БИОДЕГРАДАЦИЯ ЦИАНИДОВ МЕТАЛЛОВ Российский патент 2000 года по МПК A62D3/00 C12N9/08 

Изобретение относится к биодеградации (биоразложению) цианидов металлов или смеси двух или большего количества цианидов металлов и в частности цианида железа или смеси цианидов железа.

Газификация каменного угля для получения газа метана является общепринятой практикой в большинстве стран Европы, в Объединенном Королевстве и США с 19 века по середину 60-х годов нашего столетия. Этот способ вышел из широкого употребления, оставив после себя около 5 000 бывших газоперерабатывающих предприятий, загрязненных побочными продуктами газификации и их последующей очисткой. Эти загрязняющие вещества обычно включают неорганические вещества, такие как соединения, содержащие серу и цианиды, металлы, летучие ароматические вещества, фенолы и полиароматические углеводороды (ПАУ). Удаление цианидов водорода и сульфидов водорода путем пропускания газа через окисные очистители, содержащие окись железа, приводят к получению отработанного оксида, содержащего до 45 000 мг/кг цианида. Большинство цианидов находится в комплексе с железом в форме соединений, таких как берлинская лазурь (Fe₄[Fe(CN₆)]₃), придавая отработанным оксидам характерный голубой цвет. Растворимость берлинской лазури сильно зависит от pH. Несмотря на то, что цианид железа является высоко стабильным и нерастворимым при низких pH (обычных для земель газоперерабатки, при pH выше 4 их концентрации в грунтовых водах благодаря выщелачиванию и вымыванию могут превосходить максимально допустимый уровень в 200 мкг/л (эквивалентно 1,28•10^-6 мМ) Dutch (Meeussen et al, 1992). По этим соображениям Meeussen et al (1992) определили, что вся берлинская лазурь должна быть удалена до того, как концентрации цианида железа упадут до допустимого уровня. Биологический процесс, при котором токсические соединения подвергаются полной минерализации, часто дешевле и считается более приемлемым для окружающей среды, чем химические процессы удаления подобных токсических химикалий. Таким образом, очень желательно выделить микроорганизм, обладающий способностью к разложению соединений цианидов железа, включая берлинскую лазурь.

Stemphylium loti является патогенным грибком цианогенного растения - лядвенец рогатый. Показано, что грибок производит циан
H₂O+ HCN ---> HCONH₂
Fry и Millar (1972) также показали, что оптимальная pH для его ферментативной активности колеблется от 7,0 до 9,0.

Цианид-гидратаза обычно выделяется путем очистки из ряда других грибков, включающих Fusarium laterium (Cluness et al, 1993) и Gloeocercospora sorghi (Wang and Van Etten, 1992).

Бактерии Pseudomonas Fluorescens NCIMB 11764, впервые выделенные Harris и Knowles (1983), утилизируют KCN в условиях ограниченного содержания азота при нейтральных условиях в условиях дробной подпитки. Ключевым ферментом в этом случае является цианидоксигеназа (Harris and Knowles, 1983), где цианид превращается в аммиак, который затем утилизируется в промышленных процессах.

HCN + O₂ ---> CO₂ + NH₃
Kunz и др. (1992) позднее показали, что цианидгидратаза также присутствует в Pseudomonas species, хотя их активность ограничена более высокими концентрациями цианида, такими как 20-50 мМ.

Некоторые бактерии, включающие Pseudomonas Fluorescens NCIMB 11764 (Rollinson et al, 1987), Pseudomonas putida BCN3 (Silva- Avalos et al, 199x) и Pseudomonas paucimobilis mudlock ATCC 39204 (см. патент США N 4,461,834 Mudder and Whitlock), обладают способностью утилизировать умеренно сильные металлические комплексные цианиды в форме цианидов никеля [Ni(CN)₄ ²¹] в среде с ограниченным источником азота или в непрерывных условиях культивирования, при нейтральных значениях pH. И вновь наблюдается активность цианидоксигеназы.

Несмотря на то, что некоторое количество металлоцианидов, включая Ni(CN)₄ ^2- и Cu(CN)₄ ^2-, разлагается бактериями при нейтральном значении pH (около pH 7) не было выделено предкультуры микроорганизма или смешанных культур микроорганизмов, которые бы обладали способностью роста на средах, содержащих цианиды железа.

Не существует также достоверных данных об организмах, способных разлагать цианиды металлов при pH ниже pH 7. Подобным образом, хотя показано, что некоторые грибы переносят цианиды в форме HCN путем детоксификации с использованием цианидгидратазы, не было показано, что грибы растут на каком-либо металлоцианидном комплексе при pH 7 или на любом другом.

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предлагается способ биодеградации цианидов металлов или смеси двух или большего количества цианидов металлов, основанный на способности организма расти на среде, содержащий цианид или цианиды при pH среды, равной 6 или ниже. Предпочтительно этим организмом являются грибки.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается способ биодеградации цианидов металлов или смеси двух или большего количества цианидов металлов, основанный на способности грибов расти в среде, содержащей цианид или смесь цианидов при pH 7,5 или меньше.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается способ биодеградации цианида железа или смеси двух или большего числа цианидов железа, основанный на способности грибов расти в среде, содержащей цианид или смесь цианидов.

Предпочтительно pH среды меньше 7,5 и наиболее подходящим является значение pH от 3 до 6.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения грибком является Fusarium solarii (IMI 369371).

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения грибком является Tricoderma polysporum (IMI 369372).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения грибком является Fusarium oxvsporium (IMI 370462).

