический раствор “Инфузол” представляет собой бесцветную, прозрачную стерильную жидкость, предназначенную для использования при операциях на “открытом” сердце для его остановки и локальной перфузии при пережатии проксимального отдела аорты в условиях искусственного кровообращения.

Исследования кардиопротекторных свойств раствора “Инфузол” проводили на изолированных сердцах крыс самцов линии Вистар массой 250-300 г по стандартной методике [5]. У наркотизированных уретаном животных (1,0-1,5 мг/г веса тела, в/б) извлекали сердца и помещали в охлажденный раствор Кребса на 30-40 с до полной остановки сокращений. Затем их ретроградно перфузировали через аорту в течение 10-15 мин раствором Кребса, насыщенным карбогеном (95% О₂ и 5% СО₂) рН 7,4±0,1 при 37°С при постоянном перфузионном давлении 60 мм рт.ст. После этого в левое предсердие вводили канюлю и переходили к перфузии в работающем режиме по Neely в течение 20 мин при постоянном давлении наполнения левого предсердия 15 мм рт.ст. и сопротивлении оттоку перфузата из левого желудочка 60 мм рт.ст. (исходное состояние). Далее проводили кардиоплегическую остановку при температуре 22°С в течение 5 мин одним из двух кардиоплегических растворов, контрольным или “Инфузолом” с постоянной объемной скоростью (15,0±1,0) мл/мин на 1 г влажной ткани сердца. В качестве контрольного кардиоплегического раствора использовали модифицированный раствор госпиталя Св. Томаса [11], состав которого приведен в Табл.2. После 5-минутной кардиоплегической перфузии сердца подвергали 40-минутной нормотермической тотальной ишемии. По окончании ишемии сердца реперфузировали в работающем режиме буфером Кребса 30 мин при 37°С с одновременным мониторированием физиологических показателей.

Среднее перфузионное давление в аорте, давление в полости левого желудочка регистрировали при помощи тензометрических датчиков Р50, монитора SP 1405 и регистратора SP2010 Gould Statham. Аортальный объем и коронарный поток измеряли мерным цилиндром. На основании этих показателей рассчитывали минутный и ударный объемы сердца, его работу - произведение минутного объема на среднее перфузионное давление. Интенсивность сократительной функции сердца характеризовали произведением развиваемого левым желудочком давления на частоту сердечных сокращений. Сопротивление коронарных сосудов оценивали как отношение среднего перфузионного давления к коронарному потоку.

В конце реперфузии сердца замораживали щипцами Волленбергера, охлажденными в жидком азоте. Замороженную ткань гомогенизировали в холодной 6%-ной HClO₄, белки осаждали центрифугированием, супернатанты нейтрализовали до рН 7,4 [5, 6]. Энергетическое состояние реперфузированного сердца характеризовали содержанием в безбелковых тканевых экстрактах АТФ, фосфокреатина (ФКр), креатина (Кр) и лактата, которые определяли стандартными энзиматическими и колориметрическими методами [6, 12]. Сухой вес ткани определяли взвешиванием части осадка после экстракции HClO₄ и высушивания при 110°С в течение ночи. Содержание метаболитов выражали в микромолях на 1 г сухого веса. Статистическую обработку результатов проводили с помощью двустороннего t-критерия Стъюдента.

Способ приготовления кардиоплегического раствора “Инфузол” для экспериментов на животных.

В 900 мл воды для инъекций при перемешивании при комнатной температуре растворяют в граммах: натрий хлорид - 7,08; калий хлорид - 0,30;

магний хлорид шестиводный - 2,24; кальций хлорид шестиводный - 0,26; аспарагинат калия полуводный - 2,16; аспарагинат магния четырехводный - 1,80; маннит - 3,64; трисамин - 0,61. После полного растворения веществ доводят рН раствора до 7,6 при 22°С 2 н. HCl. Общий объем раствора доводят водой для инъекций до 1000 мл. Раствор фильтруют через фильтр 0,45 мкм фирмы “Миллипор”, используя водоструйный насос. Далее его стерилизуют в автоклаве при 110°С в течение 20 мин. Приготовленный таким образом раствор сохраняет заданный рН, постоянство состава и прозрачность в течение одного года при хранении в защищенном от света месте при температуре до 10°С.

