СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИПЕР-БЕТА-ЭНДОРФИНИИ В ОРГАНИЗМЕ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2008 года по МПК A61B10/00 G01N33/74 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, биологии, нейрофизиологии и может быть использовано для диагностики гипер-бета-эндорфинии в организме человека.

Эндорфины относятся к опиоидным пептидам, особой группе нейромедиаторов, обладающих морфиноподобным действием, регулирующих деятельность ЦНС, эндокринной, иммунной системы, сердечно-сосудистой, органов пищеварения. Наиболее активными являются β-эндорфины, которые запускают цепь нейрофизиологических и нейрохимических процессов в различных стрессовых ситуациях, обеспечивают антиноцицептивный (антиболевой) эффект (Эндорфины. - М., 1981; Ю.Ф. Игнатов, А.Т. Качан, Ю.Н. Васильев. Акупунктурная анальгезия. - Л., 1990; Т.Д. Демина, А.Н. Бойко, А.Н. Росельс и др. исследование клеточного иммунитета и системы опиатных пептидов у больных рассеянным склерозом. В жур.: Неврология и психиатрия. - 1990. - №2. - С.19-24).

Доказана роль гиперэндорфинии в генезе психических и неврологических расстройств, нарушения мозгового кровообращения, в происхождении опухолей головного мозга, гипофиза, гипоталамуса, кишечника, в пристрастии к наркотикам (Е.О. Братин. Нейрохимические механизмы регуляции болевой чувствительности. - М., 1991; Л.В. Калюжный. Физиологические механизмы регуляции болевой чувствительности. - М., 1984; А.В. Леонов. Содержание опиоидных пептидов в плазме крови и цереброспинальной жидкости у больных ишемическим инсультом. Авт. реф. Канд. дис. М., 1987).

Выброс эндорфинов происходит из глубинных структур головного мозга (гипоталамус, гипофиз, лимбикоретикулярный комплекс, стриатум), из спинномозговой жидкости, кишечника, из органов пищеварения, сердца. Эндорфины током крови разносятся по всему организму, оказывая определенное биологическое действие на клетки и ткани, выполняя роль межклеточных и межтканевых нейрорегуляторов.

Известны способы оценки опиатной - эндорфинной системы после электростимуляции головного мозга, кишечника, акупунктуры, при психических и эндокринных заболеваниях, электроакупунктуры, которые заключаются в определении уровня эндорфинов в ткани головного мозга, ЦСЖ, в ткани кишечника, в плазме, сыворотке крови (Терениус Л., Померанц Б., Вюстер М. и др. в книге: Эндорфины. - М., 1981. - С.309-325, 344-349; Л.В. Калюжный. Физиологические механизмы регуляции болевой чувствительности. - М., 1984. - С.70-71, 170-171, 176-177, 153-178).

Определение уровня эндорфинов в биологических тканях и жидкостях осуществляют способом жидкостной хроматографии, радиоиммунологическим, радиорецепторным тестами, кристаллоскопическим способом (Д. Мик, Т. Бохан. Использование жидкостной хроматографии под высоким давлением для изучения энкефалинов. В кн.: Эндорфины. - М., 1981. - С.148-154; А. Кил X. с соавт. Биохимическое, фармакологическое и аналитическое исследование. В кн.: Эндорфины. - М., 1981. - С.131-142; Шварц Н. с соавт. Содержание эндорфинов в стриатуме, определяемое радиорецепторным и радиоиммунологическим методами. В кн.: Эндорфины. - М., 1981. - С.248-253; В.Н. Славнов, Г.В. Валуева, Е.В. Эпштейн и др. Радиоиммунологическое определение β-эндорфина и β-липотропина в крови. Журн. «Медицинская радиология» 1982. - №4. - С.45-49; Л.В. Савина, С.А. Павлищук, В.Ю. Самсыгин. Способ определения гипер-бета-эндорфинемии. Патент Рос. Фед. №250111. - М., 2000). Савина Л.В., Музлаев Г.Г., Волосникова Н.Н. Способ диагностики гипер-бета-эндорфинемии в цереброспинальной жидкости. Патент Рос. Фед. №2230320. - М., 2003.

Главные этапы определения эндорфинов заключаются в экстрагировании эндорфинов из тканей и биологических жидкостей и сочетании процедуры экстракции с радиорецепторным и радиоиммунологическим методами.

