СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА В+С НА ФОНЕ ОПИСТОРХОЗА Российский патент 2004 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, в частности гастроэнтерологии, конкретно, к способам диагностики хронического вирусного гепатита В+С на фоне описторхоза.

Известно, что диагностика хронического вирусного гепатита (ХВГ) в фазе репликации на фоне описторхоза осуществляется следующими способами:

1. Серологическим - определение специфических вирусных антигенов и антител в сыворотке крови: HBeAg, antiHBcIgM, antiHCVIgM, IgG [1, 2], определение противоописторхозных антител класса IgG в сыворотке крови [3].

2. ПЦР - определение вирусных РНК и ДНК в сыворотке крови [4, 5].

3. Морфологическим - проведение чрезкожной пункционной биопсии с последующим нахождением морфологических маркеров вирусных гепатитов и определением активности воспалительного процесса в печени (индексы Кноделя) и стадии заболевания (степень фиброза) [6, 7, 8].

Что касается описторхозной инвазии, то специфических морфологических критериев поражения печени в настоящее время не выделено, и наиболее подробной работой в этом направлении является работа М.Тун [9, 10], где представлено качественное описание неспецифических процессов в печени при данном гельминтозе, основными критериями которой являются наличие воспалительно-пролиферативных изменений в желчных протоках и межуточной ткани в сочетании с холестазами и некротическими изменениями в ряде случаев.

Как правило, диагностика гепатита сопровождается еще дополнительными способами диагностики описторхоза: обнаружением яиц описторхисов в кале (метод Столла [11, 12]), в дуоденальном содержимом.

Однако эти способы имеют следующие существенные недостатки: информативность серологичеких методов в большей степени зависит от состояния иммунитета, вследствие чего специфические маркеры определяются далеко не всегда, часто имеют место ложноотрицательные результаты из-за высокой скорости мутации вирусов гепатита. Чувствительность ПЦР также далека от 100% вследствие большой вариабельности вирусного процесса - фаза репликации вируса гепатита В может без видимых причин переходить в интегративную и наоборот [13, 14, 15, 16]. И кроме того, результаты этого способа также значительно зависят от выраженности иммунного ответа, качества исполнения реакции.

В настоящее время вследствие значительного распространения описторхозной инвазии в Сибири (90-100% взрослого населения) и преимущественного поражения им гепатобилиарной системы крайне актуальной становится проблема диагностики сочетанного поражения печени: вирусных гепатитов с данным гельминтозом [17]. Вышеописанные методы в этом отношении обладают ограниченной информативностью, диагностируют только отдельные нозологические формы и не позволяют представить имеющуюся патологию в полном объеме, произвести точную и быструю диагностику, а следовательно, назначить адекватную терапию.

Так, в настоящее время известно, что вирусный гепатит С по морфологической картине очень близок к описторхозной инвазии, что, конечно, затрудняет диагностику сочетания этих заболеваний [2, 18].

Изучение проблемы сочетанного поражения печени при ХВГ и описторхозе наблюдается только в последние годы. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ Мигуськиной [2], заключающийся в проведении пункционной биопсии с последующим гистологическим исследованием биоптата и качественной его оценкой. Так, при наличии определенной гистологической картины: гиперплазия гладкой цитоплазматической сети, внутриклеточный холестаз с формированием и накоплением желчного пигмента и липофусцина, усложнение на синусоидальном полюсе рельефа микроворсинок и инвагинаций плазмолеммы с концентрацией здесь митохондриального компартмента диагностировали ХВГ В+С на фоне описторхоза. Однако данный способ имеет существенные недостатки. Работа проводилась без учета фазы биологического развития вируса (морфологическая картина значительно разнится в зависимости от фазы репликации или интеграции). Кроме того, в способе представлены только описательные качественные характеристики сочетанного поражения печени без статистически достоверных количественных критериев. Таким образом, перед нами стояла задача найти способ, дающий достоверные количественные критерии диагноза ХВГ В+С в сочетании с описторхозом, высокоспецифический, чувствительный с учетом фазы развития вируса.