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения грибком является Penicillium itliczynski (IMI 360461).

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения грибком является Scytalidium thermophiLum (IMI 370463).

Воплощения изобретения будут подробно описаны со ссылкой на следующее.

Обогащение, осуществленное при pH 4 (50 нМ сукцинат/10 мМ NaOH) с использованием почвы, взятой с загрязненного места добычи и переработки газа, дает в результате смешанную культуру, включающую грибки, обладающие способностью расти на металлоцианидных комплексах, включающих цианид никеля (Ni(CN)₄ ²¹), ферроцианид калия (K₄Fe(CN)₆), ферроцианид калия (K₃Fe(CN)₆) и берлинскую лазурь (Fe₄[Fe(CN)₆]₃), при их добавлении в качестве единственного источника азота и в кислых условиях (около pH 4).

Рост становился видимым при образовании черной грибковой биомассы. Роста не происходило, когда в среду не добавляли источник азота. Удаление комплекса цианида железа из среды регистрировали двумя способами. В первом случае при использовании цианида железа по мере роста грибков исчезало голубое окрашивание среды (существующее благодаря наличию берлинской лазури) до полного ее обесцвечивания.

Контрольная среда, которая не инокулировалась, оставалась голубой. Во втором случае удаление комплекса регистрировали по концентрации в среде металлоцианидов, которые измеряли как концентрации свободных цианидов после подкисления и дистилляции среды для высвобождения цианидов, которые затем поглощались NaOH и пропускали через дионекс. В случаях цианидов железа из среды, содержащей грибки, удаляется более 95% цианидов, в то время как в контрольной среде остается 90% первичной концентрации цианидов.

Основные виды грибков определены как Fusarium sp. Также определялись другие виды грибков Tricodermata sp наряду с Fusar sp и Penicillin sp. Обогащение производится с использованием среды с pH 4, состоящей из 25 мл 0,2М сукцинатного буфера, 1 мл 1М NaOH, 0,1 мл следовых элементов, 1 мл MgSO₄/CaCl₂ - 0,25 мМ Ni(CN)₄ ^2-, 10 мМ глюкозы, 1 мл M9 фосфатного буфера (без добавления NH₄Cl). Среда доводится до 100 мл дистиллированной водой в 250-миллилитровых встряхиваемых колбах.

Материал (1 г) либо из отработанного оксида отвала, или из верхнего слоя загрязненной почвы добавляют к среде и оставляют встряхиваться (с доступом воздуха) при 25^oC в темноте. Эти обогащенные образцы берут из закрытых мест добычи и переработки газа за 6 недель до проведения экспериментов и хранят при 40^oC. Через 10 дней колбы перестают встряхивать и 5 мл среды переносят в 100 мл свежей среды с pH 4, также содержащей 0,25 мМ (Ni(CN)^2- в качестве единственного источника азота. Эту процедуру повторяют через 7 дней, и на этот раз также вводится среда, не содержащая источник азота.

Рост грибков (или грибка) становится очевидным в виде черного слоя в колбах, содержащих грибковый инокулят или первоначально из обогащенных колб, содержащих загрязненную землю. Не наблюдалось очевидного роста в обогащенных колбах, содержащих только отработанные оксиды. Не было видимого роста во флаконах без добавления азота.

Еще две последовательные субкультуры получены также в среде или не содержащей источник азота, или содержащей 0,5 мМ Ni(CN)₄ ^2- в качестве единственного источника азота. Снова рост был видимым только с Ni(CN)₄ ^2-. Рост также обнаруживался с 0,5 мМ Cu(CN)₄ ^2- или с аммиаком в качестве источника азота, однако с аммиаком, хотя грибковый рост был видимым, среда становилась мутной из-за происходящего также бактериального роста.

Следуя способу обогащения, в качестве единственного источника азота в среду добавляют 0.5 мМ или K₄Fe(CN)₆, или K₃Fe(CN)₆. Когда любая из солей добавляется к среде, она полностью растворяется для высвобождения K⁺ и либо ионов Fe(CN)₆ ^4-, либо Fe(CN)₆ ^3- соответственно. Ионы Fe(CN)₆ не диссоциируют благодаря их стабильности, однако при добавлении следовых элементов, которые содержат свободное железо, ионы Fe(CN)₆ немедленно реагируют со следовым количеством железа с осаждением берлинской лазури (Fe₄[Fe(CN)₆]₃); H.Meeussen, персональное сообщение).

Изобретение относится к биоразложению цианидов железа, содержащихся в отходах. Цианиды железа K₄Fe(CN)₆ и/или К₃Fе[CN]₆ разлагаются грибками, выбранными из Fusarium solani, Trichoderma polysporum, Fusarium oxysporum, Scytalidium thermophilum, Penicillium miczynski. pH среды не более 7,5, преимущественно 3-6. В результате получают отходы с низким содержанием цианид-иона. Способ более дешев, чем химические способы переработки. 2 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ биодеградации цианида железа или смеси двух или большего числа цианидов железа, включающий выращивание грибков в среде, содержащей цианид или смесь цианидов, с рН среды 7,5 или менее. 2. Способ по п.1, в котором рН составляет от 3 до 6. 3. Способ по п. 1 или 2, в котором грибки выбирают из Fusarium solani (IMI 369371), Trichoderma polysporum (IMI 369372), Fusarium oxysporum (IMI 370462), Scytalidium thermophilum (IMI 370463) и Penicillium miczynski (IMI 360461).