Основные этапы определения опиатов (эндорфинов) хроматографическим способом

1. Подготовка проб, содержащих опиаты, путем их экстракции органическими растворителями.

2. Очистка пробы с последующим растворением остатка в растворителе или подвижной фазе.

3. Расчет параметров градуированной характеристики, калибровка колонки.

4. Определение количества элюирующих соединений с использованием детекторов.

5. Помещение в хроматограф, разделение в его системе.

6. Математические расчеты.

Недостатки способа

1. Трудоемкое извлечение опиатов из биоматериала при помощи экстрагируемых веществ, что нарушает их нативность.

2. Применение различных способов очистки пробы.

3. Использование сложного устройства в виде хроматографа.

4. Высокие материальные затраты.

Все вышеизложенное затрудняет широкое применение способа хроматографии.

Радиорецепторное тестирование основано на конкуренции эндорфинов с Н3-опиатами за связывание с мембранами мозга. Для этого используют препараты из тканевых экстрактов и меченые лиганды Н3-мет-энкефалинов, что затрудняет широкое использование теста в оценке контроля стимуляции опиатной системы при лечении методами рефлексотерапии.

Основным способом исследования β-эндорфинов является радиоиммунологический. Но определение содержания β-эндорфинов этим способом сопряжено со значительными трудностями, обусловленными 100%-ным перекрестным связыванием специфических антител с β-эндорфином и β-липотропином.

Кроме того, меченый β-эндорфин, использующийся при радиоиммунологическом определении, в значительном количестве связывается с белками крови, что сдвигает равновесие в радиоиммунологической системе и искажает конечные результаты.

В качестве прототипа для определения в сыворотке крови нами использовано радиоиммунологическое определение β-эндорфина в крови. (В.Н. Славнов, Г.В. Валуева, Е.В. Эпштейн, Е.В. Лучицкий, А.А. Яковлев. Радиоиммунологическое определение β-эндорфина и β-липотропина в крови. В жур. «Медицинская радиология», 1982, №4, С.45-49).

Основные этапы способа

1. Экстракция β-эндорфина:

а) приготовление комплекса сефароза - антитела для β-эндорфина;

б) смешивание плазмы с суспензией сефароза - антитела;

в) встряхивание суспензии с плазмой в течение 2 ч при комнатной температуре;

г) отмывание комплекса плазмы - сефароза - антитела 0,01 М боратным буфером, содержащим 0,1% альбумина на бычьей сыворотке и трилон Б.

2. Элюирование гормонов:

а) добавление к осадку, содержащему нейропептиды, 0,1 М уксусной кислоты, центрифугирование и фильтрация через пластиковые колонки со стекловатой;

б) элюирование гормонов 0,001 М соляной кислотой и дважды 0,1 М соляной кислотой, фильтрация через пластиковые колонки к первоначальным фильтрам. Лиофилизация фильтрата. Растворение высушенных элюатов 0,1% боратным с 0,1% альбумином на бычьей сыворотке.

3. Отделение β-липотропина от β-эндорфина в полученных растворенных сухих остатках с помощью сефарозы с антителами для β-липотропина:

а) приготовление комплекса сефароза - антитела для β-липотропина: смешивание части элюата с комплексом сефароза - антитела для β-липотропина и встряхивание в течение 4 ч при комнатной температуре;

б) цетрифугирование и определение супернатанта, содержащего β-эндорфин.

4. Определение с помощью радиоиммунологических наборов в растворенных сухих остатках содержания β-эндорфина и β-липотропина и супернатанте, полученном после разделения нейропептидов и только β-эндорфина.

При окончательном расчете содержания β-липотропина получали следующим образом (β-эндорфин и β-липотропин) - эндорфин.

Недостатки способа:

1. Необходимость в экстракционных наборах из жидкостей.

2. Сложность экстракции β-эндорфина и его отделения от β-липотропина.

3. Элюирование гормонов и лиофилизация фильтрата.

4. Нарушение нативных свойств плазмы (сыворотки) и опиатов.

5. Наличие дорогостоящих радиоиммунологических наборов.

6. Длительный этап определения содержания β-эндорфинов (свыше 6 часов).

Все вышеизложенное затрудняет определение β-эндорфинов.

Задачи предлагаемого изобретения:

1. Повышение достоверности показателей контроля за стимуляцией эндорфинной системы.

2. Повышение информационности.