Новую техническую задачу - повышение точности и информативности решают применением нового способа диагностики ХВГ В+С на фоне описторхоза, заключающийся в определении специфических вирусных антигенов и антител гепатитов В и С, с последующим проведением пункционной биопсии печени и морфологическим исследованием биоптатов, отличающийся тем, что морфологическое исследование проводят в стадию репликации вируса и при наличии интралобулярных гепатоцитов с пикнотизированными ядрами в относительном количестве более 4,58% диагностируют хронический вирусный гепатит В+С на фоне описторхоза.

Способ осуществляют следующим образом. Всем больным проводят исследование сыворотки крови на наличие ДНК HBV и РНК HCV методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) [5] наборами НПФ “Литех” (г. Москва). По результатам реакции пациентов относят к одной из шести этиологических групп.

Диагностку описторхоза проводят копроовоскопическим методом Горячева, а степень инвазии определяляют методом Столла (слабая степень инвазии, когда в 1 грамме кала число яиц описторхисов менее 1000, умеренная - от 1000 до 5000 и высокая - 5000 и более яиц) [12].

Всем пациентам с положительной ПЦР реакцией проводят морфологическое исследование биоптатов печени, полученных методом чрезкожной пункционной биопсии [6]. Забор материала осуществляют после исключения всех абсолютных и относительных противопоказаний и предварительного общеклинического исследования пациентов с обязательным контролем основных показателей гемостаза. Для получения биоптата использовался одноразовый набор “Hepafix” фирмы “Braun” (ФРГ) с внутренним диаметром иглы от 1,4 до 1,8 мм и длиной иглы 88 мм. Взятый для исследования фрагмент тотчас же помещался в фиксирующую жидкость, состоящую из 96-процентного спирта и формалина в соотношении 1/4. Препараты готовились по стандартной методике, заливались в парафин. Срезы толщиной 5-6 мкм исследовались с помощью следующих гистологических методик [6, 18].

1. Окраска гематоксилином и эозином.

2. Окраска пикрофуксином по Ван-Гизону коллагеновых волокон соединительной ткани стромы печени.

3. Окраска пиронином по Браше на РНК и ДНК.

4. ШИК-реакция по Мак-Манусу на гликоген и гликопротеиды.

5. Окраска на жир Суданом 3.

Биоптаты считали информативными при обнаружении 4-х и более портальных трактов, которые определяли как фокусы соединительной ткани в пределах паренхимы с полноценными триадами (портальная вена, печеночная артерия, желчный проток). Объем биоптатов составлял от 20 до 35 мм³.

Морфометрическое исследование производилось на установке, состоящей из светового микроскопа фирмы “Карл Цейс Йена” “Jenamed”, видеокамеры, с использованием компьютерной обработки полученных изображений.

Изображение поля зрения светового микроскопа вводилось в компьютер с помощью видеокамеры, калибровка была проведена с помощью линейки-микрометра. Для объективной оценки состояния печеночной ткани второй и третьей зон все гистологические и морфологические параметры изучались в каждом третьем поле зрения в пределах всего материала, а также исследовались все представленные портальные тракты, чтобы гарантировать точность исследования. Конечное линейное и оптическое увеличение после переноса изображения с помощью видеокамеры в компьютер составило ×600, ×1600.

Индекс гистологической активности (ИГА) гепатита и степень фиброза рассчитывали по Desmet V.J. и соавт. (1994) [19] (минимальная активность - от 1 до 3 баллов, слабая - от 4 до 8 баллов, умеренная - 9-12 баллов, высокая - 13-18 баллов; при наличии портального и перипортального фиброза он считался слабым, одной и более порто-портальных септ - умеренным, одной и более порто-центральных септ - тяжелым, наличие ложных долек - цирроз печени).

