СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГИПЕР- БЕТА-ЭНДОРФИНИИ В ЦЕРЕБРОСПИНАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, биологии, нейрофизиологии и может быть использовано для диагностики гипер-β-эндорфинии в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ).

Эндорфины относятся к опиоидным пептидам, особой группе нейромедиаторов, обладающих морфиноподобным действием, регулирующих деятельность ЦНС, эндокринной, иммунной системы, сердечно-сосудистой, органов пищеварения. Наиболее активными являются β-эндорфины, которые запускают цепь нейрофизиологических и нейрохимических процессов в различных стрессовых ситуациях, обеспечивают антиноцицептивный (антиболевой) эффект (Эндорфины. - М., 1981; Ю.Ф.Игнатов, А.Т.Качан, Ю.Н.Васильев. Акупунктурная аналгезия. - Л., 1990; Т.Л.Демина, А.Н.Бойко, А.Н.Росельс и др. Исследование клеточного иммунитета и системы опиатных пептидов у больных рассеянным склерозом. В жур.: Неврология и психиатрия. - 1990. - №2. - С.19-24).

Доказана роль гиперэндорфинии в генезе психических и неврологических расстройств, нарушении мозгового кровообращения, в происхождении опухолей головного мозга, гипофиза, гипоталамуса, кишечника, в пристрастии к наркотикам (Е.О.Братин. Нейрохимические механизмы регуляции болевой чувствительности. - М., 1991; Л.В.Калюжный. Физиологические механизмы регуляции болевой чувствительности. - М., 1984; А.В.Леонов. Содержание опиоидных пептидов в плазме крови и цереброспинальной жидкости у больных ишемическим инсультом. Авт. реф. Канд. дис. М., 1987).

Известны способы оценки опиатной - эндорфинной системы после электростимуляции головного мозга, кишечника, акупунктуры, при психических и эндокринных заболеваниях, электроакупунктуры, которые заключаются в определении уровня эндорфинов в ткани головного мозга, ЦСЖ, в ткани кишечника, в плазме, сыворотке крови (Терениус Л., Померанц Б., Вюстер М. и др. В кн.: Эндорфины. - М., 1981. - С.309-325, 344-349; Л.В.Калюжный. Физиологические механизмы регуляции болевой чувствительности. - М., 1984. - С.70-71, 170-171, 176-177, 153-178).

Определение уровня эндорфинов в биологических тканях и жидкостях осуществляют способом жидкостной хроматографии, радиоиммунологическим, радиорецепторными тестами, кристаллоскопическим способом (Д.Мик, Т.Бохан. Использование жидкостной хроматографии под высоким давлением для изучения энкефалинов. В кн.: Эндорфины. - М., 1981. - С.148-154; А Кил X. с соавт. Биохимическое, фармакологическое и аналитическое исследование. В кн.: Эндорфины. - М., 1981. - С.131-142; Шварц Н. с соавт. Содержание эндорфинов в стриатуме, определяемое радиорецепторным и радиоиммунологическим методами. В кн.: Эндорфины. - М., 1981. - С.248-253; В.Н.Славнов, Г.В.Валуева, Е.В.Эпштейн и др. Радиоиммунологическое определение β-эндорфина и β-липотропина в крови. Журн. “Медицинская радиология” - 1982. - №4. - С.45-49; Л.В.Савина, С.А.Павлищук, В.Ю.Самсыгин. Способ определения гипер-бета-эндорфинемии. Патент Рос. Фед. №250111 - М., 2000).

Аналог

Определение опиатов (эндорфинов) хроматографическим способом.

Этапы определения

1. Подготовка проб, содержащих опиаты путем их экстракции органическими реактивами.

2. Очистка пробы с последующим растворением остатка в растворителе или подвижной фазе.

3. Расчет параметров градуированной характеристики, калибровка колонки.

4. Определение количества элюирующих соединений с использованием детекторов.

5. Помещение в хроматограф, разделение в его системе.

6. Математические расчеты.

Недостатки способа

1. Трудное извлечение опиатов из биоматериала при помощи экстрагируемых веществ, нарушение нативности биоматериала, снижение достоверности результатов.

2. Применение различных способов очистки пробы.

3. Использование сложного устройства в виде хроматографа.

4. Высокие материальные затраты.

Все выше изложенное затрудняет широкое применение способа хроматографии.

