КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS STUTZERI № 18 И PSEUDOMONAS PUTIDA № 21, ДЕСТРУКТИРУЮЩИЙ CN И SCN ПРИ ВЫСОКИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ Российский патент 2004 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/38 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно, к защите окружающей среды, и касается биологической очистки промышленных стоков и пульп от свободных цианидов и тиоцианатов, а также их комплексов с металлами. Обезвреживание цианид- и тиоцианатсодержащих стоков золотодобывающей и ряда других отраслей промышленности является актуальной экологической проблемой.

Известны микробиологические способы очистки промышленных стоков от свободных цианидов и тиоцианатов, а также их комплексов с металлами. Известен ряд штаммов микроорганизмов, выделенных из промышленных стоков и способных деструктировать цианиды и тиоцианаты в любой форме. В частности, к цианиддеструктирующим микроорганизмам относятся Pseudomonas fluorescens NCIMB 11764 (1), Pseudomonas paucimobilis ATCC 39204 (2), Alcaligenes denitrificans (3), Fusarium oxysporum (4); к тиоцианатдеструктирующим микроорганизмам относятся Thiobacillus thiopams ТHI 115 (5), Thioalkalivibrio (ARH 1) и Thioalkalimicrobium (ALM 1) (6).

Известен консорциум бактерий, в состав которого входят бактерии рода Pseudomonas, используемый для очистки шахтных и хвостовых вод месторождения цветных и благородных металлов в Хоумстейк (США), выбранный в качестве прототипа (7).

Однако в выбранном прототипе деструкция проводилась при более низких концентрациях SCN^- - 35,0-110,0 мг/л. При деструкции высоких концентраций CN^- (до 130 мг/л) требовалось разбавление сточных вод для доведения CN^- и SCN^- до ПДК, что уменьшало скорость процесса (14 дней - деструкция неразбавленных сточных вод и затем еще 31 день - деструкция разбавленных стоков для доведения до ПДК). Отсутствие в процессе деструкции цианида и тиоцианата органического источника углерода и энергии также было причиной низких скоростей деструкции CN^- и SCN^-.

Техническая задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, состоит, учитывая химические особенности HCN, в выделении консорциума алкалотолерантных бактерий, способного эффективно деструктировать как свободные, так и связанные цианиды и тиоцианаты при их высоких концентрациях 30 мг/л и 5 г/л соответственно при рН 9,0-9,4 в присутствии органического источника углерода и энергии как в растворах, так и в пульпах. Технологический результат, получаемый в результате реализации консорциума бактерий, состоит в улучшении экологической обстановки в гальванической, коксохимической, золотодобывающей и фармацефтической промышленностях. Консорциум содержит бактерии Pseudomonas stutzeri и Pseudomonas putida штаммы №18 и №21 соответственно. Консорциум штаммов бактерий выделен путем длительной селекции большого числа штаммов (около 100), выделенных из различных образцов антропогенного загрязнения на средах, содержащих цианиды и тиоцианаты. Каждый из них является активным в деструкции цианида и тиоцианата в концентрациях 5-30 мг/л и 0,1-4 г/л соответственно, обладает цианидрезистентным дыханием. На средах, содержащих цианид и тиоцианат, деструкция проходит в 2 этапа: вначале деструктируется цианид, при этом преобладает штамм №21-Ps. putida, затем происходит деструкция тиоцианата - преобладает в составе консорциума штамм №18-Ps. stutzeri. Система является устойчивой при длительных ферментациях, в том числе и в нестерильных услових.

Консорциум может поддерживаться и вноситься в среду, как бинарная равнокомпонентная система, так и отдельно (вносится в равных долях по объему).

Штаммы Pseudomonas stutzeri №18 и Pseudomonas putida №21 хранятся в лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов Института микробиологии РАН.

Штамм Pseudomonas stutzeri №18 имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки.

Клетки палочковидные, подвижные, правильной формы с закругленными концами. Величина клеток 0,5 - 0,7х3,8 - 4,0 мкм. Монотрих. Спор не образует. Имеет капсулу. Полиморфизм отсутствует. Размножается делением. Грамотрицательны. Культуральные признаки.

На мясопептонном агаре и синтетических средах образует темно-желтые морщинистые колонии диаметром 5-8 мм. Флуоресцирующих пигментов не образует. Образует желтый внутриклеточный пигмент неидентифицированной природы. Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотроф, микроаэрофил, каталазо- и оксидазоположительный. Желатину не гидролизует. В качестве источника углерода и энергии использует глюкозу, сахарозу, трегалозу, мальтозу, галактозу, маннозу, ксилозу, арабинозу, маннит, глицерин, этанол, сукцинат, лактат, ацетат, аргинин. Не использует лактозу, инозит. В качестве источника азота использует минеральные (NH+4

Растет в диапазоне температур 15 - 43°С и диапазоне рН 6,8-9,4. Оптимальные значения температур 25-28°С, рН 8,7-8,9.

Активный денитрификатор.

Содержание ГЦ оснований 64,4 мол.%.

По сиквенсу 16 S RNK наиболее близок к типовому штамму P.stutzerii ATCC 17588, однако существенно отличается скоростью деструкции SCN^-. Штамм устойчив к концентрации в среде тиоцианата до 6 г/л.

Штамм Pseudomonas putida №21 имеет следующие характеристики. Морфологические признаки.

Клетки палочковидные, подвижные, правильной формы с закругленными концами. Величина клеток 0,4 - 0,6х1,5 - 1,8 мкм. Монотрих. Спор и капсул не образует. Полиморфизм отсутствует. Размножается делением. Грамотрицательны.

Культуральные признаки.

На мясопептонном агаре и синтетических средах образует светлосерые флуоресцирующие плоские колонии с неровным краем диаметром 3-5 мм.