Проводилась качественная и количественная характеристика состояния печеночной ткани. Оценивались дистрофические процессы, а именно, гидропическая, жировая дистрофии, насыщенность гепатоцитов гликогеном, некроз (моноцеллюлярный, ступенчатый, мостовидный, очаговый интралобулярный), портальная и интралобулярная воспалительная инфильтрация, а также характер фиброза (портальный, перипортальный, порто-портальный, порто-центральный, очаговый интралобулярный, порто-лобулярный).

Количественная характеристика включала в себя анализ состояния интралобулярных гепатоцитов и печеночных клеток пограничной пластинки. За гепатоциты пограничной пластинки принимались клетки первой зоны, имеющие непосредственный контакт с портальным трактом. Оценка состояния гепатоцитов производилась вокруг всех портальных трактов исследуемого биоптата. Гепатоциты второй и третьей зон, не имеющие контакта с портальным трактом относили к интралобулярным, причем для объективности исследования оценивалось каждое третье поле зрения в пределах всего материала. Раздельной оценке в перипортальной и интралобулярной зонах подвергались дистрофические, некротические и регенераторные процессы, происходящие в гепатоцитах при хронических вирусных гепатитах.

Для оценки выраженности дистрофических процессов подсчитывалось относительное количество гепатоцитов, содержащих в своей цитоплазме жировые вакуоли мелкого, среднего и крупного калибров.

Гепатоциты, в ядрах которых была обнаружена конденсация хроматина с маргинальной локализацией, относились к гепатоцитам с “песочными” ядрами, и также подсчитывалось относительное количество их как интралобулярно, так вблизи портального тракта. Определялось относительное количество печеночных клеток, в которых ядра находились в состоянии сморщивания (пикноза), что указывало на гибель клетки путем апоптоза. Ядра гепатоцитов, превышающие размеры большинства более чем в 1,5 раза, расценивались как гипертрофированные и затем также подвергались количественной оценке. Гепатоциты с выраженной базофилией ядер относились к гиперхромным, а имеющие в цитоплазме 2 ядра - к двуядерным. Гепатоциты, имеющие уродливость ядер и ядра, форма которых отличалась от большинства, считали клетками с полиморфностью ядер. Количество гепатоцитов с вышеописанными изменениями рассчитывалось в процентах от числа клеток перипортальной и интралобулярной зон.

Количественной оценке подвергался воспалительный инфильтрат портальных трактов и внутри долек как на срезах, окрашенных эозином и гематоксилином, так и по Браше. Подсчитывалось абсолютное и относительное количество лимфоцитов, моноцитов, плазматических клеток, эозинофилов, нейтрофильных лейкоцитов, фибробластов во всех портальных трактах биоптата.

Полученные данные обрабатывались методами математической статистики с помощью статистических программных средств на персональном компьютере, и при наличии интралобулярных гепатоцитов с пикнотизированными ядрами в относительном количестве более 4,58% диагностировали хронический вирусный гепатит В+С на фоне описторхоза.

Результаты исследования были получены на основании интерпретации следующего клинического материала: 98 больных (77,2% мужчин и 22,8% женщин) хроническим вирусным гепатитом в репликативную фазу инфекции, разделенные по этиологическому признаку на 6 групп. Средний возраст больных 29±2,6 лет. В 1-ю гр. вошли 11 больных хроническим вирусным гепатитом В, во 2-ю - 12 больных хроническим вирусным гепатитом B в сочетании с хроническим описторхозом, в 3-ю - 18 больных хроническим вирусным гепатитом С, в 4-ю - 20 больных хроническим вирусным гепатитом С в сочетании с хроническим описторхозом, 5-ю гр. составили 18 больных хроническим вирусным гепатитом В+С и в 6-ю гр. вошли 19 больных хроническим вирусным гепатитом В+С в сочетании с хроническим описторхозом. Давность вирусного гепатита в среднем составила 3±0,5 года. Длительность описторхозной инвазии была равной в среднем 6±1,2 года. Степень описторхозной инвазии была слабой. Все группы были сопоставимы по полу, возрасту, давности вирусного гепатита, степени активности и фиброза (стадии хронизации), а группы с сопутствующим, хроническим описторхозом - по длительности и степени описторхозной инвазии.