3. Упрощение способа и уменьшение стоимости его использования.

4. Экспесс-диагностика активации эндогенной опиатной системы (выброс β-эндорфинов).

5. Изучение структуры биологической тест-системы (БТС), возникающие при регистрации излучения тока крови по пульсу человека, обогащенного β-эндорфинами.

Сущность изобретения заключается в том, что для экспресс-определения гипер-бета-эндорфинии в организме человека готовят биологическую тест-систему (БТС), состоящую из композиции 0,1% водного раствора аминокислот, взятых в равных пропорциях (аспарагиновая, аланин, валин, серин, глицин, тирозин, глютаминовая, треонин), 0,5% водного раствора дофамина, 0,5% водного раствора гистамина, 12% водного раствора сернокислой магнезии в соотношении 3:2:1:4, которую наносят на покровное стекло, выдерживают его в зоне проекции пульса 4-5 мин, сушат в термостате при Т=+(18-20)°С в течение 2-3 мин, изучают структуру в поляризованном свете с кварцевым компенсатором и при наличии в пробе сферолитов - радиально-лучевых и/или лотосовидных определяют гипер-бета-эндорфинию.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Готовят биологическую тест-систему (БТС), состоящую из композиции 0,1% водного раствора аминокислот, взятых в равных пропорциях (аспарагиновая, аланин, валин, серин, глицин, тирозин, глютаминовая, треонин), 0,5% водного раствора дофамина, 0,5% водного раствора гистамина, 12% водного раствора сернокислой магнезии в соотношении 3:2:1:4.

2. Тарированной пипеткой БТС объемом 0,01-0,02 в виде дорожки наносят на покровное стекло размером 2×2 см, помещают на 4-5 мин на зону проекции пульса, сушат в термостате при Т=+(18-20)°С на протяжении 2-3 мин, изучают в поляризованном свете с кварцевым компенсатором (КК).

3. При наличии в пробе сферолитов - радиально-лучевых и/или лотосовидных определяют гипер-бета-эндорфинию.

Разработанная нами БТС - сложная система, обладает способностью к самоорганизации и высокой структурно-пространственной ориентацией. Входящие в ее состав аминокислоты формируют клеточное ядро (ДНК и РНК). И аминокислоты и нейромедиаторы (дофамин, гистамин) сами являются источниками информации. Обладая свойствами жидких кристаллов и регистрируя излучения биообъектов, они тем самым воспринимают и передают информацию об электронно-конформационных взаимодействиях, протекающих в самих объектах в виде определенных структур (Булиган И.В. Жидкокристаллический порядок в биологических материалах. - В кн. Жидкокристаллический порядок в полимерах. М., 1981; Савина Л.В. Кристаллические структуры сыворотки крови здорового и больного человека. Краснодар, 1999; Савина Л.В. с соавт. Патент на изобретение №2255336. Способ экспересс-диагностики хронического панкреатита. М., 2001.; Савина Л.В. с соавт. Патент на изобретение №2271001. Способ экспересс-идентификации фарма- и парафармацевтиков, вводимых в организм человека. М., 2006).

Кровь - это разновидность биологического жидкого кристалла, свойства которого ей сообщают ее компоненты, в том числе и Эндорфины (Бернал Дж., Карлайл С.К. Поле охвата обобщенной кристаллографии // Кристаллография. 1968. T III. №5 С.927-951). Кровь обладает высокой оптической активностью, а перестройка молекулярных процессов и переход их на новый метаболический уровень заканчиваются за несколько минут (Н.В. Красногорская с соавт. Некоторые электрические свойства крови и ее изменение под действием электромагнитных полей. - В кн.: Электромагнитные поля в биосфере. Т.II. С.89-97. М., 1984).

Предложенная нами БТС - модель in vitro способна отражать течение обменных процессов в организме человека. БТС, сканируя пульс, осуществляет тем самым регистрацию излучения, обусловленного ходом метаболических процессов, перенос энергоинформационной структуры, осуществляемый током движущейся крови. Сама кровь при ее движении по сосудистому руслу обладает высокой способностью к омагничиванию (А.Л. Чижевский. Структурный анализ движущейся крови. М., 1959).

Пульс-зона проекции лучевой артерии - это «зеркало» всех протекающих в организме человека обменно-энергетических процессов. В классической китайской медицине известно о 60 видах пульса (Трактат НАН-ЦЗИН; Руководство по компьютерной пульсовой диагностике. М., 2001).

