СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИПЕР-БЕТА-ЭНДОРФИНЕМИИ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/48 G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, нейрофизиологии, биологии и лабораторной диагностике.

Опиоидные пептиды мозга (эндорфины и энкефалины) - новый класс биоорганических соединений, эндогенные опиоиды - особая группа нейромедиаторов, обладающая морфиноподобным действием, регулирующая деятельность ЦНС, эндокринной системы, желудочно-кишечного тракта. Она обладает, в первую очередь, анальгетическим эффектом, что используется в механизмах реализации терапевтических обезболивающих воздействий, в способах рефлексотерапии. Наиболее активными являются эндорфины (Эндорфины. М., 1981 г.).

Доказана роль гиперэндорфинемии в генезе психических и неврологических расстройств, в происхождении опухолей головного мозга, гипофиза, гипоталамуса, кишечника, в пристрастии к наркотикам (E.О.Брагин. Нейрохимические механизмы регуляции болевой чувствительности. М., 1991; Л.В. Калюжный. Физиологические механизмы регуляции болевой чувствительности. М., 1984; М.И. Балаболкин. Эндокринология. М., 1998).

Выброс эндорфинов происходит из глубинных структур мозга, из спинномозговой жидкости, кишечника.

Известны способы оценки опиатной, эндорфинной систем после электростимуляции головного мозга, кишечника, акупунктуры, при психических и эндокринных заболеваниях, электроакупунктуры, которые заключаются в определении уровня эндорфинов в головном мозге, спинномозговой жидкости, в ткани кишечника, в плазме, сыворотке крови, в мозге (Терениус Л.; Померанц Б; М.Вюстер; Лот П. , Р.Шульц в кн. Эндорфины. М.,1981, 309-325, 344-349, Л.В. Калюжный. Физиологические механизмы регуляции болевой чувствительности. М., 1984. С. 70-71, 170-171, 176-177,153-178).

Определение уровня эндорфинов в биологических тканях и жидкостях осуществляют способом жидкостной хроматографии, радиоиммунологическим и радиорецепторным тестами (Д.Мик, Т.Бохан. Использование жидкостной хроматографии под высоким давлением для изучения энкефалинов. В кн: Эндорфины. М., 1981. C. 148-154; Акил X. с соавт.: Биохимическое, фармакологическое и аналитическое исследование. В кн. Эндорфины. М., 1981. С. 131-142; Шварц с соав. Содержание эндорфинов в стриатуме, определяемое радиорецепторным и радиоиммунологическим методами: в кн. Эндорфины. М., 1981. С. 248-253; Вюстер М., П. Лот, Р. Шульц. Характеристика опиатоподобных соединений в крови и моче. В кн. Эндорфины. М. , 1981, с. 308-314), В.Н. Славнов, Г.В. Валуева, E.B.Эпштейн и др. Радиоиммунологическое определение β-эндорфина и β- липотропина в крови. Журнал "Медицинская радиология", 1982, N 4, с. 45-49.

Главные этапы определения эндорфинов заключаются в экстрагировании эндорфинов из тканей и биологических жидкостей и сочетании процедуры экстракции с радиорецепторным и радиоиммунологическим методом.

Основные этапы определения опиатов (эндорфинов) хроматографическим способом
1. Подготовка проб, содержащих опиаты путем их экстракции органическими растворителями.

2. Очистка пробы с последующим растворением остатка в растворителе или подвижной фазе.

3. Расчет параметров градуированной характеристики, калибровка колонки.

4. Определение количества элюирующих соединений с использованием детекторов.

5. Помещение в хроматограф, разделение в его системе.

6. Математические расчеты.

Недостатки способа
1. Трудоемкое извлечение опиатов из биоматериала при помощи экстрагируемых веществ, что нарушает их нативность.

2. Применение различных способов очистки пробы.

3. Использование сложного устройства в виде хроматографа.

4. Высокие материальные затраты.

Все вышеизложенное затрудняет широкое применение способа хроматографии.

Радиорецепторное тестирование
Основано на конкуренции эндорфинов с H₃- опиатами за связывание с мембранами мозга. Для этого используют препараты из тканевых экстрактов и меченые лиганды H₃ - мет-энкефалинов, что затрудняет широкое использование теста в оценке контроля стимуляции опиатной системы при лечении методами рефлексотерапии.

