СПОСОБ ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ИЗМЕНЕНИЙ В БИОПТАТАХ ПЕЧЕНИ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТАХ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, в частности гепатологии.

Известен способ ранговой оценки степени выраженности воспаления, некроза и фиброза, разработанный Knodell et al. в 1981 году [1]. Этот полуколичественный метод заключается в балльной оценке гистологических изменений в биоптатах печени по разделам: перипортальные и мостовидные некрозы (до 10 баллов),внутридольковая дегенерация и фокальные некрозы (до 4 баллов), портальное воспаление (до 4 баллов) и фиброз (до 4 баллов).Данный метод известен как “индекс Knodell” и наиболее широко распространен в Российской Федерации.

Недостатком данного метода является объединение оценки активности некро-воспалительных реакций и фибротических (цирротических) изменений, хотя последние являются следствием первых и не отражают активность воспаления. Фиброзные изменения в большей степени стабильны и характеризуют стадию изменения гистоархитектоники печеночной дольки или ацинуса. Именно в силу достаточной стабильности соединительнотканных образований полуколичественная оценка, предложенная Knodell, не позволяет проследить динамику воспалительных процессов.

Известна также система оценки активности и стадии развития гепатитов по алгоритму, предложенному Scheuer [2]. В данном ранговом протоколе оценивают некрозы и воспалительные изменения в диапазоне от 0 до 4 баллов с раздельным подсчетом порто-перипортального компонента и ацинарных изменений. Архитектурные изменения гистологического строения печени вследствие фиброза также оцениваются отдельно в 4-балльном диапазоне.

Недостатком данной системы подсчета является потеря количественной унификации получаемых результатов с широко применяемым индексом Knodell, а также снижение чувствительности оценки выявленных изменений.

Наиболее близким, принятым за прототип, является протокол ранговой оценки повреждения печени, разработанный V.Desmet и соавторами из Католического университета Леувена (Бельгия). От других предложенных методов она отличается тем, что авторы раздельно оценивают ступенчатые и мостовидные некрозы, соблюдается важный принцип - унификация балльной оценки. Максимальное количество баллов при оценке некрозов и воспаления, как и в индексе Knodell, равно 18 [3]. Особым же достоинством системы является удобный и понятный метод оценки стадий заболевания (хронический гепатит с минимальной активностью, слабовыраженный, умеренный, тяжелый хронические гепатиты).

В данной системе, как и в вышеуказанных, не используются дополнительные, прежде всего иммуногистохимические методы, исследований, которые позволяют установить этиологию и прогнозировать течение заболевания. В связи с этим определение этиологии и прогностическая оценка патологических процессов в печени остаются недоступными.

Предлагаемый нами метод полуколичественной оценки морфологических и иммуногистохимических изменений в биоптатах печени при хронических вирусных гепатитах позволяет установить этиологию, степень активности и стадию заболевания, прогнозировать течение гепатита, выявлять механизмы повреждения и контролировать эффективность терапии. Новые возможности достигаются использованием иммуногистохимического окрашивания с антителами против антигенов вирусов гепатита В (HbsAg, HbcAg) и С (NS-3Ag), с антителами против ядерного антигена пролиферирующих клеток - (PCNA), иммуногистохимическое выявлением альфа-гладкомышечного актина (α-SMA), “холангиолярных” цитокератинов (№7 и №19), учетом степени выраженности иммунных реакций (HLA-DR) и активации NK-клеток, оценкой повреждения, пролиферации желчных протоков, наличия дуктопении.

Протокол ранговой оценки изменений в биоптатах печени при хронических вирусных гепатитах

1. Внутридольковая дегенерация и фокальные некрозы Баллы

А. Нет 0

Б. Слабая 1

(ацидофильные тельцы, баллонная дегенерация и/или отдельные фокусы некрозов в <1/3 долек)

В. Умеренная (как “Б” в 1/3-2/3 долек) 3

Г. Выраженная (как “Б” >2/3 долек) 4

2. Перипортальные ступенчатые и мостовидные некрозы

А. Нет 0

Б. Один или несколько “языков”

