СПОСОБ ИНАКТИВАЦИИ ПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ Российский патент 2004 года по МПК C12N1/14 C12N13/00 

Предлагаемое изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в медицине и ветеринарии для инактивации патогенных грибов, например, рода Candida.

Известно средство уничтожения патогенных грибов - антибиотик леворин. Недостатком этого препарата является необходимость многократных обработок для достижения надежного противогрибкового действия.

Известны также много других химических препаратов - антимикотиков (ламизил, низорал, батрафен и др. [1]), эффективных в большей или меньшей степени.

Недостатками этих препаратов являются необходимость многократного применения, быстрое развитие к ним грибной устойчивости и токсическое влияние на желудочно-кишечный тракт, кровь, мозг человека, а также вызывание аллергических реакций.

Известен также противогрибной препарат [2] в виде водного раствора микроэлементов.

Недостатком этого препарата является недостаточная эффективность, для повышения которой он применяется в комбинации с другими препаратами.

Известен также способ уничтожения инфекционных микроорганизмов путем их обработки электромагнитным излучением СВЧ-диапазона [3].

Недостатком этого способа является невозможность использования в медицине и ветеринарии для лечения грибковых заболеваний из-за необходимости использования мощных СВЧ-генераторов, оказывающих вредное воздействие на организмы человека и животных.

Известен также способ применения окислителей в качестве антимикотиков [4].

Недостатком этого способа является его недостаточная эффективность из-за низкой концентрации пероксидов в препаратах и сложная схема применения в течение длительного времени.

Известен также метод, выбранный авторами за прототип, лечения больных кожным кандидозом с применением фотохимиотерапии, основанной на сочетанном действии аммифурина (0,3% раствор) и ультрафиолетового облучения (УФО) [5]. Метод заключается в фотосенсибилизированной аммифурином, содержащим смесь фурокумаринов, и УФО инактивации клеток патогенных грибов Candida. Механизм фотосенсибилизированной фурокумаринами инактивации клеток различных организмов до конца не изучен, предполагается, что он основан преимущественно на способности этих соединений связываться с ДНК и в фотовозбужденном состоянии индуцировать в ней образование летальных сшивок. Предполагается также фотодинамический путь инактивации клеток с участием фурокумаринов, однако квантовый выход генерации синглетного кислорода этими соединениями очень низок (0,002-0,05).

Недостатками этого метода являются: отсутствие селективности между чувствительностью к фотосенсибилизированной фурокумаринами инактивации клеток грибов и животных и человека (применяется, в частности, для ПУВА-терапии псориаза); использование высокой (0,3%) токсичной концентрации препарата аммифурина; поглощение фотосенсибилизатором оптического излучения только в ультрафиолетовом (320-390 нм) диапазоне с низким пропусканием в биологической среде, что приводит к недостаточной эффективности метода лечения, особенно у больных с рецидивирующим течением кандидоза при плотных скоплениях клеток патогенных грибов и глубокими поражениями; необходимость в этой связи проведения многократных (в среднем 12) сеансов УФО и повторных курсов фотохимиотерапии; осложнения при суммированном действии в летние месяцы искусственного и естественного УФО облучения.

С помощью предлагаемого изобретения достигается технический результат, заключающийся в проявлении высокой эффективности и селективности инактивации патогенных грибов при однократном применении и использовании малых нетоксичных концентраций препаратов и доз излучения.

В соответствии с предлагаемым изобретением технический результат достигается тем, что в качестве фотосенсибилизатора выбирается химическое вещество хлориновой природы в концентрации 10-20 мкМ (0,001-0,002%), имеющее высокий квантовый выход генерации синглетного кислорода (0,5-0,7), обработку грибов которым ведут в течение 5 мин, после чего их облучают не менее 10 мин электромагнитным излучением диапазона 400-700 нм. В процессе облучения молекулы фотосенсибилизатора хлориновой природы в растворе под воздействием облучения многократно переходят в возбужденное состояние и продуцируют инактивирующие клетки микроорганизмов окислители - активные формы кислорода (АФК), преимущественно синглетный кислород. АФК индуцируют летальные окислительные деструктивные процессы в субклеточных структурах.

Способ осуществляется следующим образом.