Основным методом исследования β- эндорфинов является радиоиммунологический. Но определение содержания β- эндорфинов этим методом сопряжено со значительными трудностями, обусловленными 100%-ным перекрестным связыванием специфических антител с β- эндорфином и β- липотропином.

Кроме того, меченый β- эндорфин, использующийся при радиоиммунологическом определении, в значительном количестве связывается с белками крови, что сдвигает равновесие в радиоиммунологической системе и искажает конечные результаты.

В качестве прототипа для определения в сыворотке крови нами использовано радиоиммунологическое определение - β- эндорфина в крови. (В.Н.Славнов, Г.В. Валуева, E. B.Эпштейн, E.B.Лучицкий, А.А.Яковлев. Радиоиммунологическое определение - эндорфина и β- липотропина в крови. В жур. "Медицинская радиология", 1982, N 4, с. 45-49).

Основные этапы метода
1. Экстракция β- эндорфина:
а) приготовление комплекса сефароза - антитела для β- эндорфина;
б) смешивание плазмы с суспензией сефароза - антитела;
в) встряхивание суспензии с плазмой в течение 2 ч при комнатной температуре;
г) отмывание комплекса плазма - сефароза - антитела 0,01М боратным буфером, содержащим 0,1% альбумина на бычьей сыворотке и трилон Б.

2. Элюирование гормонов:
а) добавление к осадку, содержащему нейропептиды, 0,1 М уксусной кислоты, центрифугирование и фильтрация через пластиковые колонки со стекловатой:
б) элюирование гормонов 0,001 М соляной кислотой и дважды 0,1 М соляной кислотой, фильтрация через пластиковые колонки к первоначальным фильтрам.

Лиофилизация фильтрата. Растворение высушенных элюатов 0,1% боратным буфером с 0,1% альбумином на бычьей сыворотке.

3. Отделение β- липотропина от β- эндорфина в полученных растворенных сухих остатках с помощью сефарозы с антителами для β- липотропина:
а) приготовление комплекса сефароза - антитела для β- липотропина: смешивание части элюата с комплексом сефароза - антитела для β- липотропина и встряхивание в течение 4 ч при комнатной температуре;
б) центрифугирование и определение супернатанта, содержащего β- эндорфин.

4. Определение с помощью радиоиммунологических наборов в растворенных сухих остатках содержания β- эндорфина и β- липотропина и в супернатанте, полученном после разделения нейропептидов. Только β- эндорфина.

При окончательном расчете содержания β- липотропина получали следующим образом (β- эндорфин + β- липотропин) - эндорфин.

Недостатки способа
1. Наличие экстракционных наборов из жидкостей.

2. Сложность экстракции β- эндорфина и его отделение от β- липотропина.

3. Элюирование гормонов и лиофилизация фильтрата.

4. Нарушение нативных свойств плазмы (сыворотки) и опиатов.

5. Наличие радиоиммунологических наборов, дорогостоящих.

6. Длительный этап определения содержания β- эндорфинов (свыше 6 часов).

Все вышеизложенное затрудняет определение β- эндорфинов.

Цель предлагаемого изобретения
1. Повышение достоверности показателей контроля за стимуляцией эндорфинной системы.

2. Повышение информационности.

3. Упрощение способа, его дешевизна.

4. Экспресс-диагностика активации эндогенной опиатной системы (выброс β- эндорфинов).

Задачи
1. Упростить способ приготовления пробы.

2. Изучить кристаллограммы сыворотки крови по картине специфической кристаллизации за счет повышения уровня эндогенных опиатов ( β- эндорфинов).

3. Изучить интенсивность выброса эндорфинов при различных состояниях организма человека.

Сущность изобретения заключается в том, что для определения гипер-β-эндорфинемии сыворотку крови наносят на предметное стекло, накрывают покровным, сушат при 37-38^oC на протяжении 1,5 - 2 ч, выдерживают на открытом воздухе 1,5 - 2 ч, затем исследуют в поляризованном свете и при наличии в препарате кристаллов - зерен, лучей и/или звездчатых агрегатов пестрой окраски определяют гипер-β- эндорфинемию.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Для забора берут периферическую кровь - из пальца. Для чего скарификатором наносят повреждение в области пальца руки человека.

2. Капилляром Панченкова набирают кровь 0,06 - 0,1 мл.

3. Полученный объем центрифугируют для получения сыворотки.

4. Сыворотку в виде капель объемом 0,01 - 0,02 мл каждая наносят тарированной пипеткой на предметное стекло и накрывают покровным стеклом.