ступенчатых некрозов в

отдельном ПТ

(ПТ - это портальный тракт) 1

В. Как “Б” >1 ПТ 2

Г. Ступенчатые некрозы занимают

<50% большинства ПТ 3

Д. Ступенчатые некрозы занимают

>50% большинства ПТ 4

Е. Как “Д” + септальный некроз 5

Ж. Порто-портальный

мостовидный некроз 6

Порто-центральный

мостовидный некроз 8

И. Панлобулярный (сливной) некроз 10

3. Портальное воспаление

А. Нет 0

Б. Слабое (отдельные клетки

воспаления в <1/3 ПТ) 1

В. Как “Б” >1/3 ПТ 2

Г. Умеренное (много воспалительных

клеток в 1/3-2/3 ПТ) 3

Д. Выраженное (плотные

воспалительные инфильтраты в

>2/3 ПТ) 4

Сумма баллов --

Повреждение желчных протоков есть/нет

Пролиферация протоков есть/нет

Дуктопения есть/нет

Иммуногистохимия

1. HbsAg есть/нет цитоплазма/мембраны гепатоцитов

2. HbcAg есть/нет ядро/цитоплазма/мембраны гепатоцитов

3. HCV есть/нет

4. alpha-SMA сосуды/перипортальные клетки/синусоидные клетки

5. PCNA А. В гепатоцитах (0-1%, 1-10%, 10-30%, >30%)

Б. Клетки воспаления есть/нет

В. Синусоидные клетки есть/нет

Цитокератины №7/19 в

гепатоцитах есть/нет

7. HLA-DR клетки воспаления/синусоидные клетки/холангиоциты/гепатоциты

8. NK клетки (среднее кол-во) в ПТ, в ацинусе

Оценивая степень активности в зависимости от количества баллов, может быть поставлен следующий морфологический диагноз:

а) от 1 до 3 - хронический гепатит с минимальной активностью процесса;

б) от 4 до 8 - слабовыраженный хронический гепатит;

в) от 9 до 12 - умеренный хронический гепатит;

г) от 13 до 18 - тяжелый хронический гепатит.

Фиброз/Цирроз

А. Нет 0

Б. Слабовыраженный (Перипортальный) 1

В. Умеренный (Порто-портальные септы

(1 и более)) 2

Г. Тяжелый (Порто-центральные септы

(1 и более)) 3

Д. Цирроз 4

Предлагаемый способ полуколичественной оценки изменений в биоптатах печени представляет собой унифицированную балльную систему. Максимальное количество баллов для оценки некрозов и воспаления - 18, то есть та же сумма, что у Knodell и Sciot&Desmet. Стадия заболевания оценивается в общепринятом четырехбалльном диапазоне. Кроме того, для определения этиологии вирусного гепатита обязательно используется окрашивание с антителами против антигенов вирусов гепатита В и С. А для гепатита В определяется фаза заболевания. Различный паттерн окраски с антителами против HBsAg и HBcAg позволяет определить репликативную, элиминативную (низкий уровень репликации) и интегративную фазы. Верификация фазы хронического гепатита В помогает определить необходимость назначения интерферонов. В случае интегративной фазы нет показаний для интерферонотерапии. Критерии иммуногистохимического определения фазы вирусного гепатита представлены в таблице.

Для определения степени выраженности альтерации, напряженности регенераторного ответа и возможной узловой трансформации оценивается пролиферативная активность различных клеточных типов печени (иммуногистохимическое окрашивание с антителами против ядерного антигена пролиферирующих клеток - PCNA). Прогностически важным является и иммуногистохимическое выявление альфа-гладкомышечного актина (α-SMA). Именно этот белок появляется в цитоплазме синусоидных клеток Ито, когда они трансдифференцируются в миофибробласты. Последнее является ключевым событием начала синтеза коллагенов и развития фиброза и выявляется до момента морфологически видимых изменений в виде отложения фибриллярных белков в зоне некроза и воспаления. Кроме того, иммуногистохимически оценивается степень выраженности иммунных реакций (HLA-DR) и активация NK-клеток, что очень важно в случае вирусного повреждения печени. Иммуногистохимическое выявление “холангиолярных” цитокератинов (№7 и №19) является наилучши критерием оценки состояния желчных протоков.