Кардиопротекторные свойства раствора “Инфузол” были изучены также на модели работающего сердца крысы по Neely в сравнении с прототипом - модифицированным кардиоплегическим раствором госпиталя Св. Томаса. Влияние кардиоплегических растворов на показатели сократительной и насосной функций сердца суммировано в Таблице 3. В исходном состоянии показатели сократительной и насосной функций сердца достоверно не отличались между исследуемыми растворами. В течение первых минут ретроградной перфузии кардиоплегическим раствором “Инфузол” наблюдалось прекращение насосной и сократительной функции сердца. Таким образом, по эффективности остановки сердца “Инфузол” не отличался от прототипа. Однако его применение значительно улучшало восстановление большинства показателей функции сердца при реперфузии. Защищенные “Инфузолом” сердца к окончанию реперфузии практически полностью восстанавливали коронарный поток до (98+3)% от исходных значений по сравнению с (77+3)% при использовании кардиоплегического раствора госпиталя Св. Томаса. Этот эффект сочетался с 2,6 раза более высоким восстановлением ударного объема, чем в случае прототипа. В группе сердец, остановленных кардиоплегическим раствором “Инфузол”, на протяжении всего периода реперфузии наблюдалось более эффективное восстановление минутного объема (см. чертеж). Это обеспечивало лучшее восстановление показателя внешней работы сердца к концу реперфузии по сравнению с этим показателем при использовании раствора сравнения. Полученные результаты указывают на более полное восстановление сократительной и насосной функций сердца после периода ишемии при его остановке кардиоплегическим раствором “Инфузол”.

Влияние кардиоплегического раствора “Инфузол” на содержание метаболитов энергетического обмена, уровень лактата в ткани сердца и целостность мембран кардиомиоцитов оценивали в конце периода тотальной нормотермической ишемии и в конце реперфузии. Эти данные приведены в Таблице 4 и сопоставлены с содержанием метаболитов в ткани сердца в исходном состоянии. По окончании периода ишемии в сердцах, остановленных кардиоплегическим раствором “Инфузол”, содержание АТФ и ФКр было достоверно выше, чем в сердцах, перфузированных кардиоплегическим раствором сравнения. Так, при использовании “Инфузола” содержание АТФ было снижено до (57,9±1,9)%, а в случае прототипа до (12,7±6,3)% от исходного. Уровень ФКр был вдвое выше в сердцах, защищенных раствором “Инфузол”, и составлял (14,9±1,5)% против (7,5+2,5)% от исходного в контроле. Под влиянием “Инфузола” накопление лактата в ткани сердца в конце ишемии было снижено в 1,5 по сравнению с прототипом. В конце реперфузии в сердцах, защищенных кардиоплегическим раствором “Инфузол”, содержание макроэргических фосфатов (АТФ и ФКр) было достоверно выше, чем при использовании контрольного кардиоплегического раствора. Так, содержание АТФ составляло (70,4±4,8)% от исходного по сравнению с (41,8±4,1)% в случае прототипа. Содержание ФКр в сердцах, получавших “Инфузол”, к концу реперфузии восстанавливалось до исходных значений и составляло (96,4±7,3)% от исходного против (76,8±5,2)% в контроле. Содержание общего креатина (ΣKp) в сердцах, защищенных кардиоплегическим раствором “Инфузол”, также было выше, чем в контрольных сердцах к окончанию реперфузии: оно составляло (85,9±5,3)% от исходного значения против (71,7±3,5)% в контроле. Уровень лактата в реперфузированном миокарде в контрольной серии к концу реперфузии был в 8 раз выше исходного. В тоже время в сердцах, остановленных кардиоплегическим раствором “Инфузол”, содержание лактата в конце реперфузии не отличалось от исходного. Таким образом, анализ метаболических показателей свидетельствует о том, что применение кардиоплегического раствора “Инфузол” обеспечивает лучшее восстановление аэробного обмена в реперфузированном миокарде после периода ишемии и способствует лучшему сохранению мембран кардиомиоцитов.