Прототип

Количественное определение β-эндорфина в ЦСЖ по содержанию Эндотелина-1 (ЕТ-1) иммуноферментным способом с использованием энзимосвязанного иммуносорбентного набора DSL-10-5100 ACTIVE ELISE (GENERAL PROTOCOL FOR РЕРТIDЕ ENZYME IMMUNOASSAY) Range: 0-25 ng/ml standard curve. PENINSULA LABORATORIES, INS. 601 Taylor Way. San Carlos, CA 94070. Internet web site: www.penlabs.com.: Enzyme Immunoassay Techniques, An Overview. Porstmann, T. and Kiessig, S.T.Journal of Ymmunological Methods, 150 (1992) 5-21.

Способ осуществляют следующим образом:

- сбор и подготовка образцов согласно общему протоколу иммуноферментного анализа пептидов;

- ЦСЖ центрифугируют и замораживают в течение часа до - 70°С;

- используют иммуноферментный набор DSL-10-5100 ACTIVE ELISE, который содержит образцы: стандарты контроля и образцы плазмы с биотинилованным анти-ЕТ антителом определенной специфичности, выращенные в колодцах микротитрования;

- после промывают колодцы;

- обрабатывают стрептовидином - меченным ферментом - пероксидазой хрена;

- образцы выдерживают в термостате с субстратом тетраметилбенцидина, затем добавляют раствор, прекращающий окисление;

- определяют степень энзиматического оборота субстрата измерением поглощения двойной волны при 450 и 620 nm (измеренное поглощение прямо пропорционально концентрации присутствующего ЕТ-1 в пробах);

- используют набор стандартов ЕТ-1 для построения стандартной кривой поглощения и определения концентрации ЕТ в пробах;

- строят стандартную кривую, которая имеет сигмовидную форму, показывающую взаимоотношение между концентрацией пептида и соответствующей абсорбцией;

- определяют концентрацию пептида в пробе путем помещения оптимальной плотности пробы на ось Y стандартной кривой и построения диаграммы;

- сопоставляют диаграммы и подсчитывают результаты с помощью компьютерной программы;

- сравнивают полученные результаты с нормой.

Недостатки способа:

- нарушение нативности ЦСЖ (центрифугирование, замораживание до -70°С);

- применение иммуноферментного набора, набора стандартов;

- использование компьютерной программы;

- трудоемкость исполнения;

- высокие материальные затраты.

Задачи предлагаемого изобретения:

- повышение достоверности показателей контроля за стимуляцией эндорфинной системы;

- повышение информативности;

- упрощение способа приготовления пробы, сокращение стоимости диагностики;

- экспресс-диагностика активации эндогенной опиатной системы по выбросу β-эндорфина.

Сущность изобретения заключается в том, что пробу ЦСЖ кристаллизуют путем высушивания при Т=+18-20°С в течение 1-1,5 часов и при условии наличия кристаллов в виде зерен, сферолитов, дендриторазветвленных сферолитов, дендритов, лучистых агрегатов при микроскопировании их в поляризованном свете с кварцевым компенсатором определяют гипер-β-эндорфинию.

Способ осуществляют следующим образом

1. В положении больного на левом боку с соблюдением правил асептики и антисептики под предварительной анестезией кожи 0,5% раствором новокаина 5,0 мл в промежутке между III и IV поясничными позвонками производят поясничный прокол.

2. Для исследования берут 0,5-0,8 мл ЦСЖ.

3. Тарированной пипеткой ЦСЖ в виде капель, каждая объемом 0,01-0,02 мл наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом.

4. Сушат при Т=+18-20°С в течение 1-1,5 часов.

5. Под микроскопом в поляризованном свете с кварцевым компенсатором изучают картину кристаллизации и при наличии в препарате зерен, сферолитов, дендриторазветвленных сферолитов, дендритов, лучистых агрегатов диагностируют гипер-β-эндорфинию.

Нами предварительно были приготовлены модельные композиты (МК) из ЦСЖ здорового человека, обогащенной β-эндорфином в различных концентрациях: 9,5 ng/ml, 10 ng/ml, 11 ng/ml, 12 ng/ml, 13 ng/ml, 15 ng/ml, 25 ng/ml, 50 и 60 ng/ml.

В зависимости от концентрации β-эндорфин кристаллизовался определенным образом в МК, фиг.1-5.

На фиг.1а, б представлены кристаллограммы: зерна, концентрация β-эндорфина 9,5-10 ng/ml.