5. Высушивают в термостате при 37-38^oC на протяжении 1,5 - 2 ч.

6. Выдерживают на открытом воздухе 1,5 - 2 ч.

Под микроскопом в поляризованном свете изучают картину кристаллизации и при наличии в препарате кристаллов в виде отдельных зерен, лучей и/или звездчатых агрегатов пестрой окраски диагностируют присутствие эндогенных опиатов β- эндорфинов и тем самым оценивают наличие гипер-β-эндорфинемии (пересыщение сыворотки крови β-эндорфинами).

Нами предварительно были смоделированы эталоны - кристаллограммы, приготовленные из сыворотки крови здорового человека, обогащенной β- эндорфинами.

На фиг. 1 представлены КГ (кристаллограммы) сыворотки крови здорового человека и КГ β- эндорфинов, выполненные отдельными зернами, лучами, звездчатыми агрегатами пестрой окраски.

На фиг. 2 представлены эталоны смеси сыворотки крови здорового человека, обогащенной, β-эндорфинами, кристаллограммы (КГ) выполнены отдельными зернами, лучами, звездчатыми лучами пестрой окраски.

Экспериментальные исследования подтверждены 2500 наблюдениями.

Примеры
Пример 1, фиг. 3. Б-ой И. 39 лет, N истории болезни 1351. Д-з: Остеохондроз поясничного отдела позвоночника с болевым синдромом. Принимает лечение акупунктурой. На фиг. 3 приведена кристаллограмма (КГ) сыворотки крови (СК) спустя 10 мин после сеанса акупунктуры. Присутствует звездчатый агрегат пестрой окраски.

Технология: После сеанса акупунктуры из пальца капилляром Панченкова взята кровь - 0,06 мл, отцентрифугирована. Капли СК объемом 0,01 мл нанесены на предметное стекло (4 капли), каждая накрыта покровным стеклом. Препарат поместили в термостат и подвергли сушке на протяжение 1,5 ч, при 37^oC, затем выдержали его на открытом воздухе 2 ч и исследовали в поляризованном свете (микроскоп поляризационный).

В пробе обнаружили звездчатый агрегат пестрой окраски, что указывает на выброс β- эндорфинов. Одновременно произведено определение уровня β- эндорфинов радиоиммунологическим способом. Уровень β- эндорфинов в СК равен 113 m/мл, при норме 102 m/мл, выброс β- эндорфинов после акупунктуры подтвердился.

Пример 2, фиг. 4. Б-ой К., 43 лет. Д-з: Остаточные явления травмы головного мозга. На фиг. 4 приведена КГ сыворотки крови, присутствуют отдельные зерна β- эндорфинов.

Технология: при поступлении в стационар из пальца руки капилляром Панченкова взята кровь - 0,08 мл, отцентрифугирована. Капли СК объемом 0,02 мл нанесены на предметное стекло, каждая накрыта покровным стеклом. Пробу поместили в термостат для сушки на 2 ч при 38^oC, затем выдержали его на открытом воздухе 1,5 ч и исследовали в поляризованном свете. Обнаружены отдельные зерна пестрой окраски. Одновременно в СК определили уровень β- эндорфинов, который оказался повышенным - 10 m/мл, при норме 102 m/мл. Выброс β- эндорфинов подтвердился.

Пример 3, фиг. 5. Б-ой Б., 27 лет, N истории болезни 1116. Д-з: Язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, принимает лечение лазером. На фиг. 5 приведена КГ СК спустя 10 мин после сеанса лазерной терапии. Присутствуют зерна, лучи, звездчатые агрегаты пестрой окраски.

Технология: после сеанса лазерной терапии, спустя 10 мин из пальца капилляром Панченкова взята кровь - 0,1 мл, отцентрифугирована. Капли СК объемом 0,01 мл каждая (5) нанесены на предметное стекло, каждая накрыта покровным стеклом. Препарат поместили в термостат на 1,5 ч при 37^oC, затем выдержали на открытом воздухе 2 часа и исследовали в поляризованном свете. Найдены зерна, лучи и звездчатые агрегаты пестрой окраски. Одновременно произведено определение уровня β- эндорфинов в СК, уровень их оказался повышенным спустя 10 мин после лазерной терапии и составил - 148 m/мл, при норме 102 m/мл, выброс β- эндорфинов подтвердился.

