СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ ГЕПАТОЗАЩИТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 1998 года по МПК A61K35/00 

Изобретение относится к медицине и касается способа получения средства, обладающего гепатозащитным действием.

Известны способы получения веществ, обладающих гепатозащитным действием, - "Эссенциале" [М. Д. Машковский "Лекарственные средства", т.2, стр.46, изд-во "Медицина", 1987], "Карсил" и другие ["Лекарственные препараты зарубежных фирм в России", Справочник, М., изд-во "Астрафармсервис", 1993, стр. 660] . Однако известные способы получения гепатопротекторов липидной природы позволяют получить продукты, обладающие недостаточно высокой гепатозащитной активностью.

Наиболее близким способом является "Способ получения биологически активных веществ, обладающих гепатозащитным действием", путем экстракции иловых и сапропелевых грязей смесью этанола и хлороформа, в котором с целью усиления специфического действия концентрат биологически активных веществ дополнительно обрабатывают гексаном. [А.С. N 1260005, Б.И. N 36, 1986 г.]. Однако указанный способ позволяет получить продукт, обладающий также недостаточно высокой гепатозащитной активностью.

Задача настоящего изобретения - повышение биологической (гепатозащитной) активности целевого продукта липидной природы.

Способ осуществляют путем предварительной обработки нативной лечебной грязи спиртовым раствором щелочи до pH 8,5-9,0, экстракции обработанного сырья водой при соотношении сырье : экстрагент 1:(10-12) с интенсивным перемешиванием (1500 об/мин) в течение 15 мин при температуре 50-60^oC с последующим отделением экстракта от осадка, его упариванием в вакууме, обработкой сухого солевого концентрата хлороформом в соотношении концентрат : хлороформ 1:(3,5-5,0) и упариванием полученного хлороформного раствора в вакууме.

Предварительная обработка лечебной грязи спиртовым раствором щелочи до pH 8,5-9,0 позволяет повысить биологическую активность целевого продукта за счет разрушения белково-липидо-гуминового комплекса и последующего перехода органических веществ в водный экстракт.

Пример 1 (прототип). Процесс осуществляют в 3 стадии. 1 кг осадка, содержащего 50-60% воды, экстрагируют 2 л смеси этанолхлороформ (1:1) по объему в течение 5 мин при скорости перемешивания 1500 об/мин. Снижение скорости перемешивания от 1500 об/мин до 500 об/мин требует увеличения продолжительности процесса от 5 до 15 мин. Последующее разделение фаз осуществляют центрифугированием. Полученную трехкомпонентную систему - осадок:экстракт: вода - разделяют, сливая жидкую фазу в делительную воронку, а плотный осадок подвергают экстракции свежей порцией растворителя. Операция повторяется трижды. Экстракт липидов, отделенный от водного слоя в делительной воронке, концентрируют в вакууме до небольшого объема. Полученный липидный концентрат содержит значительное количество соэкстрагированных примесей в виде свободной серы и водорастворимых соединений, и следующая операция заключается в их удалении.

Экстракт липидов разбавляют 50 мл хлороформа, переносят в делительную воронку и промывают дистиллированной водой до отрицательной реакции на ионы Cl^- и SO^-- ₄ . Хлороформный раствор липидов сушат безводным сульфатом натрия, фильтруют и упаривают в вакууме до объема 25-30 мл.

Остаточное количество хлороформа из экстракта липидов удаляют в вакууме. Выход липидов 2-3 г/кг влажного осадка.

Пример 2 (заявляемый). 1 кг илового осадка натуральной влажности 60% обрабатывают при перемешивании 0,5 N спиртовым раствором щелочи до pH 8,5, а затем подвергают экстракции дистиллированной водой при соотношении сырье : экстрагент 1 : 10 при интенсивном перемешивании (1500 об/мин) в течение 15 мин при температуре 50^oC. Водный раствор отделяют от твердой фазы центрифугированием в течение 10 мин, упаривают в вакууме. Выход продукта составляет 75 г/кг влажного илового осадка. Затем полученный продукт обрабатывают хлороформом в количестве 225 мл и полученный экстракт, представляющий собой фракцию высокополярных липидов, упаривают в вакууме. Выход высокополярной фракции липидов (ВПЛ) составляет 16 мг/кг влажного илового осадка (табл. 1).

