ШТАММ БАКТЕРИИ THIOBACILLUS THIOPARUS, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПРОМЫШЛЕННЫХ ОБОРОТНЫХ ВОД ОТ ТИОЦИАНАТ-ИОНА Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 

Изобретение относится к биотехнологии и к биологическим способам обработки загрязненных тиоцианат-ионами промышленных сточных вод. Штамм может быть использован в биотехнологических схемах очистки металлургических предприятий.

Очистка промышленных стоков металлургических предприятий от тиоцианат-иона являются необходимой для уменьшения негативного воздействия на окружающую среду и использования стоков в водообороте. Наиболее перспективными для очистки загрязненных экосистем являются биологические методы, так как они позволяют избежать вторичного загрязнения стоков реагентами, которые применяются для разрушения тиоцианат-иона [Akcil A. Destruction of cyanide in gold mill effluents: biological versus chemical treatments // Biotechnology Advances. 2002. V. 21. P. 501-511].

Известен способ по биодеградации цианидов и тиоцианатов. Стоки, содержащие до 11.5 мг/л цианидов и до 110 мг/л тиоцианатов, обезвреживали, используя штамм Pseudomonas paucimobilis и нитрифицирующие бактерии в составе активного ила. При попытке использовать данный консорциум бактерий для обезвреживания высоких концентраций CN- (100 мг/л) оказалось, что степень обезвреживания цианида была низкой - около 43 % [Akcil A. Destruction of cyanide in gold mill effluents: biological versus chemical treatments // Biotechnology Advances. 2002. V. 21. P. 501-511.].

Недостатком предложенного способа являются невысокие концентрации тиоцианата в обрабатываемых стоках.

Известен комбинированный бактериально-химический способ обезвреживания цианидов и их производных, который позволяет обезвреживать пульпы и растворы с высокими концентрациями цианида, тиоцианата и других их производных, одновременно обеспечивая снижение концентрации токсикантов до ПДК с использованием консорциума гетеротрофных штаммов Pseudomonas. putida 21 и Pseudomonas. putida 18 [Патент RU на изобретение №2226548 МПК С12N 1/20, опубл. 10.04.2004, КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS STUTZERI № 18 И PSEUDOMONAS PUTIDA № 21, ДЕСТРУКТИРУЮЩИЙ CN- И SCN- ПРИ ВЫСОКИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ, [Патент RU на изобретение № 2245850 МПК C02F 3/34, опубл. 10.02.2005, СПОСОБ ОЧИСТКИ ПРОМЫШЛЕННЫХ СТОКОВ ОТ ЦИАНИДОВ И ТИОЦИАНАТОВ]. Предлагаемый способ включает две стадии обработки – химическую и микробиологическую. Химическая стадия обработка пульпы или раствора проводится метабисульфитом щелочного металла и позволяет снизить содержание цианида до остаточной концентрациии 5.3-19.1 мг/л. Микробиологическая стадия проводится с целью снижения концентрации цианидов и тиоцианатов до ПДК (0.05мг/л) с помощью консорциума бактерий, включающего штаммы P. putida 21 и P. stutzeri 18. Бактерии способны расти при концентрации цианида до 30 мг/л и тиоцианата – до 6 г/л.

Недостатком предложенного способа является использование консорциума органотрофных микроорганизмов для которых необходимо использование органического субстрата.

Известен способ биологической очистки сточных вод от цианидов и тиоцианатов, разработанный компанией BIOMIN South Africa (Pty) Limited (технология ASTER™). В микробных сообществах реакторов промышленных установок доминируют такие микроорганизмы как Fusarium oxysporum, Ralstonia eutropha, Bosea thiooxidans, Pseudomonas stutzeri OC-10, Spumella sp., Microbacterium schleiferi 118, Acinetobacter sp. ST-01, Acinetobacter venetianus L17, Pseudomonas fluorescens KDK8, Candida humulis, Kazakhstania sp., Cuprivadus necator [www.biomin.co.za/aster].