Пример 4, фиг. 6. Б-ая М., 36 лет, N истории болезни 2314. Д-з: Болезнь Иценко - Кушинга. Поступила в эндокринологическое отделение. На фиг. 6 приведена КГ СК, полученная при поступлении больной. Присутствуют зерна и звездчатые агрегаты пестрой окраски.

Технология: при поступлении больной из пальца капилляром Панченкова взята кровь - 0,08 мл, отцентрифугирована. Капли СК объемом 0,02 мл каждая (4) нанесены на предметное стекло, каждая накрыта покровным стеклом. Пробу поместили в термостат на 2 ч при 37^oC, затем выдержали на открытом воздухе 1,5 ч и исследовали в поляризованном свете. Найдены отдельные зерна и звездчатые агрегаты пестрой окраски. Одномоментно определяли уровень β- эндорфинов, который составил - 135 m/мл, что свидетельствовало о выбросе β- эндорфинов у больной М. в момент поступления, (гипер-β-эндорфинемия).

Пример 5, фиг. 7. Б-ая П., 16 лет, N истории болезни 2139. Д-з: Аденома гипофиза. На фиг. 6 приведена КГ СК при поступлении в эндокринологическое отделение. Присутствуют звездчатые агрегаты пестрой окраски,
Технология: при поступлении больной в отделение из пальца взята кровь капилляром Панченкова - 0,07 мл, отцентрифугирована. Капли СК (3) объемом 0,01 мл каждая нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом и поместили в термостат на 1,5 ч при 38^oC. Затем выдержали на открытом воздухе 2 ч и подвергли микроскопированию в поляризованном свете. Найдены звездчатые агрегаты пестрой окраски. Одномоментно в СК определяли уровень β- эндорфинов, который оказался повышенным - 116 m/мл, гипер-β-эндорфинемия, обусловленная аденомой гипофиза, подтвердилась.

Пример 6, фиг. 8. Б-ая С., 41 год, N истории болезни 1141. Д-з: Ожирение III ст, гипоталямического происхождения. На фиг. 8 приведена КГ СК, приготовленная при поступлении больной в эндокринологическое отделение. Присутствуют зерна, лучи и реликтовые звездчатые агрегаты пестрой окраски.

Технология: Из пальца взята кровь капилляром Панченкова - 0,1 мл, отцентрифугирована. Капли СК (4) объемом 0,02 мл каждая нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом и высушили в термостате на 1,5 ч при 37^oC на протяжении 1,5 ч. Затем препарат выдержали на открытом воздухе 2 часа и подвергли исследованию в поляризованном свете. Найдены зерна, лучи и звездчатые агрегаты пестрой окраски. Одновременно в СК определили уровень β-эндорфинов, который оказался повышенным - 132 m/мл. Гипер-β-эндорфинемия, обусловленная болезнью - ожирением, подтвердилась.

Преимущества предлагаемого способа
1. Упрощение операции подготовки биологического материала для исследования.

2. Отсутствие применения сложных химических веществ для экстракции β- эндорфина.

3. Отсутствие радиоиммунологических наборов для определения β-эндорфина.

4. Экономическая выгода.

Предлагаемый способ апробирован в клинических условиях - свыше 2500 примеров.

Выделены образцы - модель ин витро для наблюдения за функциональным состоянием эндогенной морфиноподобной системой человека.

Картины кристаллизации в СК возникают за счет ее перенасыщения β-эндорфинами.

Медико-социальный эффект
Применение способа позволяет повысить достоверность полученных результатов, значительно снизить трудозатраты, упростить способ определения гипер-β-эндорфинемии, роводить экспресс-диагностику.

Способ может быть использован в медицине, а именно в лабораторной диагностике. Сыворотку крови наносят на предметное стекло, накрывают покровным, сушат при 37 - 38^oС, выдерживают на открытом воздухе 1,5-2 ч. В поляризованном свете определяют в препарате кристаллы зерен, лучей и/или звездчатые агрегаты пестрой окраски и по их наличию определяют гипер-бета-эндорфинемию. Способ обеспечивает повышение достоверности определения. 8 ил.

Способ определения гипер-β-эндорфинемии путем исследования сыворотки крови, отличающийся тем, что сыворотку крови наносят на предметное стекло, накрывают покровным, сушат при 37 - 38^oС, выдерживают на открытом воздухе 1,5 - 2 ч, затем в поляризованном свете определяют гипер-β-эндорфинемию по наличию в препарате кристаллов - зерен, лучей и/или звездчатых агрегатов пестрой окраски.