В среду, содержащую культуры дрожжевых грибов рода Candida (С. albicans или С. guilliermondii), добавляют фотосенсибилизатор хлориновой природы в концентрации от 10 до 20 мкМ, выдерживают в течение 5 минут, после чего обрабатывают в течение не менее 10 минут электромагнитным излучением видимого (400-600 нм) диапазона с интенсивностью 5 мВт/см² или монохроматическим лазерным излучением дальнего красного диапазона с интенсивностью 5-20 мВт/см².

Оценку результатов инактивации проводят по определению колониеобразующей способности (выживаемости) дрожжевых грибов, подвергнутых действию фотосенсибилизатора и излучения, по сравнению с контрольными необработанными культурами или культурами, обработанными только фотосенсибилизатором или только излучением.

Пример 1. В трехсуточные, суспендированные в физиологическом растворе, чистые культуры С. guilliermondii ВСБ-656 в концентрации 10⁶ грибных клеток в миллилитре добавляют фотосенсибилизатор фотодитазин (глюкозаминовая соль хлорина е6) в концентрации 10-20 мкМ или ресуспендируют клетки в 0,3% растворе аммифурина и выдерживают 30 минут в темноте. Повторность опытов трехкратная. При воздействии 10-20 мкМ фотосенсибилизатора фотодитазина в отсутствие освещения 98-100% грибных клеток в культурах С. guilliermondii сохраняли способность к размножению, а при воздействии 0,3% аммифурина 100% грибных клеток ее теряли. Результаты экспериментов представлены в таблице 1.

Пример 2. В трехсуточные, суспендированные в физиологическом растворе, чистые культуры С. albicans (эталонный штамм АТСС 24433 из американской Коллекции типовых культур) или С. guilliermondii ВСБ-656 в концентрации 10⁶ грибных клеток в миллилитре добавляют фотосенсибилизатор фотодитазин (глюкозаминовая соль хлорина е6) в концентрации от 10 до 20 мкМ, выдерживают 5 минут и облучают 5-20 минут электромагнитным излучением видимого (400-600 нм) диапазона с интенсивностью 5 мВт/см², получаемого от ртутной лампы ДРШ-1000 в сочетании со светофильтрами ЖС-10 и СЗС-21. Повторность опытов трехкратная. При однократном сочетанном воздействии фотосенсибилизатора фотодитазина и излучения 400-600 нм до 97% грибных клеток в культурах С. albicans и до 100% - С. guilliermondii теряли способность к размножению. Результаты экспериментов представлены в таблице 2.

Пример 3. В трехсуточные, суспендированные в физиологическом растворе, чистые культуры С. albicans, свежевыделенные из клинического материала (штаммы 55 - из фекалий, 109 - из отделяемого задней стенкой глотки, 575 - из мокроты, 623 - из мочи), в концентрации 10⁶ грибных клеток в миллилитре добавляют фотосенсибилизатор фотодитазин (глюкозаминовая соль хлорина е6) в концентрации 10 мкМ, выдерживают 5 минут и облучают до 20 минут электромагнитным излучением видимого (400-600 нм) диапазона с интенсивностью 5 мВт/см², получаемого от ртутной лампы ДРШ-1000 в сочетании со светофильтрами ЖС-10 и СЗС-21. Повторность опытов трехкратная. Фоточувствительность (1/D₁₀, т.е. доза света, необходимая для достижения 10% уровня выживаемости грибных клеток в культурах или 90% уровня инактивации соответственно) свежевыделенных из клинического материала штаммов к предлагаемому способу инактивации близка к таковой для эталонного штамма С. albicans ATCC 24433. Результаты представлены в таблице 3.