Недостатком предложенного способа также является необходимость использования органического субстрата (мелассы).

Известен консорциум микроорганизмов, который осуществлял деструкцию тиоцианата в биореакторе без внесения органического субстрата [Watts, M. P., Spurr, L. P., Gan, H. M., & Moreau, J. W. Characterization of an autotrophic bioreactor microbial consortium degrading thiocyanate // Applied Microbiology and Biotechnology. 2017. V 101. Is. 14. P. 5889–5901]. Среди тиоцианат деструктирующих микроорганизмов в консорциуме доминировали штаммы р. Thiobacillus.

Недостатком консорциума является то, что процесс деструкции проводился в периодическом режиме.

Наиболее близким по сущности и достигаемому результату является штамм бактерии Thiobacillus thioparus, который предлагается использовать в очистке стоков от тиоцианата [Патент TW 201242909, 2012-11-01 Publication of TW201242909A].

Недостатком штамма и используемого способа является необходимость предварительного наращивания штамма на питательной среде и его внесение в загрязненные стоки, что усложняет технологию очистки и требует использования дополнительного оборудования для его культивирования.

Технической проблемой изобретения является получение устойчивого высокоактивного штамма бактерии способного разлагать тиоцианат-ион в сточных водах промышленных предприятий.

Техническая проблема решается за счет выделения автотрофного штамма бактерий Thiobacillus thioparus, способного к деструкции тиоцианат-иона.

Штамм был депонирован в НБЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика (далее ВКПМ). Свидетельство о депонировании № В - 13779 от 14.10.2020.

Штамм был выделен из промышленного реактора.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками:

Температура культивирования штамма составляет 20-38ºС (оптимум 30ºС), рН 5,0-9,0 (оптимум 6,5-7,0).

Морфологическая характеристика - форма клеток - палочки, при росте в жидкой среде образует агрегаты бурого цвета размером 0,5-1 мм.

Отношение к кислороду - аэроб.

В качестве энергетического субстрата для роста используют тиосульфат и тиоцианат-иона.

Полезное свойство, в связи с которым культура депонируется - способность к деструкции тиоцианат-иона.

Условия культивирования - минеральная среда следующего состава:

Сульфат аммония – 1 г/л, аммофос – 0.4 г/л, KOH – 0.1 г/л, роданид калия - 2 г/л или тиосульфат натрия - 5 г/л.

Условия хранения - сохраняется путем пересевов на среде культивирования или в замороженном виде при -80°С.

Анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК позволил отнести штамм к виду Thiobacillus thioparus, так как сходство последовательности с типовым штаммом Thiobacillus thioparus DSM 505 – 98,93%.

Способность штамма к снижению содержания тиоцианат-иона, присутствующих в сточной воде изучали в лабораторных и промышленных испытаниях. Результаты приведены в примерах ниже.

ПРИМЕР 1.

Исследование способности штамма бактерий Thiobacillus thioparus к деструкции тиоцианат-иона в чистой культуре, изображено на фиг.1.

Были проведены эксперименты по деструкции тиоцианат-иона штаммом при выращивании на орбитальном шейкере в колбах Эрленмейера со 100 мл питательной среды. На фиг.1 представлены результаты деструкции тиоцианат-иона штаммом Thiobacillus thioparus к деструкции тиоцианат-иона в чистой культуре при росте на минеральной среде.

Было показано, что штамм за 5 суток практически полностью разрушал 1,3 г/л тиоцианат-иона. При этом при внесении в среду дополнительного количества тиоцианат-иона он быстро разрушался.

ПРИМЕР 2.

Мониторинг штамма бактерий Thiobacillus thioparus в процессе деструкции тиоцианат-иона в лабораторных и промышленных реакторах.