Помещая на пульс пластину с нанесенной на нее БТС, мы регистрируем излучение пульса, обусловленное движущейся кровью, переносящей молекулы биологически активного вещества (β-эндорфин). Это излучение формирует определенные структуры, отражающие структурно-пространственную ориентацию хода обменных процессов в такой внутренней системе, как кровь человека в условиях ее перенасыщения β-эндорфином.

Нами предварительно были смоделированы модельные композиты (МК) из БТС, обогащенной β-эндорфином в различных концентрациях: 116 м/мл, 132 м/мл, 150 м/мл и 250 м/мл. Выбор концентраций был осуществлен на основании нормального уровня содержания β-эндорфина в сыворотке крови здорового человека - 102 м/мл, в условиях ее перенасыщения β-эндорфином в препарате сыворотки крови человека появлялись оптически активные включения в виде звездчатых сферолитов (агрегатов) и/или их отдельных лучей (Савина Л.В. с соавт. Патент на изобретение. Способ определения гипер-бета-эндорфинемии №21501111. М., 2000).

На фиг.1 приведена структура БТС, представленная субпараллельными полосчатыми агрегатами. При обогащении БТС β-эндорфином в определенных концентрациях (16, 132, 150, 250 м/мл), фиг.2а, б, в, г, видны радиально-лучевые и лотосообразные сферолиты.

На фиг.3 приведены радиально-лучевые сферолиты, полученные при помещении β-эндорфина, концентрация которого - 150 м/мл, на стеклянную пластину, которую по периферии окружили валом из БТС, последняя «считала» информацию с β-эндорфина и передала ее в виде радиально-лучевых сферолитов (микроскопия в поляризованном свете с КК).

Исследования подкреплены 350 экспериментами.

Пример 1, фиг.4. Б-ой Г., 40 лет, история болезни (ИБ) №1251. DS: остеохондроз поясничного отдела позвоночника с болевым синдромом. Принимает лечение акупунктурой. На фиг.4 приведена структура БТС спустя 10 мин после сеанса акупунктуры. Виден радиально-лучевой сферолит - подтверждение наличия гипер-бета-эндорфинии.

Технология: На покровное стекло размером 2×2 см нанесли 0,02 мл БТС в виде дорожки, поместили его на зону проекции пульса, выдержали 5 мин, высушили в термостате при Т=+18°С на протяжении 2 мин, исследовали в поляризованном свете с КК, и в структуре БТС обнаружили радиально-лучевой сферолит. Одновременно в сыворотке крови (СК) определили уровень β-эндорфинов, который оказался повышен - 150 м/мл (норма - 102 м/мл). Гипер-бета-эндорфиния подтвердилась.

Пример 2, фиг.5. Б-ная Н., 38 лет, ИБ №495. DS: инфаркт миокарда, острый период. На фиг.5 приведена структура БТС, виден лотосовидный сферолит.

Технология: На покровное стекло размером 2×2 см нанесли тарированной пипеткой 0,01 мл БТС в виде дорожки, поместили его на зону проекции пульса, выдержали 4 мин, высушили в термостате при Т=+19°С на протяжении 3 мин, исследовали в поляризованном свете с КК и в структуре БТС был лотосовидный сферолит. Одновременно в СК определили уровень β-эндорфинов, который был повышен - 220 м/мл. Гипер-бета-эндорфиния подтвердилась.

Пример 3, фиг.6. Б-ой С., 42 лет. DS: Церебральное гипоталамическое ожирение IV ст. ИБ №218. На фиг.6 приведена структура БТС, присутствуют радиально-лучевые сферолиты.

Технология: На покровное стекло размером 2×2 см нанесли в виде дорожки 0,02 мл БТС, поместили на зону проекции пульса, выдержали 5 мин, высушили в термостате на протяжении 2 мин при Т=+20°С. Исследовали препарат в поляризованном свете с КК. Присутствуют радиально-лучевые сферолиты. Одновременно в СК определили содержание β-эндорфинов, оно было повышено - 140 м/мл. Гипер-бета-эндорфиния подтвердилась.

Пример 4, фиг.7. Б-ная З., 38 лет. DS: Язвенная болезнь ДПК с выраженным болевым синдромом. ИБ №4812. На фиг.7 приведена структура БТС, найден лотосовидный сферолит.

