СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГИПЕРГИСТАМИНЕМИИ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, биологии, физиологии, биохимии и может быть использовано в целях ранней диагностики различных патологических состояний, сопровождающихся выбросом гистамина.

Гистамин (Г) - тканевой гормон и медиатор, фармакологический препарат, стимулятор и ингибитор тканевых и органных превращений (И.Л.Вайсфельд, Г.Н. Кассиль. Гистамин в биохимии и физиологии. М., 1981). Молекула Г имеет кристаллическую структуру. Общепризнанна роль Г в возникновении аллергии, коллапса, шока, воспалительных процессов. Гистамин стимулирует гипофизарно-надпочечниковую систему, вызывая процесс возбуждения в различных структурах мозга, способствует секреции адренокортикотропного гормона. Гистамин регулирует микроциркуляцию. Обмен Г включается в единую нейро-гуморально-гормонально-барьерную систему регуляции функций в организме.

Явление гипергистаминемии клинически проявляется симптомами аллергии, крапивницы, вазомоторного ринита, астмы, коллапсом.

Гистамин определяют в тканях, жидких средах и выделениях организма. Способы его определения совершенствовались в разных направлениях:
- биологическом;
- химическом;
- физико-химическом;
- радио-иммуноферментном (И.С.Вайсфельд, Г.Н.Кассиль. Гистамин в биологии и физиологии. М., 1981).

- Биологический способ (см. там же) - используют влияние Г на уровень кровяного давления кошек, собак, на сократительную способность гладкой мускулатуры, способность вызывать бронхоспазм.

Недостатки этого способа связаны с использованием материалов животных, различных технических установок.

- Химический способ (см. там же) - основан на реакции Г со щелочным раствором диазотированной сульфаниловой кислоты (реакция Паули).

Недостаток способа заключается в применении химических реактивов, искажающих нативность исследований, снижение специфичности.

- Радио-иммуноферментный способ (см. там же) - основан на метилировании тканевого гистамина в присутствии гистамин-метилтрансферазы и меченого С¹⁴.

Недостаток способа - в применении изотопа и сложной технической установки.

- Физико-химические способы:
- флюорометрический и жидкостной хроматографии (С.А.Мещерякова. Флюорометрический метод определения гистамина в крови и тканях. Журнал Лабораторное дело, 1971, 2, с.103-105; С.Б.Ахмеджанова и соавт. Определение гистамина и серотонина в цельной крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Журнал Лабораторное дело, 1991, 11,с.10-13).

Флюорометрический способ (см. там же) - основан на реакции конденсации гистамина с ортофталевым альдегидом, в результате которой образуется сильно флюоресцирующее соединение.

Недостатки флюорометрического способа:
- неспецифичность;
- наличие компонентов, мешающих анализу;
- трудоемкость;
- многостадийность;
- строгое соблюдение рН;
- использование дефицитных реактивов;
- дорогостоящее оборудование
В основе способа жидкостной хроматографии (см. там же) лежит разделение аминов способом ионо-обменной или обращено-фазовой жидкостной хроматографии с послеколоночной дериватизацией O-фталевым диальдегидом с последующим флюорометрическим детектированием. Недостатки:
- большой расход реагентов;
- потеря нативности исследуемого объекта;
- сложное оборудование.

В качестве прототипа использован способ определения гистамина в плазме крови (В. К. Смирнова. Л.К.Сирина. Об определении гистамина в плазме крови. Журнал Лабораторное дело, 1977, 9, с.546-548).

В основе способа лежит модифицированный флюорометрический способ определения гистамина в плазме, крови, тканях (С.А.Мещерякова. Флюорометрический метод определения гистамина в крови и тканях. Журнал Лабораторное дело 1971, 2, с. 103).

Способ осуществляется следующим образом:
- Гистамин исследуют в плазме, с целью предотвращения его выхода из форменных элементов крови, все пробирки и пипетки, используемые в опыте до осаждения белка, силиконируют 2% раствором ГКЖ-94 в толуоле с последующим высушиванием при Т=120-180^oС в течение 2 ч.