Пример 4. В трехсуточные, суспендированные в физиологическом растворе, чистые культуры С. albicans (эталонный штамм ATCC 24433 из американской Коллекции типовых культур) или С. guilliermondii ВСБ-656 в концентрации 10⁶ грибных клеток в миллилитре добавляют фотосенсибилизатор 3-формил-3-девинилхлорин р6 в концентрации от 10 до 20 мкМ, выдерживают 5 минут и облучают до 20 минут монохроматическим лазерным излучением 690 нм с интенсивностью 20 мВт/см², получаемого от полупроводникового лазера на основе лазерного диода IDL-50-М-690. Повторность опытов трехкратная. При однократном сочетанном воздействии фотосенсибилизатора 3-формил-3-девинилхлорина р6 и излучения 690 нм до 81% грибных клеток в культурах С. albicans и до 88% - С. guilliermondii теряли способность к размножению. Результаты представлены в таблице 4,

Пример 5. В трехсуточную, суспендированную в физиологическом растворе, чистую культуру С. guilliermondii ВСБ-656 в концентрации от 0,5×10⁶ до 500×10⁶ грибных клеток в миллилитре добавляют фотосенсибилизатор 3-формил-3-девинилхлорин р6 в концентрации 10 мкМ, выдерживают 5 минут и облучают 20 минут монохроматическим лазерным излучением 690 нм с интенсивностью 20 мВт/см², получаемого от полупроводникового лазера на основе лазерного диода IDL-50-M-690, или электромагнитным излучением видимого (400-600 нм) диапазона с интенсивностью 5 мВт/см², получаемого от ртутной лампы ДРШ-1000 в сочетании со светофильтрами ЖС-10 и СЗС-21. За 100% принимают фоточувствительность дрожжей при концентрации 0,5×10⁶ клеток в миллилитре. Повторность опытов трехкратная. При использовании лазерного излучения 690 нм наблюдается более эффективная инактивация грибных культур с высокими концентрациями клеток. Результаты представлены в таблице 5.

Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод, что однократное сочетанное воздействие нетоксичных в темноте микромолярных (до 20 мкМ) концентраций фотосенсибилизаторов хлориновой природы и неинактивирующих клетки в отсутствие фотосенсибилизаторов доз низкоинтенсивного (5-20 мВт/см²) электромагнитного излучения видимого (400-600 нм) или дальнего красного (690 нм) диапазонов позволяет достичь высоких (до 97-100%) уровней инактивации культур дрожжевых грибов рода Candida. Фотосенсибилизированная инактивация животных клеток достигается при значительно более высоких интенсивностях и дозах излучения [6], что обеспечивает селективность предлагаемого способа.

Использование предложенного способа позволяет надежно инактивировать различные штаммы патогенных грибов С. albicans, в том числе свежевыделенные из клинического материала.

Внедрение способа фотосенсибилизированной хлоринами инактивации патогенных грибов в медицину поможет уменьшить все возрастающую распространенность грибковых заболеваний.

Количественно экономический эффект в настоящее время оценить трудно, однако предлагаемый способ включает применение низких концентраций фотосенсибилизаторов хлориновой природы отечественного производства, получаемых из дешевого растительного сырья, и дешевых источников низкоинтенсивного электромагнитного излучения.

Источники информации

1. Патент РФ № 2116066, МПК А 61 К 7/32.

2. Патент РФ № 2153876, МПК А 61 К 31/7135.

3. Патент РФ № 2098134, МПК A 61 L 2/12.

4. Патент РФ № 2008898, МПК А 61 К 9/06.

5. Бикбулатова Н.Н. Разработка патогенетически обоснованного метода лечения больных кожным кандидозом с использованием фотохимиотерапии. Автореферат диссертации. М. 1995 - прототип.

6. Zeina В., Greenman J., Corry D., Purcell W.M. Cytotoxic effects of antimicrobial photodynamic therapy on keratinocytes in vitro. Br. J. Dermatol., 2002; V. 146, N 4, Р. 568-573.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в медицине и ветеринарии для инактивации патогенных грибов. Способ включает обработку грибов инактивирующим веществом, фотосенсибилизатором хлориновой природы в концентрации 10-20 мкм. Обработку грибов ведут в течение 5 минут, после чего их облучают не менее 10 минут электромагнитным излучением диапазона 400-700 нм. Способ обеспечивает высокую эффективность и селективность инактивации при однократном применении и использовании малых нетоксичных концентраций препаратов и доз излучения. 5 табл.

Способ инактивации патогенных грибов, включающий обработку грибов инактивирующим веществом, отличающийся тем, что в качестве инактивирующего вещества выбирают фотосенсибилизатор хлориновой природы в концентрации 10-20 мкМ, обработку грибов которым ведут в течение 5 мин, после чего их облучают не менее 10 мин электромагнитным излучением диапазона 400-700 нм.