Физиолого-биохимические свойства.

Хемоорганотроф, микроаэрофил, каталазо- и оксидазоположительный. Желатину не гидролизует. В качестве источника углерода и энергии использует глюкозу, сахарозу, мальтозу, ксилозу, арабинозу, глицерин, этанол, сукцинат, лактат, ацетат, аргинин. Не использует маннозу, галактозу, маннит. В качестве источника азота использует минеральные (N+4

Штамм обладает повышенной устойчивостью к цианиду, дыхание не ингибируется при концентрации CN^--60 мг/л.

Пример 1. К жидкой среде с рН 9,3, содержащей 30 мг/л CN^- и 400 мг/л SCN^-, 20 г/л этанола (96%), К₂НРO₄ - 2 г/л, MgSO₄ - 0,3 г/л, Nа₂СО₃ - 0,5 г/л добавляют посевной материал в виде 24-часовых культур штаммов №18 и №21 (5% по объему каждая). Колбы с питательной средой и внесенным консорциумом бактерий закрывают резиновыми пробками и культивируют при встряхивании при температуре 26-28°С. Через 48 ч цианиды и тиоцианаты в среде не обнаруживают. Конечными продуктами деструкции являются карбонаты и сульфаты. Аммоний метаболизируется полностью.

Пример 2. Использовали пульпу после планирования золота и последующей химической предобработки, которая содержала 30 мг/л CN^- и 350 мг/л SCN^- (соотношение твердой и жидкой фазы 1:2). В нее добавляли 1 г/л фосфата калия двузамещенного, 20 г/л этанола и посевной материал - консорциум штаммов №18 и №21 в равных долях (5% по объему). Обезвреживание пульпы проводили в реакторах объемом 3 л (объем пульпы 2 л). Перемешивание осуществляли механической мешалкой первые 20 ч (деструкция CN^-) - 150 об/мин при температуре 22-24°С, последующие 18 ч (деструкция SCN^-) - 300 об/мин при температуре 34°С. При деструкции тиоцианата осуществляли дополнительную аэрацию пульпы воздухом (60 л/мин). За 38 ч культивирования цианиды и тиоцианаты биодеградируются полностью. Конечными продуктами деструкции являются карбонаты и сульфаты. Аммоний метаболизиртся полностью.

Пример 3. Использовали промышленную пульпу после цианирования золота, вскрытого бактериальным окислением золотомышьяковых концентратов, после химической предобработки она содержала до 30 мг/л CN^- и 1-4 г/л SCN. При бактериальной деструкции CN^- и SCN^- пульпу вносили в реакторы (соотношение твердой и жидкой фаз 1:3) в объеме 2 л, добавляли фосфат калия и этанол (20 г/л), рН поддерживали в диапазоне 9,2-9,4 с помощью растворов NaOH(20%) или H₂SO₄·(10N). Вносили консорциум штаммов №18 и №21 в равных долях (5% по объему). Деструкцию цианида проводили при перемешивании 150 об/мин 1-2 ч без принудительной аэрации. Дальнейшую деструкцию тиоцианата (4 г/л) проводили при перемешивании 300 об/мин, при принудительной аэрации воздухом и при температуре 30°С - 24 ч. За указанное время цианид и тиоцианат деструктировались полностью. Конечными продуктами деструкции являются карбонаты и сульфаты, аммоний метаболизируется полностью.

Литература:

1. D.A.Kunz, O.Nagappan, J.Silva-Avalos a. G.T.Delong. Utilization of cyanide as a nitrogenous substrate by Pseudomonas fluorescens NCIMB 11764: evidens for multiple pathways of metabolic conversion. Applied and Environmental microbiology. 1992, p.2022-2029.

2. J.L.Whitlock. Biological detoxification of precious metal processing wastewaters. Geomicrobiology Journal. 1990,v.8, p.241-249.

3. S.Basheer, O.M.Kut, J.E.Prenosil and J.R.Bourne. Kinetics of enzimatic degradation of cyanide. Biotechnology and Bioengineering. 1992, vol.39, p.629-634.

4. P.T.Pereira, J.D.Arrabaca a. M.T.Amaral-Collaco. Isolation, selection and characterization of a cyanide-degrading fungus from an indastrial effluent. Interational Biodeterioratoin a. Biodegradation. 1996, p.45-52.

5. Y.Katayama, T.Kanagawa a. H.Kuraishi. Emission ofcarbonyl sulfide by Thiobacillus thioparus grown with thiocyanate in pure and mixed cultures. FEMS Microbiolgy Letters. 1993, v.114, p.223-228.

6. D.Y.Sorokin, Т.P.Tourova, A.M.Lysenko a. J.G.Kuenen. Microbial tiocyanate utilization under highly alkaline conditions. Applied a. Environmental Microbiology. Feb.2001, p.528-538.

7. US Patent. Patent №5,169,532. Dec.8,1992. Method for biological removal of cyanides, thiocyanate and toxic heavy metals from highly alkaline environments.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно, к защите окружающей среды. Оно касается биологической очистки промышленных стоков и пульп от свободных цианидов и тиоцианатов, а также их комплексов с металлами. Использование консорциума новых штампов бактерий Pseudomonas stutzeri штамм №18 и Pseudomonas putida №21 позволяет снизить содержание цианидов с 5-30 мг/л и тиоцианатов с 0,1-4 г/л в растворах и пульпах до ПДК за 24 часа, что решает проблему обезвреживания цианид- и тиоцианатсодержащих стоков золотодобывающей и ряда других отраслей промышленности.

Консорциум бактерий Pseudomonas stutzeri №18 и Pseudomonas putida №21, хранящихся в лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов Института микробиологии РАН, деструктирующий CN^- и SCN^- при высоких концентрациях.