- Кровь в количестве 14-18 мл берут из локтевой вены в силиконированную пробирку, содержавшую 1 каплю гепарина, осторожно перемешивают, центрифугируют 20 мин при 1000 об/мин 4^oС.

- Полученную плазму переносят в полиэтиленовый стаканчик и повторно центрифугируют в течение 5 мин при 12000 об/мин и 4^oС для осаждения тромбоцитов.

- К 4-5 мл плазмы добавляют 1/2 объема 2 н. НСlO₄, перемешивают, центрифугируют в течение 15 мин при 3000 об/мин и 4^oС.

- Надосадок смывают, доводят его объем до 5 мл и используют для определения гистамина.

- Затем готовят калибровочный раствор гистамииа - 3 калибровочные пробы.

- Интенсивность флюоресценции измеряют на спектрофлюориметре при длинах волн 360-450 нм, щель 6/18, чувствительность 10, фильтр 43.

- Строят графики и производят расчет. Недостатки способа:
- трудоемкость подготовки пробы;
- неоднократное центрифугирование пробы, что изменяет нативность препарата;
- использование реактивов;
- применение флуориметра (техническое оборудование);
- дороговизна исследования.

Все вышеизложенное затрудняет диагностику гипергистаминемии.

Задачи предполагаемого изобретения:
- Повышение достоверности контроля за выбросом гистамина в организме человека
- Повышение информативности
- Упрощение и дешевизна способа
- Экспресс-диагностика гипергистаминемии, обусловленной патологическими состояниями человека
- Упрощение способа приготовления пробы
Сущность изобретения заключается в том, что для диагностики гипергистаминемии сыворотку крови наносят на предметное стекло, накрывают покровным, сушат при Т=37-38^oС, выдерживают на открытом воздухе 2-2,5 ч, затем исследуют в поляризованном свете с кварцевым компенсатором и при наличии в сыворотке крови кристаллов: перистых дендритов и/или незавершенных перистых сферолитов, завершенных перистых сферолитов диагностируют гипергистамииемию.

Способ осуществляют следующим образом:
1. Для забора берут периферическую кровь - из пальца, для чего скарификатором наносят повреждение в области пальца руки человека.

2. Капилляром Панченкова набирают кровь 0,06-0,1 мл.

3. Полученный объем центрифугируют для получения сыворотки.

4. Сыворотку в виде капель объемом 0,01-0,02 мл каждая наносят тарированной пипеткой на предметное стекло и накрывают покровным стеклом.

5. Высушивают в термостате при Т=37-38^oС на протяжении 1-1,5 ч.

6. Выдерживают на открытом воздухе 2-2,5 ч.

Под микроскопом в поляризованном свете с кварцевым компенсатором изучают картину кристаллизации и при наличии в препарате кристаллов в виде перистых дендритов и/или незавершенных перистых сферолитов, завершенных перистых сферолитов диагностируют гипергистаминемию.

Нами предварительно были приготовлены модельные компоненты в виде кристаллограмм (КГ) из водного раствора гистамина и из сыворотки крови здорового человека, обогащенной гистамином.

На фиг.1 а, б представлены КГ гистамина:
а - завершенный радиально-лучевой сферолит (содержание гистамина 800 нмоль/л);
б - незавершенные радиально-лучевые сферолиты, лучи (концентрация гистамина- 650 нмоль/л).

На фиг. 2 а, б представлены эталоны смеси сыворотки крови здорового человека, обогащенной гистамином. Кристаллограммы выполнены перистыми дендритами (а - концентрация гистамина 650 нмоль/л) и незавершенным перистым сферолитом (б - концентрация гистамина 71 нмоль/л).

Апробация способа подтверждена на 264 больных.