Технология: На покровное стекло размером 2×2 см в виде дорожки нанесли 0,02 мл БТС, поместили его на зону проекции пульса и выдержали 5 мин. Пробу высушили в термостате при Т=+20°С на протяжении 2 мин, затем изучили в поляризованном свете с КК. Найден лотосовидный сферолит. Одновременно в СК определили концентрацию β-эндорфина, которая равнялась 195 м/мл (норма - 102 м/мл). Гипер-бета-эндорфиния подтвердилась.

Пример 5, фиг.8. Б-ой И., 53 лет. ИБ №576. DS: Ишемический инсульт в вертебробазилярном бассейне справа. На фиг.8 присутствуют радиально-лучевые сферолиты.

Технология: На покровное стекло размером 2×2 см нанесли 0,02 мл БТС в виде дорожки, поместили на зону проекции пульса, на протяжении 5 мин высушили в термостате при Т=+18°С, изучили в поляризованном свете с КК. Найдены радиально-лучевые сферолиты. Одновременно в СК определили уровень β-эндорфинов, он оказался повышен - 212 м/мл. Гипер-бета-эндорфиния подтвердилась.

Пример 6, фиг.9. Б-ная К., 48 лет. ИБ №7191. DS: О. панкреатит, выраженный панкренекроз, болевой синдром. На фиг.9 приведена структура БТС, присутствует лотосовидный сферолит.

Технология: На покровное стекло размером 2×2 см нанесли в виде дорожки 0,02 мл БТС, выдержали на пульсе 4 мин, затем высушили в термостате при Т=+20°С на протяжении 2 мин и изучили в поляризованном свете с КК. Присутствует лотосовидный сферолит. Одновременно в СК определили уровень β-эндорфинов, который был повышен - 195 м/мл. Гипер-бета-эндорфиния подтвердилась.

Преимущества предлагаемого способа:

- применение высокочувствительного биологического индикатора, реагирующего на излучение пульса;

- способность индикатора (БТС) «считывать» селективно течение обменных процессов, протекающих в крови;

- обеспечение визуального контроля за выбросом в кровь β-эндорфинов;

- неинвазивность предлагаемого способа;

- отсутствие применения дорогостоящего технического оборудования - экономическая выгода;

- сокращение стоимости по сравнению с прототипом способа определения гипер-бета-эндорфинии;

- сокращение времени исследования в 15 раз.

Изобретение относится к области медицины, биологии, нейрофизиологии и может быть использовано для диагностики гипер-бета-эндорфинии в организме человека. Проводят приготовление биологического индикатора (БТС) и регистрацию излучения пульса человека. На зону проекции пульса человека помещают покровное стекло, на которое наносят БТС, состоящую из композиции 0,1% водного раствора аминокислот, взятых в равных пропорциях: аспарагиновая, аланин, валин, серин, глицин, тирозин, глютаминовая, треонин, 0,5% водного раствора дофамина, 0,5% водного раствора гистамина, 12% водного раствора сернокислой магнезии в соотношении 3:2:1:4, стекло выдерживают на пульсе 4-5 мин, затем препарат сушат при Т=+(18-20)°С на протяжении 2-3 мин, исследуют в поляризованном свете с кварцевым компенсатором, и при наличии в пробе сферолитов - радиально-лучевых и/или лотосовидных определяют гипер-бета-эндорфинию. Способ прост в использовании, высокоинформативен, экономически выгоден. 9 ил.

Способ экспресс-определения гипер-бета-эндорфинии в организме человека, характеризующийся тем, что экспресс-определение проводят путем сканирования пульса, при этом на зону проекции пульса человека помещают покровное стекло, на которое нанесена биологическая тест-система, состоящая из композиции 0,1%-ного водного раствора аминокислот, взятых в равных пропорциях: аспарагиновая, аланин, валин, серин, глицин, тирозин, глютаминовая, треонин, 0,5%-ного водного раствора дофамина, 0,5%-ного водного раствора гистамина, 12%-ного водного раствора сернокислой магнезии в соотношении 3:2:1:4, стекло выдерживают на пульсе 4-5 мин, затем препарат сушат при Т=18-20°С на протяжении 2-3 мин, исследуют в поляризованном свете с кварцевым компенсатором и при наличии в пробе сферолитов - радиально-лучевых и/или лотосовидных определяют гипер-бета-эндорфинию.