Для выявления патогномоничных для каждой из групп морфологических признаков проведен дискриминантный анализ по 51 морфологическому критерию, в результате чего найден диагностический признак ХВГ В+С на фоне описторхозной инвазии - это процент интралобулярных гепатоцитов с пикнотизированными ядрами.

Полученные данные приведены в таблицах 1, 2, 3.

Как видно из таблицы 3, группа больных хроническим вирусным гепатитом В+С в сочетании с описторхозом (6 гр.) достоверно отличается по выбранному показателю от всех остальных групп (р<0,01).

Достоверность выбранной модели превышает 99% (р<0,0013). Для определения численных значений полученного критерия, позволяющих с большой вероятностью предполагать диагноз ХВГ В+С в сочетании с описторхозом, обратимся к таблице 1. Наибольшее значение показатель имеет в 6 гр.

Среднее арифметическое значение показателя в 6 гр. равно 6,74%, а ошибка среднего арифметического 1,08%. Согласно теории статистики, с вероятностью 95,5%, среднее значение величины будет находиться в пределах двойной ошибки средней арифметической, т.е. в нашем случае 6,74±2×1,08%. В итоге получаем числовое значение показателя: 6,74±2,16%. Нижняя граница признака соответствует 4,58%. Таким образом, с вероятностью 95,5% можно утверждать, что при определении по вышеописанной методике количества интралобулярных гепатоцитов с пикнотизированными ядрами более 4,58%, диагностируемое состояние является сочетанием ХВГ В+С в фазе репликации и хронического описторхоза.

Клинические примеры.

Пример 1. В ОКБ поступил больной М. 21 год, с предварительным диагнозом ХВГ В+С в фазе репликации. Больной предъявлял жалобы на общую слабость, тошноту, тяжесть в правом подреберье. В анамнезе неоднократная экстракция зубов, полостная операция с переливанием крови. Употребление наркотических средств и алкоголя отрицает. Регулярно употребляет в пищу речную рыбу. При объективном обследовании - легкая желтушность склер, отмечается увеличение печени - выступает из-под края реберной дуги на 2 см (размеры по Курлову 15-14-11 см), при пальпации печень - плотноватая, с гладкой поверхностью, слегка болезненная. Селезенка не увеличена. Другой патологии не выявлено.

В OAK - гиперэозинофилия - 6%. ОАМ - без патологии. Кал на яйца глист - Opistorchis fellineus. Исследование кала по методу Стола - 80 яиц в 1 гр фекалий - низкая степень инвазии. Биохимия крови: общий белок - 76 г/л; билирубин - 52 ммоль/л (прямой - 10 ммоль/л), ACT - 0,9; АЛТ - 1,5; глюкоза - 4,8 ммоль/л, ПТИ - 95%; ПТВ - 17(18 сек); фибриноген - 3,5 г/л; холестерин - 5,6 ммоль/л; щел. фосфотаза - 120 ME; тимоловая проба - 8,3. Заключение: гипербилирубинемия, синдром цитолиза - слабовыраженный. При серологическом исследовании крови выявлено HBeAg+, HBsAg+, antiBcor IgM, antiHBcor суммарный и HCV (and HCV IgG), что говорит о наличии сочетанной вирусной инфекции В+С в фазе репликации вирусов. При УЗИ органов брюшной полости выявлено увеличение печени, диффузное повышение ее эхоплотности. ЭКГ - вариант нормы. ЭГДС - антральный гастрит. На основании проведенного исследования выставлен диагноз сочетанного вирусного поражения печени: гепатит В+С в фазе репликации на фоне хронического описторхоза. Фаза репликации вируса подтверждена ПЦР (HCV РНК+, HBV ДНК+). В последующем больному была проведена пункционная биопсия печени с количественной и качественной оценкой биоптатов по предлагаемой методике. Заключение: гистологический индекс активности гепатита - 12, индекс фиброза - 1. При оценке биоптата выявлено наличие в поле зрения интралобулярных гепатоцитов со сморщенными - уменьшенными в 2-3 раза ядрами (с явлениями пикноза), количество которых составило 7,9% от общего количества интралобулярных клеток - апоптоз интралобулярных гепатоцитов. Окончательный клинический диагноз был сформулирован следующим образом: ХВГ В+С в фазе репликации, умеренной степени активности, стадия хронизации - 1, на фоне хронического описторхоза.