Примеры получения ВПЛ с различными вариантами используемых параметров приведены в табл. 1 (gримеры 3-10). Количественные характеристики приведены в табл. 1.

Целевой продукт (ВПЛ), полученный по заявляемому способу, представляет собой органические вещества высокополярных липидов, обладающие весьма высокой гепатозащитной активностью.

Биологические испытания заявляемого средства в качестве гепатопротектора проводили на 200 белых мышах обоего пола массой 20-22 г и 100 белых крысах-самцах массой 200-220 г, у которых вызывали острый гепатит отравлением CCl₄. Препаратом сравнения служил ЭПЛИР (прототип) (фракция полярных липидов озерного илового осадка, содержащая в качестве биологически активных веществ фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, сульфолипиды, тиоловые соединения, ксантофиллы, каротины и хлорофиллы) [Г.Ф. Большаков и др. А.C. N 1260005, БИ 36, 1986; А. C. Саратиков и др. Фармакология и токсикология, 1990, N 5, с. 42-45] . Мышам вводили внутрижелудочно в течение 6 дней ежедневно высокополярную фракцию липидов (ВПЛ) в дозах 0,0004; 0,004; 0,04; 0,4 мг/кг или ЭПЛИР в дозе 10 мг/кг и одновременно 1 мл/кг CCl₄ (все вещества применяли в масляном растворе). Крысы получали внутрижелудочно на протяжении 4 дней ежедневно ВПЛ в оптимальной дозе (0,4 мг/кг) или ЭПЛИР (30 мг/кг) и 1,25 мл/кг CCl₄. Контрольным животным вводили CCl₄ и эквиобъемное количество оливкового масла. Оценивали выживаемость животных, длительность сна, наступающего после внутрибрюшинной инъекции гексенала (60 мг/кг), гистологическое строение печени; подсчитывали количество некротизированных гепатоцитов, определяли с помощью методов количественной и полуколичественной гистохимии содержание липидов (по пятибалльной шкале), РНК, сульфгидрильных групп, гликогена, активность кислой фосфатазы (КФ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) [Э. Пиро. Гистохимия теоретическая и прикладная. М., 1962]; исследовали в сыворотке крови ретенцию бромсульфалеина (БСФ) через 45 мин после внутривенного вливания красителя, активность аланинаминотрансферазы (АЛАТ), аспартатаминотрансферазы (АСАТ) [В.Г. Колб, В.С. Камышников. Справочник по клинической химии. Минск, 1982], ЩФ [O. Bessey et al. Biol. Chem., 1946, vol. 164, N. 1, p. 321-329], фосфолипазы A [С.А. Тужилин, А.И. Салуэнья. Лабор. дело, 1975, N. 5, c. 334-336].

В экспериментах на машинах и крысах CCl₄ снижал выживаемость до 67-70%, удлинял гексеналовый сон в 2,5-2,6 раза, приводил к накоплению нейтрального жира в центролобулярных и перипортальных гепатоцитах (4,8 балла). У мышей ВПЛ в дозах 0,004-4,0 мг/кг сохраняли жизнь всем отравленным животным, сокращали длительность гексеналового сна до нормальной продолжительности (в 2,1-2,6 раза по сравнению с величиной при нелеченном CCl₄-гепатите), уменьшали степень ожирения печени до 2,1-3,2 баллов. В дозе 0,0004 мг/кг ВПЛ проявили меньшую гепатозащитную эффективность: укорачивали течение гексеналового сна лишь умеренно (в 1,5 раза), хотя и в достаточной мере сдерживали формирование стеатоза паренхимы печени (3,7 балла). ЭПЛИР (10 мг/кг) в аналогичном эксперименте нормализовал длительность гексеналового сна и уменьшал степень ожирения до 2,4 балла (табл. 2).

У крыс с CCl₄-гепатитом ВПЛ в дозе 0,4 мг/кг и ЭПЛИР в дозе 30 мг/кг предотвращали гибель всех экспериментальных животных и уменьшали жировую дистрофию печени до 2,6-2,8 балла. ВПЛ нормализовали продолжительность гексеналового сна (23,5 мин), ЭПЛИР сокращал гексеналовый сон в 2,1 раза по сравнению с показателем при нелеченном токсическом гепатите, хотя он протекал длительнее, чем у интактных животных (табл. 3).