На фиг.2а, б представлены кристаллограммы в виде зерен и лучистых агрегатов (а, зерна, концентрация - 11 ng/ml), в виде сферолитов (концентрация - 12 ng/ml).

На фиг.3а, б приведены кристаллограммы МК в виде дендриторазветвленных сферолитов (а, концентрация - 13 ng/ml) и дендритов (б, концентрация - 15 ng/ml).

На фиг.4а, б приведены дендриторазветвленные сферолиты (концентрация - 25 ng/ml).

На фиг.5а, б приведены кристаллограммы МК в виде лучистых агрегатов (а - концентрация - 50 ng/ml, б - концентрация - 60 ng/ml).

Апробация способа подтверждена на 318 больных.

Примеры.

Пример 1, фиг.6. Б-ой Б., история болезни (ИБ) №1018, DS: Ишемический инсульт в бассейне левой средней мозговой артерии с моторной дисфазией, правосторонним умеренным гемипарезом. На фиг.6 приведена КГ ЦСЖ. Видны сферолиты.

Технология. Б-ому произведена спинномозговая пункция (СМП), взято 0,5 мл ЦСЖ. Ее капли, каждая объемом 0,01 мл, нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным. Препарат высушили в термостате при Т=+18°С на протяжении часа и изучили в поляризованном свете с кварцевым компенсатором. Найдены сферолиты, которые совпали с КГ модельного композита.

Одновременно в ЦСЖ иммуноферментным способом определили содержание β-эндорфина оно оказалось повышенным и составило 12 ng/ml (норма 9,0±0,6 ng/ml). Гипер-β-эндорфиния в ЦСЖ подтвердилась.

Пример 2, фиг.7. Б-ой Т., ИБ №218, DS: Инфаркт в лобно-височной области справа, левосторонний гемипарез. На фиг.7 приведены зерна, лучистый агрегат, дендрит, дендриторазветвленный сферолит.

Технология. Б-ому Т. сделали СМП, на исследование взяли 0,6 мл ЦСЖ, капли объемом 0,02 мл нанесли на предметное стекло, покрыли покровным и высушили в термостате при Т=+19°С на протяжении 1,5 часа. Препарат изучили в поляризованном свете с кварцевым компенсатором и сравнили с МК. Присутствуют зерна, лучистый агрегат, дендрит и дендриторазветвленный сферолит. Одновременно в ЦСЖ определили уровень β-эндорфина, он оказался повышен и составил 14,5 ng/ml. Гипер-β-эндорфиния подтвердилась.

Пример 3, Фиг.8. Б-ой У., ИБ №433, DS: Ишемический инсульт в вертебробазилярном бассейне справа, атактический синдром. На фиг.8 присутствуют зерна, сферолиты, дендриторазветвленные сферолиты.

Технология. Б-ому У. сделали СМП, на исследование взяли 0,7 мл ЦСЖ, капли объемом 0,02 мл нанесли на предметное стекло, покрыли покровным и высушили в термостате при Т=+20°С на протяжении 1 часа. Препарат изучили в поляризованном свете с кварцевым компенсатором и сравнили с МК. Присутствуют зерна, сферолиты и дендриторазветвленные сферолиты. Одновременно в ЦСЖ определили концентрацию β-эндорфина, он оказался повышенный - 14,5 ng/ml, гипер-β-эндорфиния подтвердилась.

Пример 4, фиг.9 Б-ой И., ИБ №1549, DS: Закрытая черепно-мозговая травма. Ушиб головного мозга средней степени тяжести. На фиг.9 присутствуют зерна, сферолиты, дендриторазветвленные сферолиты.

Технология. Б-ому И. произведена СМП. Взято 0,8 мл ЦСЖ, ее капли, каждая объемом 0,01 мл, нанесли на предметное стекло, покрыли покровным и высушили в термостате при Т=+18°С на протяжении 1 часа, полученный препарат сравнили с МК, исследовав его в поляризованном свете с кварцевым компенсатором. Найдены зерна, сферолиты и дендриторазветвленные сферолиты. Одновременно в ЦСЖ определили уровень β-эндорфина, он оказался повышен и составил 29 ng/ml. Гипер-β-эндорфиния подтвердилась.

Пример 5, фиг.10. Б-ая К., ИБ №214, DS: Опухоль гипофиза. На фиг.10 присутствуют дендриты, дендриторазветвленные сферолиты.