Приведенный клинический пример представляет собой один из многих клинических случаев, где наглядно представлено подтверждение вышеописанного способа диагностики, а именно наличие определенного количества интралобулярных гепатоцитов (>4,58%) в состоянии пикноза при диагнозе сочетанного заболевания: гепатита В+С на фоне описторхоза, что может служить дифференциально-диагностическим критерием этой микст патологии.

Больному была назначена интерферонотерапия в течение 1 года с последующим планированием дегельминтизации при достижении эффекта лечения (элиминация вируса, переход в стадию интеграции).

Пример 2. В ОКБ направлена больная С., 42 лет с диагнозом: хронический гепатит неясной этиологии. Проведено комплексное обследование, включающее общеклиническое, серологическое исследование крови, ПЦР. Обследование было дополнено УЗИ органов брюшной полости и ЭГДС. Предварительный диагноз: хронический гепатит B в стадии репликации. Для уточнения степени активности гепатита и степени фиброза следующим этапом была проведена пункционная биопсия по вышеописанной методике. Заключение ИГА - 9, ИФ - 1. Отчетливо в поле зрения биоптата регистрировались интралобулярные гепатоциты с явлениями апоптоза (пикнотизированные ядра) в количестве 6,6% от общего количества интралобулярных клеток. Опираясь на предложенный диагностический критерий, возникло подозрение о наличии не только вируса гепатита В, но и С инфекции. Встал вопрос и о возможной описторхозной инвазии. Больной была повторно проведена ПЦР на наличие HCV-PHK. Результаты подтвердили наличие С инфекции, а следовательно, сочетанной этиологии гепатита В+С в фазе репликации. Для поиска хронического описторхоза было проведено дуоденальное зондирование, в результате которого в пузырной порции выявлены единичные яйца описторхисов. То есть благодаря предложенному диагностическому критерию был продолжен диагностический поиск в нужном направлении и выставлен правильный диагноз.

Таким образом, данный способ диагностики с высокой точностью (до 95,5%) в ранние сроки позволяет диагностировать сложное сочетанное поражение печени, а именно ХВГ В+С и описторхоза, с которым приходится сталкиваться на практике наиболее часто, учитывая, что Сибирь является эндемическим районом по описторхозу. Точная постановка диагноза ведет к назначению адекватного, рационального лечения.

Источники информации

1. Логинов А.С., Царегородцева Г.М., Зотина Т.М. Иммунологическая диагностика хронических гепатитов // Тер. Архив. 1995, № 11, с.5-7.

2. Мигуськина Е.И. Патоморфология и клинические особенности хронического вирусного гепатита в сочетании с описторхозом: Автореф. дис. канд. мед. наук. - Новосибирск, 2000, - 28 с.

3. Менявцева Т.А., Ратнер Г.М., Колмакова М.В. С соавт. Диагностика острого и хронического описторхоза методом твердофазного ИФА // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии, 1995, № 1, с.48.

4. Михайлов М.И. Гепатит В. Лабораторная диагностика // Медицина для всех. 1996, № 1, с.6-7.