Эффективность предлагаемого метода определяется качеством и достоверностью диагностических критериев, которые соответствуют современным мировым стандартам морфологической диагностики хронических гепатитов. Если первая часть протокола, где оценивается степень активности и стадия заболевания, может быть проанализирована и заполнена на основании стандартных методов окраски, то состояние желчных протоков, экспрессию вирусных антигенов, регенераторный ответ печени, участие иммунного компонента в альтерации и прогноз фиброза не могут быть проанализированы без иммуногистохимии.

Метод полуколичественной оценки морфологически и иммуногистохимически выявленных изменений в биоптатах печени апробирован на 214 случаях хронических вирусных гепатитов. 132 пациента имели хронический гепатит С (ХГС), 82 - хронический вирусный гепатит В (ХГВ). Диагноз верифицировался с помощью традиционного комплекса клинических, эпидемиологических, биохимических и серологических критериев с обязательным подтверждением в полимеразной цепной реакции на ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С.

В результате применения описанного метода удалось подтвердить этиологию заболевания в 100% случаев ХГВ иммуногистохимическим обнаружением HbsAg и/или HbcorAg в гепатоцитах.

Этиология ХГС подтверждалась обнаружением типичных морфологических признаков этого заболевания: выраженности жировой дистрофии гепатоцитов в сочетании с умеренным перипортальным и интралобулярным некрозом (1 и 2 зоны ацинуса), поражением желчных протоков.

В 43% рутинный гистологический анализ не позволял выявить изменения со стороны внутрипеченочных желчных протоков и только включение в протокол обследования методов иммуногистохимии (цитокератины №7 и №19) позволило визуализировать желчные протоки даже мелких портальных трактов. В 21 случае диагноз ХГС подтвержден обнаружением NS-3 антигена вируса гепатита С.

Уникальной возможностью метода является достоверное определение фазы естественного течения заболевания: вирусной репликации, элиминации (низкой репликации) и интеграции. Во всех 76 случаях обнаружения HbsAg и HbcorAg (100%) у больных ХГВ фаза была определена. У 54 пациентов - фаза репликации (HbcorAg - в ядре, HbsAg -слабая позитивность), у 7 - фаза элиминации (HbcorAg - в ядре или цитоплазме, HbsAg - выраженная цитоплазматическая и мембранозная позитивность), у 15 - фаза интеграции (HbcorAg - негативен, HbsAg - строгая цитоплазматическая позитивность).

Ценную информацию позволяет получить метод полуколичественной оценки морфологических и иммуногистохимических изменений в печени для определения степени активности гепатита. Во всех случаях, когда нам удавалось получить биоптат, включающий три портальных тракта и более (202 случая - 94,4%), вычислялся суммарный гистологический индекс активности гепатита.

У больных ХГВ гистологический индекс активности (HAI) в 73% случаев соответствовал степени повышения аланиновой аминотрансферразы (АлАТ) -традиционного биохимического индикатора активности воспаления; в 19% (15 чел.) наблюдений - HAI был повышен в большей степени, чем АлАТ, и у 7 (8,7%) больных градиент АлАТ превышал морфологическую оценку активности.

При ХГС соответствие между HAI и АлАТ наблюдалось в 64% (84 чел.) обследований, в остальных случаях HAI был более информативен, чем АлАТ.

Иммуногистохимическое выявление HLA-DR и NK дало возможность оценить общее количество и локализацию иммунокомпетентных клеток в пределах портальных трактов и разных зонах ацинуса, таким образом - выраженность иммунного и аутоиммунного (в случае экспрессии HLA-DR в гепатоцитах) компонентов воспалительной активности.

Следовательно, с помощью апробируемого метода нам удалось получить более точную и специфичную диагностическую информацию о степени активности воспалительного процесса в печени.

Для определения стадии развития заболевания морфологическая диагностика является незаменимой, т.к. позволяет прямо, а не по косвенным клинико-лабораторным признакам регистрировать степень фиброза и цирроз. Так, среди курируемых нами пациентов у 2 больных ХГВ и 3 - ХГС был обнаружен цирроз печени. Причем в двух случаях цирроз оказался диагностической находкой, т.к. не сопровождался убедительной клинической симптоматикой.