Технология. Б-ой К. произвели СМП, взяли 0,6 мл ЦСЖ и в каплях (0,01 мл) нанесли на предметное стекло, покрыли покровным, высушили в термостате при Т=+19°С на протяжении 1 часа, образец сравнили с МК, исследовав его в поляризованном свете с кварцевым компенсатором. Присутствуют дендриты, дендриторазветвленные сферолиты. Исследовали содержание β-эндорфина, которое составило - 32 ng/ml. Гипер-β-эндорфиния подтвердилась.

Пример 6, фиг.11. Б-ой Ц., №1129, DS: Последствия перенесенного ишемического инсульта в бассейне правой средней мозговой артерии с левосторонним гемипарезом, нарушением функции тазовых органов. Б-ому произвели сеанс акупунктуры. На фиг.11 видны зерна, дендриты, сферолиты, дендриторазветвленные сферолиты.

Технология. Б-ому Ц. после сеанса акупунктуры произвели СМП, взяли на исследование 0,5 мл ЦСЖ, капли которой, объемом 0,02 мл каждая, нанесли на предметное стекло, покрыли покровным и высушили в термостате при Т=+20°С на протяжении 1 часа. Препарат исследовали в поляризованном свете с кварцевым компенсатором, сравнили с МК. Найдены зерна, сферолиты, дендриты, дендриторазветвленные сферолиты. В ЦСЖ определили уровень β-эндорфинов, который был повышен - 27 ng/ml. Гипер-β-эндорфиния подтвердилась.

Пример 7, фиг.12. Б-ой А., ИБ №113, DS: аденома гипофиза, акромегалия. На фиг.12 приведены зерна, сферолиты, дендриторазветвленные сферолиты, дендриты.

Технология. Б-ому А. сделали СМП, взяли 0,8 мл ЦСЖ, которую в каплях, каждая объемом 0,02 мл, нанесли на предметное стекло, покрыли покровным и высушили в термостате при Т=+20°С на протяжении 1 часа. Образец исследовали в поляризованном свете с кварцевым компенсатором и сравнили с МК. Видны зерна, сферолиты и дендриторазветвленные сферолиты, дендриты. Уровень β-эндорфина, оказался высокий - 25 ng/ml. Гипер-β-эндорфиния подтвердилась.

Пример 8, фиг.13. Б-ая О., ИБ №2196, DS: Климакс. Климактерический синдром периода менопаузы. Подозрение на микроаденому гипоталамуса. На фиг.13 видны лучистые агрегаты.

Технология. Б-ой О. произвели СМП, взяли 0,8 мл ЦСЖ, которую в каплях, объемом 0,01 мл, нанесли на предметное стекло, покрыли покровным и высушили в термостате при Т=+18°С на протяжении 1,5 часа. Пробу исследовали в поляризованном свете с кварцевым компенсатором и сравнили с МК. Присутствуют лучистые агрегаты. Уровень β-эндорфина в ЦСЖ был равен 55 ng/ml. Гипер-β-эндорфиния подтвердилась. Преимущества предлагаемого способа:

- упрощение операции подготовки биологического материала для исследования,

- отсутствие применения сложных реагентов и технологических устройств,

- экологическая выгода,

- достоверность полученных результатов,

- возможность экспресс-диагностики.

Изобретение относится к медицине, а именно к нейрофизиологии, и предназначено для экспресс-диагностики гипер-β-эндорфинии в цереброспинальной жидкости. Пробу ЦСЖ кристаллизуют путем высушивания при Т=+18-20°С в течение 1-1,5 часов. Препарат исследуют в поляризованном свете с кварцевым компенсатором. При наличии в препарате кристаллов в виде зерен, сферолитов, дендриторазветвленных сферолитов, дендритов, лучистых агрегатов диагностируют гипер-β-эндорфинию. Способ позволяет упростить и повысить точность диагностики. 13 ил.

Способ диагностики гипер-β-эндорфинии в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), отличающийся тем, что пробу ЦСЖ кристаллизуют путем высушивания при Т=+18-20°С в течение 1-1,5 ч и при условии наличия кристаллов в виде зерен, сферолитов, дендриторазветвленных сферолитов, дендритов, лучистых агрегатов при микроскопировании их в поляризованном свете с кварцевым компенсатором определяют гипер-β-эндорфинию.