5. Тимощук Г.И., Тимощук О.А., Корзунина В.В., Пономарева М.В. Полимеразная цепная реакция. Принцип метода. Использование в клинико-диагностических лабораториях. Интерпретация результатов (Методические рекомендации). - Кемерово: Кузбассвузиздат, 1998, - 32 с.

6. Логинов А.С., Аруин Л.И. Клиническая морфология печени. - М.: Медицина, 1985, - 240 с.

7. Логинов А.С., Аруин Л.И., Шепелева С.Д. Пункционная биопсия в диагностике хронических заболеваний печени // Тер. Архив. 1996, № 2, с.5-7.

8. Подымова С.Д. Болезни печени. - М.: Медицина, 1998, - 704 с.

9. Тун М.А. Функционально-морфологические изменения печени у больных хроническим описторхозом: Дис. канд. мед. наук. - Томск, 1992, - 131 с.

10. Тун М.А.Хронический гепатит вирусной этиологии в эндемичном по описторхозу регионе // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии. - 1995, № 1, с.57-58.

11. Лепехин А.В., Мефодьев В.В., Филатов В.Г., Бужак Н.С. Эпидемиология, клиника и профилактика описторхоза. - Томск: Изд-во. Томского университета, 1992, - 232 с.

12. Яблоков Д.Д. Описторхоз человека. - Томск: Изд-во Томского ун-та, 1979, - 238 с.

13. Апросина З.Г. Последние достижения в изучении вирусных гепатитов: от молекулярной биологии к лечению вирусного гепатита В /Русский медицинский журнал 1996, т.4, № 3.

14. Майер Г.П. Гепатит и последствия гепатита: практическое руководство. Перевод с немецкого (под ред. Шептулина А.А.). - М.: ГЭОТАР, Медицина, 2000, - 432 с.

Михайлов М.И., Семененко Т.А. Внимание, гепатит В. // - Медицина для всех, 1999, № 2, с.10-11.

Сорисон С.Н. Вирусные гепатиты. - СПб.: Изд. Теза, 1998, 325 с.

17. Подображникова О.К., Михайлова О.В., Шукевич Т.М. и др. К вопросу о диагностике сочетанных форм описторхоза // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии. - 1995, № 1, с.51.

Пурлик И.Л. Клинико-морфологические особенности хронического вирусного гепатита в зависимости от типа вируса и наличия фоновой патологии: Дис. канд. мед. наук. - Томск, 2001, - 195 с.

19. Desmet V.I., Jerber M., Hoofuagle J. H., Manns M. et. all. Classification of chronic hepatitis: Diagnosus, grading and stading. // Hepatology. 1994, vol.19, p.1513-1520.

Изобретение относится к области медицины, в частности гастроэнтерологии, конкретно, к способам диагностики хронического вирусного гепатита И+С на фоне описторхоза. Сущность изобретения заключается в проведении морфологического исследования в стадии репликации вируса и при наличии интралобулярных гепатоцитов с пикнотизированными ядрами в относительном количестве более 4,5% диагностируют хронический вирусный гапатит И+С на фоне описторхоза. Преимущество изобретения заключается в повышении информативности и точности способа. 3 табл.

Способ диагностики хронического вирусного гепатита В+С на фоне описторхоза, включающий определение специфических антигенов и антител гепатитов В и С с последующим проведением пункционной биопсии печени и морфологическим исследованием биоптатов, отличающийся тем, что определяют стадию репликации вируса посредством исследования сыворотки крови на наличие ДНК (HBV) и РНК (НСV) методом ПЦР, морфологическое исследование биоптатов печени проводят у пациентов с положительной ПЦР реакцией и при наличии в биоптатах интралобулярных гепатоцитов с пикнотизированными ядрами в относительном количестве более 4,58% диагностируют хронический вирусный гепатит В+С на фоне описторхоза.