Мониторинг штамма в лабораторных и промышленных биореакторах деструкции тиоцианат-иона был проведен с использованием метагеномного анализа фрагментов гена 16S рРНК с помощью высокопроизводительного секвенирования на платформе Illumina MiSeq. Были отобраны образцы жидкой фазы и твердых носителей из лабораторных и промышленных реакторов. Из полученных образцов пульп из реакторов выделяли ДНК для проведения секвенирования фрагментов гена 16S рРНК. Для выделения ДНК биомассу отделяли от твердой и жидкой части пульпы центрифугированием. Для этого образцы пульпы центрифугировали сначала при 1000 об/мин в течении 15 мин, чтобы отделить твердую часть пульпы. Супернатант использовали для осаждения биомассы путем центрифугирования при 3000 об/мин. в течении 1 часа. Полученный осадок биомассы ацидофильных микроорганизмов промывали, центрифугируя при 3000 об/мин. в течение 30 мин., раствором следующего минерального состава (г/л): (NH4)2SO4 – 1,0; аммофос – 0,4; KOH – 0,1; MgSO4 × 7H2O – 0,5 с рН ~7.5. Образец ресуспендировали в 300 мкл лизирующего буфера (0,15 M NaCl, 0,1 M Na2-EDTA, pH 8,0), содержащего 15 мг/мл лизоцима. До выделения ДНК буфер с лизированной биомассой хранили при -20°С в пластиковых пробирках с завинчивающимися крышками. ДНК выделяли фенол-хлороформным методом [T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p. 545.]. Библиотеки для секвенирования были приготовлены в соответствии с ранее описанным протоколом [Fadrosh D.W., Ma B., Gajer P., Sengamalay N., Ott S., R.M. Brotman R.M., Ravel J. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform, Microbiome. 2014. 2:6. DOI: 10.1186/2049-2618-2-6.]. В качестве универсальных использовались праймеры Pro341F (5'-CCTACGGGNBGCASCAG-3') и Pro805R (5'-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3'), которые позволяют амплифицировать вариабельные участки генов 16S рРНК V3 и V4. Для дальнейшего секвенирования полученные ампликоны разделялись с помощью электрофореза в агарозном геле, вырезанные из геля ампликоны очищались с помощью набора для очистки ДНК из геля и реакционных смесей Cleanup Standard (Евроген, Россия). Секвенирование проводилось при помощи набора реагентов, обеспечивающего длину прочтения 300 нуклеотидов с каждого конца ампликона. Первичная обработка (фильтрация и демультиплексирование) полученных прочтений производилось при помощи ПО CLC Genomics Workbench 7.5 (Qiagen, США). Полученные данные были обработаны с помощью онлайн сервиса SILVAngs (https://www.arb-silva.de/ngs/). Для каждого образца было проанализировано около 10000 тыс. фрагментов средней длиной 486 нуклеотида.

Было установлено, что при проведении процесса в проточном режиме как в реакторах с внесением в среду органического субстрата (1 г/л мелассы), так и без внесения органики, во всех пробах были выявлены последовательности гена 16S рРНК штамма. Их доля составляла от 12 до 76%. При этом не были выявлены в значительном количестве последовательности других групп микроорганизмов, способных к деструкции тиоцианат-иона.

Это указывает на то, что при ведении процесса в проточном режиме в нестерильных условиях штамм Thiobacillus thioparus играет значительную роль в деструкции тиоцианат-иона и способен доминировать в популяции в различных условиях, что приводит к эффективному разложению тиоцианат-иона.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм автотрофных бактерий Thiobacillus thioparus OL2018-9, обладающий способностью окислять серу и к деструкции тиоцианат-иона, депонирован в ВКПМ под регистрационным номером В-13779. Штамм автотрофных бактерий Thiobacillus thioparus ВКПМ В-13779 может быть использован при очистке сточных вод промышленных предприятий от тиоцианат-иона. Изобретение позволяет снизить содержание тацион-иона в сточных водах промышленных предприятий. 2 пр., 1 ил.

Штамм бактерии Thiobacillus thioparus ВКПМ № В-13779, предназначенный для очистки промышленных оборотных вод от тиоцианат-иона.