ПРИМЕРЫ
Пример 1, фиг.3: Б-й Л., история болезни (ИБ) 1075. Диагноз (д-з): астма аллергическая. На фиг.3 приведена КГ сыворотки крови, видны перистые дендриты.

Технология: из пальца капилляром Панченкова взято 0,06 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК объемом 0,01 мл нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом. Препарат высушили в термостате при Т= 37^oС на протяжении 1 ч, затем выдержали его на открытом воздухе 2,5 ч и микроскопировали в поляризованном свете (поляризационный микроскоп) с кварцевым компенсатором. В пробе найдены перистые дендриты.

Одновременно определяли уровень гистамина флуорометрическим способом, который оказался повышен - 570 нмоль/л, при норме - 546±61,85 нмоль/л. Выброс гистамина подтвержден.

Пример 2, фиг. 4. Б-ная О. , ИБ 213. Д-з: гиперфункция надпочечника (глюкостерома). На фиг.4 приведена КГ сыворотки крови, присутствуют перистый дендрит и незавершенный сферолит.

Технология: из пальца капилляром Панченкова взято 0,08 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК объемом 0,02 мл каждая нанесли на предметное стекло, накрыли покровными стеклами. Образец высушили в термостате при Т= 38^oС на протяжении 1,5 ч, затем выдержали на открытом воздухе 2,5 ч и изучили в поляризованном свете с кварцевым компенсатором. Видны перистый дендрит и незавершенный перистый сферолит.

Одновременно в СК определяли уровень гистамина, который оказался повышен и составил 615 нмоль/л. Выброс гистамина подтвержден.

Пример 3, фиг.5. Б-й Щ., ИБ 745. Д-з: язвенная болезнь желудка, рецидив. На фиг.5 присутствует завершенный перистый сферолит.

Технология: из пальца капилляром Панченкова взято 0,1 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК объемом 0,02 мл каждая нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при Т=38^oС на протяжении 1 ч. Образец выдержали на открытом воздухе 2 ч, затем микроскопировали в поляризованном свете с кварцевым компенсатором. Найдены завершенные перистые сферолиты. В СК определили высокий уровень гистамина - 615 нмоль/л. Выброс гистамина подтвердился.

Пример 4, фиг.6. Б-й Ж., ИБ 2000. Д-з: инфаркт миокарда, острый период. На фиг.6 приведена КГ сыворотки крови, присутствуют перистые дендриты.

Технология: из пальца капилляром Панченкова взято 0,07 мл крови, она отцентрифугирована. Капли СК объемом 0,01 мл каждая нанесли на предметное стекло, накрыли покровными стеклами. Образец высушили в термостате при Т = 37^oС на протяжении 1 ч, затем выдержали на открытом воздухе 2 ч и изучили в поляризационном микроскопе с кварцевым компенсатором. Найдены перистые дендриты. Одновременно в СК определили уровень гистамина, который оказался повышен и составил 649 нмоль/л. Выброс гистамина подтвердился.

Пример 5, фиг. 7. Б-й Г., ИБ 795. Д-з: анафилактический шок. На фиг.7 приведена КГ сыворотки крови, присутствует завершенный перистый сферолит.

Технология: из пальца капилляром Панченкова взято 0,1 мл крови, она отцентрифугирована. Капли СК объемом 0,02 мл каждая нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при Т=37^oС на протяжении 1 ч, затем выдержали на открытом воздухе 2,5 ч, и изучили в поляризованном свете с кварцевым компенсатором. Виден завершенный перистый сферолит. Одномоментно в СК определили уровень гистамина, который оказался повышен и составил 639 нмоль/л. Гипергистаминемия подтвердилась.

Пример 6, фиг.8. Б-й У., ИБ 1116. Д-з: крапивница. На фиг.8 приведена КГ сыворотки крови, присутствует перистый дендрит.