Эффективность варьирования концентраций компонентов кардиоплегического раствора “Инфузол” оценивали в отдельных сериях экспериментов. Были исследованы кардиоплегические растворы, содержащие более низкие и более высокие концентрации основных действующих веществ препарата - калий хлорида, магния хлорида шестиводного, кальций хлорида шестиводного, калия аспарагината полуводного, магния аспарагината четырехводного, маннита и трисамина. Осмолярность этих растворов поддерживали такой же, как и раствора “Инфузол”, изменением концентрации хлорида натрия. рН растворов был незменным и составлял 7,6±0,1 при 22°С. В качестве примера в Табл.5 приведены составы растворов “Инфузол-1” и “Инфузол-2”. Критериями эффективности защиты миокарда при использовании этих модифицированных растворов служили а) время прекращения электромеханической активности сердца при кардиоплегической перфузии и б) восстановление показателей функции сердца после ишемиии при последующей реперфузии.

Данные Табл.6 показывают, что снижение концентраций основных компонентов кардиоплегического раствора “Инфузол” ниже минимальных значений, указанных в Табл.1, в среднем в 3 раза увеличивает время, необходимое для полной остановки сердца, таким образом снижая эффективность кардиоплегии (“Инфузол-1”). Увеличение концентрации компонентов кардиоплегического раствора, как в случае раствора “Инфузол-2”, не влияет на время, необходимое для остановки сердца. Влияние варьирования основных действующих компонентов кардиоплегического препарата “Инфузол” на степень постишемического восстановления функции сердца крысы приведены в Табл.7.

Снижение концентраций основных действующих компонентов кардиоплегического раствора (“Инфузол-1”) приводило не только к более медленной остановке сердца, но и значительно снижало восстановление показателей сократительной и насосной функций сердца, увеличивало коронарное сопротивление и показатель диастолической упругости при реперфузии. Кардиоплегический раствор с увеличенной концентрацией компонентов (“Инфузол-2”) в еще большей степени увеличивал сопротивление коронарных сосудов и жесткость миокарда при реперфузии. Следствием этого было низкое восстановление коронарного потока (до (54±7)% от исходного уровня), минутного и ударного объемов (до (13±3)% и (15±3)% от исходных значений соответственно). Сократительная функция, оцененная произведением развиваемого левым желудочком давления на частоту сердечных сокращений, и показатель внешней работы сердца при использовании кардиоплегического раствора “Инфузол-2” восстанавливались значительно хуже, чем после кардиоплегии с прототипом или раствором “Инфузол” (Табл.3, 7). Эти результаты свидетельствуют о том, что оптимальным для функциональной защиты миокарда от ишемического и реперфузионного стресса является состав кардиоплегического раствора “Инфузол”.

Таким образом, новое кардиоплегическое средство способно улучшать функциональное и метаболическое восстановление сердца после тотальной ишемии и реперфузии по сравнению с использующимися в настоящее время препаратами.

Изобретение относится к медицине, а именно к разработке рецептур растворов, используемых при операциях на “открытом” сердце. Полиионный буферный кардиоплегический раствор имеет осмолярность (350±5) мОсм, содержит натрия хлорид, калия хлорид, кальция хлорид, магния хлорид, аспарагинат калия, аспарагинат магния, маннит, трисамин и воду для инъекций при следующем соотношении ингредиентов, мас.%: натрия хлорид - 0,63-0,77; калия хлорид - 0,027-0,033; магния хлорид шестиводный - 0,18-0,22; кальция хлорид шестиводный - 0,009-0,011; калия аспарагинат полуводный - 0,20-0,24; магния аспарагинат четырехводный - 0,17-0,19; маннит - 0,32-0,38; трисамин - 0,05-0,07; вода для инъекций - остальное, при этом рН раствора составляет 7,6±0,1 при 22°С. Состав “Инфузола” обеспечивает существенное улучшение восстановления функции и метаболизма сердца при реперфузии после окончания искусственного кровообращения. 7 табл., 1 ил.

Кардиоплегический раствор, имеющий осмолярность (350±5) мОсм и содержащий натрия хлорид, калия хлорид, кальция хлорид, магния хлорид, трисамин и воду для инъекций, отличающийся тем, что он дополнительно содержит аспарагинат калия, аспарагинат магния и маннит при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:

Натрия хлорид 0,63-0,77

Калия хлорид 0,027-0,033

Магния хлорид шестиводный 0,18-0,22

Кальция хлорид шестиводный 0,009-0,011

Калия аспарагинат полуводный 0,20-0,24

Магния аспарагинат четырехводный 0,17-0,19

Маннит 0,32-0,38

Трисамин 0,05-0,07

Вода для инъекций

при этом при 22°С рН раствора 7,6±0,1 Остальное