Использование α-SMA как маркера гладкомышечной трансдифференцировки клеток Ито и как иммуногистохимического предвестника фиброзообразования, при отсутствии его морфологических признаков или их малой выраженности, позволило выделить группу риска (23 больных ХГВ, 36 больных ХГС) по развитию фиброза и цирроза, которая требует особого терапевтического внимания.

Лечение хронических вирусных гепатитов осуществляется дорогостоящими препаратами α-интерферона и аналогами нуклеозидов с достаточно высокой частотой побочных реакций и негарантированной эффективностью. Поэтому особое значение имеет возможность контроля за эффективностью лечения не только с помощью молекулярно-генетических и серологических критериев, но и морфологических и иммуногистохимических методов. В частности, среди 7 обследованных нами нереспондентов интерферонотерапии (3-ХГВ, 4-ХГС), у 3 обнаружена положительная гистологическая динамика (более 2 пунктов НАI).

Таким образом, способ полуколичественной оценки морфологических и иммуногистохимических изменений в биоптатах печени при хронических вирусных гепатитах, сохраняя принятую в мировой практике систему 18-балльной оценки выявленных нарушений, позволяет выставить и сформулировать диагноз заболевания в полном соответствии с требованиями международной классификации хронических гепатитов (Лос-Анджелес, 1994 г.) с указанием этиологии, фазы, степени активности, стадии развития патологического процесса, а также контролировать эффективность проводимой терапии и, в ряде случаев, прогнозировать риск неблагоприятного течения заболевания.

Источники информации

1. Knodell R.G, Ishak K.G, Black et al. Formulation and application of numerical scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis // Hepatology, 1981, 1, p.431-435.

2. Scheuer P.J. Classification of chronic viral hepatitis: a need for reassessment // J. Hepatology, 1991, 13, p.372-374.

3. V. Desmet, M. Gerber, J.H. Hoofnagle et al. Классификация хронического гепатита: диагностика, определение степени тяжести и стадии течениям.// Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии, 1995, № 2, с. 38-45.

Изобретение относится к области медицины, в частности гепатологии. Способ полуколичественной оценки изменений в биоптатах печени при хронических вирусных гепатитах приводит к протоколу подсчета в баллах патологических признаков, выявленных при морфологическом изучении биоптатов печени больных хроническими вирусными гепатитами, по разделам: внутридольковая дегенерация и фокальные некрозы (до 4 баллов), перипортальные ступенчатые и мостовидные некрозы (до 10 баллов), портальное воспаление (до 4 баллов), отдельный учет фиброза/цирроза (до 4 баллов). При этом в протокол дополнительно включена оценка состояния внутрипеченочных желчных протоков, иммуногистохимическое выявление антигенов этиологических вирусных агентов гепатитов, альфа-гладкомышечного актина, ядерного антигена пролиферирующих клеток, холангиолярных цитокератинов (№7 и 19), HLA-DR клеток и клеток-естественных киллеров. Способ позволяет установить количественную унификацию полученных результатов при указанных заболеванях. 1 табл.

Способ полуколичественной оценки изменений в биоптатах печени при хронических вирусных гепатитах путем подсчета в баллах патологических признаков, отличающийся тем, что определяют признаки по разделам: внутридольковая дегенерация и фокальные некрозы; перипортальный ступенчатый и мостовидный некроз; портальное воспаление; отдельный учет фиброза/цирроза, а также в протокол включают оценку состояния внутрипеченочных желчных протоков, иммуногистохимическое выявление антигенов этиологических вирусных агентов гепатитов, оценку альфа-гладкомышечного актина, оценку ядерного антигена пролиферирующих клеток, холангиолярных цитокератинов (№7 и 19), HLA-DR клеток и клеток-естественных киллеров, по полученным морфологическим данным проводят расчет баллов с помощью предложенного протокола, на основании результатов балльной оценки изменений в биоптатах печени при значениях от 1 до 3 баллов определяют хронический гепатит с минимальной активностью, при значениях от 4 до 8 баллов - слабовыраженный хронический гепатит, от 9 до 12 - умеренный хронический гепатит, от 13 до 18 - тяжелый хронический гепатит.