Технология: из пальца капилляром Панченкова взято 0,08 мл крови, она отцентрифугирована. Капли СК объемом 0,01 мл каждая нанесли на предметное стекло, накрыли каждую покровным стеклом и высушили в термостате при Т=38^oС на протяжении 1 ч, затем выдержали на открытом воздухе 2 ч и микроскопировали в поляризованном свете с кварцевым компенсатором. Виден перистый дендрит. Одновременно в СК определили уровень гистамина, который оказался повышен и составил 574 нмоль/л. Гипергистаминемия подтвердилась.

Пример 7, фиг.9. Б-я Ч., ИБ 110. Д-з: поливалентная аллергия. На фиг.9 приведена КГ сыворотки крови, виден завершенный перистый сферолит.

Технология: из пальца капилляром Панченкова взято 0,06 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК объемом 0,01 мл каждая нанесли на предметное стекло, накрыли покровными стеклами. Препарат высушили в термостате при Т= 38^oС на протяжении 1,5 ч, затем выдержали на открытом воздухе 2 ч и изучили в поляризованном свете с кварцевым компенсатором. Обнаружены завершенные перистые сферолиты. Одновременно в СК определили уровень гистамина, который оказался повышен и составил 680 нмоль/л. Выброс гистамина подтвердился.

Пример 8, фиг. 10. Б-я Б., ИБ 2109. Д-з: климактерический синдром, менопауза. На фиг.10 приведены перистые дендриты (КГ сыворотки крови).

Технология: из пальца капилляром Панченкова взято 0,08 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК объемом 0,01 мл каждая нанесли на предметное стекло, накрыли покровными стеклами и высушили в термостате при Т=38^oС на протяжении 1,5 ч, затем выдержали на открытом воздухе 2,5 ч и изучили в поляризованном свете с кварцевым компенсатором. Видны перистые сферолиты. В СК определили уровень гистамина, который оказался повышен - 698 нмоль/л. Гипергистаминемия подтвердилась.

Пример 9, фиг.11. Б-й Ю., ИБ 136. Д-з: отек Квинке. На фиг.11 приведена КГ сыворотки крови б-го Ю., присутствуют перистые дендриты.

Технология: из пальца капилляром Панченкова взято 0,1 мл крови, она отцентрифугирована. Капли СК объемом 0,01 мл каждая нанесли на предметное стекло и каждую накрыли покровным стеклом. Образец высушили в термостате при Т= 37^oС на протяжении 1,5 ч и выдержали на открытом воздухе 2 ч. Изучили в поляризованном свете с кварцевым компенсатором. Видны перистые дендриты. Одновременно в СК определили уровень гистамина, который оказался повышен и составил 701 нмоль/л. Гипергистаминемия подтвердилась.

Преимуществами предлагаемого способа являются:
- Упрощение операции подготовки биологического материала для исследования
- Отсутствие применения сложных химических реактивов и технических устройств
- Экономическая выгода
- Достоверность полученных результатов
- Возможность экспресс-диагностикия

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Сущность изобретения: сыворотку крови наносят на предметное стекло, накрывают покровным, сушат при Т=37-38^oС, выдерживают на открытом воздухе 2-2,5 ч, затем исследуют в поляризованном свете с кварцевым компенсатором и при наличии в сыворотке крови кристаллов: перистых дендритов и/или незавершенных перистых сферолитов, завершенных перистых сферолитов диагностируют гипергистаминемию. Способ обеспечивает высокую достоверность диагностики при отсутствии применения сложных химических реактивов и технических устройств. 11 ил.

Способ диагностики гипергистаминемии путем исследования сыворотки крови, отличающийся тем, что сыворотку крови наносят на предметное стекло, накрывают покровным, сушат при Т=+37-38°С, выдерживают на открытом воздухе 2-2,5 ч, затем исследуют в поляризованном свете с кварцевым компенсатором и при наличии в сыворотке крови кристаллов - перистых дендритов и/или незавершенных перистых сферолитов, завершенных перистых сферолитов - диагностируют гипергистаминемию.