При остром CCl₄-гепатите у крыс возникали глубокие нарушения морфогистохимических показателей печени в виде дискомплексации печеночных балок, расширения вокругсинусоидных пространство, макрофагально-лимфоцитарной инфильтрации, жировой, белковой дистрофии и колликвационного некроза гепатоцитов (6,2% всех клеток дольки), снижения содержания РНК, сульфгидрильных групп, исчезновения гликогена, роста активности маркера лизосом КФ и локализованной в эндотелии сосудов ЩФ. ВПЛ и ЭПЛИР проводили в этих условиях к нормализации гистоархитектоники печени, уменьшению количества гепатоцитов, подвергнутых дистрофии и некрозу (до 2,7-2,9%), увеличению количества РНК, сульфгидрильных групп, сохранения активности фосфатаз.

CCl₄ вызывал у крыс гиперферментемию с повышением в сыворотке крови активности АЛАТ в 10,7 раза, АСАТ в 3,2 раза, ЩФ в 2,1 раза, фосфолипазы А в 1,9 раза; ухудшал экскреторную функцию печени с ростом ретенции БСФ в 4,6 раза, содержание общего билирубина в 3,3 раза. Коэффициент глюкуронирования билирубина, вычисленный в процентах, как отношение концентрации связанного и общего пигмента, уменьшался при интоксикации CCl до 33,7% (в норме - 81,5%). ВПЛ противодействовали развитию гиперферментемии, снижая активность АЛАТ в 1,7 раза, АСАТ на 19%, ЩФ на 21%, фосфолипазы А в 1,6 раза, ЭПЛИР уменьшал активность ферментов печеночного происхождения в сыворотке крови примерно в такой же степени, как и ВПЛ: АЛАТ - в 1,6 раза, АСАТ - на 18%, ЩФ - на 20%, фосфолипазы А - в 1,7 раза (табл. 4).

Оба препарата липидов являются эффективными корректорами нарушения экскреторной функции печени. Они ослабляли ретенцию БСФ в 2,8-2,9 раза. ВПЛ снижали содержание общего билирубина до 64%, ЭПЛИР - до 77% (табл. 4).

Таким образом, при тяжелом CCl₄- гепатите ВПЛ в дозах 0,004-4,0 мг/кг у мышей и дозе 0,04 мг/кг у крыс оказывает выраженное гепатозащитное действие (устраняет жировую дистрофию гепатоцитов и нарушения антитоксической функции печени), не уступающее терапевтическому эффекту ЭПЛИРа в дозах 10-30 мг/кг. Следовательно, ВПЛ, получаемые по заявляемому способу, превосходят по гепатопротекторной активности ЭПЛИР (прототип) в опытах на мышах в 25-2500 раз, на крысах в 750 раз.

Способ относится к медицине и позволяет повысить биологическую активность средства. Иловый осадок обрабатывают спиртовым раствором щелочи до pH 8,5-9,0. Затем экстрагируют водой при соотношении сырье:экстрагент 1:(10-12) при температуре 50-60^oC, упаривают экстракт в вакууме. Затем полученный сухой экстракт обрабатывают хлороформом в соотношении 1 мас.ч: (3-5) об.ч. и хлороформную вытяжку упаривают с получением продукта. 4 табл.

Способ получения биологически активных веществ, обладающих гепатозащитным действием, путем экстракции илового осадка растворителем при перемешивании, отделении экстракта от плотной фазы осадка и упаривании экстракта в вакууме, отличающийся тем, что иловый осадок предварительно обрабатывают спиртовым раствором щелочи до pH 8,5 - 9,0, экстрагируют водой при соотношении сырье : экстрагент 1 : (10 - 12) соответственно при 50 - 60^oC, упаривают экстракт в вакууме, затем полученный сухой экстракт обрабатывают хлороформом в соотношении 1 мас.ч. : (3 - 5) об.ч. соответственно и хлороформную вытяжку упаривают с получением продукта.